Descriviamo un protocollo per la preparazione di doppi strati lipidici supportati e la sua caratterizzazione utilizzando la microscopia a forza atomica e la spettroscopia a forza.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici
In questo articolo
Sommario
Abstract
La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica di imaging versatile e ad alta risoluzione che consente la visualizzazione delle membrane biologiche. Ha un ingrandimento sufficiente per esaminare le sottostrutture della membrana e persino le singole molecole. L'AFM può fungere da sonda di forza per misurare le interazioni e le proprietà meccaniche delle membrane. I doppi strati lipidici supportati sono convenzionalmente utilizzati come modelli di membrana negli studi AFM. In questo protocollo, dimostriamo come preparare i doppi strati supportati e caratterizzare la loro struttura e le proprietà meccaniche utilizzando l'AFM. Questi includono lo spessore del doppio strato e la forza di sfondamento.
Le informazioni fornite dall'imaging AFM e dalla spettroscopia di forza aiutano a definire le proprietà meccaniche e chimiche delle membrane. Queste proprietà svolgono un ruolo importante nei processi cellulari come il mantenimento dell'emostasi cellulare dallo stress ambientale, l'unione delle proteine di membrana e la stabilizzazione dei complessi proteici.
Introduzione
Atomic Force Microscopy (AFM) genera un'immagine di una superficie di scansione attraverso l'area del campione utilizzando una mensola con una punta molto affilata 1. Il movimento del cantilever sonda la topologia superficiale del campione. AFM è stato ampiamente applicato alle molecole biologiche - come proteine, DNA e membrane, grazie alla sua versatilità nell'analisi campioni fissati in aria o stato quasi native nel liquido 2-5.
Oltre alla sua capacità di imaging ad alta risoluzione in nanometri, il cantilever AFM agisce come una molla per sondare forze di interazione (adesione e repulsione) e le propr....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione di doppi strati lipidici supportati (SLB) 11,12,21
- Preparazione di lipidi miscela e multilamellari vescicole Sospensioni
- Preparare i seguenti buffer in anticipo.
- Preparare tampone PBS a concentrazioni di 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4, e 137 mM NaCl, pH 7,2.
- Preparare SLB (bistrato lipidico supportato) tampone a concentrazioni di NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4.
- Preparare una soluzione di 1 M CaCl 2.
- Sciogliere le seguenti lipidi in cloroformio a una concentrazione desiderata: ad esempio, di-oleoyl-fosf....
- Preparare i seguenti buffer in anticipo.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Doppi strati lipidici supportati composto da DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) sono state visualizzate con AFM (Figura 2 AC). A causa della composizione lipidica, sono stati osservati SM / Chol-ricchi L DOPC ricchi fasi L d oe. Il profilo altezza da immagini AFM può fornire importanti informazioni sulla struttura della membrana. Osservando il profilo altezza, lo spessore doppio strato può essere misurato in presenza di difetti nella membrana (Figura 2B), ovvero la differenza di altezz.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
SLB composti DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) sono formati sulla mica dopo vescicole adsorbimento e rottura indotta da cloruro di calcio. Questa composizione lipidica separato in L d e L o fasi. La fase L o si arricchisce in sfingomielina e colesterolo ed è meno fluido / più viscoso (Figura 1A) che l'L d di fase 11. La separazione di L o di fase L d manifesta come strutture circolari elevata sopra la circostante (Figura 1B,.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society, il tedesco Cancer Research Center, l'Università di Tubinga, e il Bundesministerium für Bildung und Forschung (concessione n. 0.312.040).
Ringraziamo Eduard Hermann per averci aiutato ad automatizzare l'analisi dei dati curva forza e il Dr. Jakob Suckale un'attenta lettura di questo manoscritto.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Viene fornito sotto forma di polvere liofilizzata in fiale sigillate. Sciogliere tutta la polvere in cloroformio al momento dell'apertura. Conservare in eccesso sotto forma di film lipidici essiccati, in atmosfera inerte, a -20 °C. Visita qui per ulteriori informazioni sullo stoccaggio e la movimentazione. |
| Sfingomielina (cervello, suino) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Viene fornito sotto forma di polvere liofilizzata in grandi contenitori di plastica sigillati. Sciogliere una punta di spatola di polvere in polvere nel cloroformio al momento dell'apertura. Conservare in eccesso sotto forma di film lipidici essiccati, in atmosfera inerte, a -20 °C. Visita qui per ulteriori informazioni sullo stoccaggio e la movimentazione. |
| Colesterolo | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Viene fornito come polvere liofilizzata in grandi contenitori di plastica sigillati. Sciogliere una punta di spatola di polvere in polvere nel cloroformio al momento dell'apertura. Conservare in eccesso sotto forma di film lipidici essiccati, in atmosfera inerte, a -20 °C. Visita qui per ulteriori informazioni sullo stoccaggio e la movimentazione. |
| Cloruro di sodio (NaCl), 99,8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Cloruro di potassio (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Idrogenofosfato di sodio (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Diidrogenofosfato di potassio (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Cloruro di calcio diidrato (CaCl2), grado di biologia molecolare | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, grado di biologia molecolare | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Vetrino coprioggetti, 24 x 60 mm, 1 mm di spessore | Duran Group | 2355036 | |
| punzone e matrice Set | di marca di precisione, Inc | 40105 | |
| Adesivo ottico | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Adesivo liquido che si indurisce quando viene polimerizzato sotto la luce UV a lunga lunghezza d'onda. |
| [header] | |||
| Mica blocca | NSC Mica Exports Ltd. | Si tratta di pezzi di mica di almeno 1 pollice quadrato di area e spessore che varia da 0,006 pollici a 0,016 pollici. Vengono tagliati a una dimensione specifica dall'azienda per la spedizione. Piccoli dischi di mica possono essere perforati dai blocchi di mica utilizzando il set di punzoni e matrici. Maneggiare sempre la mica con guanti o pinzette. | |
| Attrezzature da laboratorio Grasso | Piralide Chemie AG | Glisseal N | |
| Estrusore di liposomi | Avestin | LiposoFast-Basic | In alternativa si possono anche guardare le offerte di Northern Lipids, Inc. |
| Nastro adesivo | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1 pollice) | |
| Sonicatore da bagno | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | Nessun riscaldamento, Frequenza: 35 kHz, Uscita di picco ultrasonica: 160 W, Potenza HF: 40 W. (Scheda tecnica) |
| Nitruro di silicio AFM Cantilever | Sonde Bruker AFM | DNP-10 | Ogni cantilever ha quattro punte e il loro raggio nominale della punta è di 20 nm (con un massimo possibile a 60 nm). In base alle specifiche, utilizziamo la punta D con frequenza di risonanza di 18 kHz e costante nominale della molla di 0,06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II montato su Zeiss Axiovert 200 |
Riferimenti
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 2....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
