Un modello di ossificazione eterotopica di tenotomia e ustione di Achille consente lo studio affidabile della formazione ossea ectopica indotta da traumi senza l'applicazione di fattori esogeni.
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Articolo metodologico
Diretta mouse Trauma / Burn modello di ossificazione eterotopica
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ossificazione eterotopica (HO) è la formazione di osso al di fuori dello scheletro che si forma a seguito di traumi maggiori, ustioni e procedure chirurgiche ortopediche. La maggior parte dei modelli animali utilizzati per studiare l'HO si basa sull'applicazione di sostanze esogene, come la proteina morfogenetica ossea (BMP), i costrutti cellulari esogeni o le mutazioni genetiche nella segnalazione BMP. Sebbene questi modelli siano utili, non riproducono accuratamente gli stati infiammatori che causano la maggior parte dei casi di HO. Qui descriviamo un modello di ustione/tenotomia nei topi che produce in modo affidabile HO focalizzato. Questo protocollo prevede la creazione di un'ustione da contatto a spessore parziale del 30% della superficie corporea totale sulla pelle dorsale e la divisione del tendine d'Achille nel suo punto medio. Affidarsi esclusivamente alla lesione traumatica per indurre l'HO in una posizione prevedibile consente lo studio nel corso del tempo della formazione ossea eterotopica endocondrale solo dai processi fisiologici intrinseci e dall'ambiente. Questo metodo potrebbe rivelarsi determinante per comprendere le vie infiammatorie e osteogeniche coinvolte nell'HO indotta da traumi. Inoltre, poiché l'HO si sviluppa in una posizione e in un andamento temporale prevedibili in questo modello, consente alla ricerca di migliorare le strategie di imaging precoce e le modalità di trattamento per prevenire la formazione di HO.
Introduzione
L'ossificazione eterotopica (HO) è la formazione di osso ectopico in cui le cellule osteopotenti sono indotte in modo aberrante a formare osso endocondrale al di fuori dello scheletro. Mentre i dettagli del percorso di formazione dell'HO sono ancora in gran parte sconosciuti, un paradigma accettato include tre fattori chiave: un incidente infiammatorio scatenante, una nicchia permissiva e cellule staminali mesenchimali in grado di formare l'osso. 1-3 HO è una comorbilità comune che complica oltre il 60% delle ustioni maggiori, il 65% delle lesioni da combattimento e il 10% dei casi di chirurgia ortopedica invasiva. 4,5 Tuttavia, è spesso difficile prevedere dove si formerà l'HO perché può verificarsi in siti di lesione locale o in luoghi distanti che potrebbero altrimenti rimanere illesi. Questa variabilità nella localizzazione rende difficile intervenire a scopo profilattico per prevenire la formazione di osso reattivo in modo localmente mirato. Esistono anche forme congenite di HO come la fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP) in cui i pazienti sono inclini allo sviluppo di HO robusta in risposta a traumi minori o insulti infiammatori. Potenti modelli animali che utilizzano topi transgenici hanno riprodotto questo fenotipo e hanno fornito informazioni sui percorsi molecolari che possono anche essere importanti nell'HO indotta da traumi.6-9 La ricerca traslazionale sulla patogenesi dell'HO non congenita ha utilizzato un'ampia varietà di costrutti che vanno dalla sola lesione all'impianto di materiali e/o cellule osteo-induttive esogene. 10-13
Nel nostro lavoro precedente abbiamo convalidato un modello semplice e affidabile di formazione di HO nei topi che non richiede la somministrazione di alcun materiale esogeno. 14-17 Questo modello ha creato due condizioni chiave per avviare l'HO: trauma locale e infiammazione globale. Ciò è stato ottenuto attraverso l'uso di una tenotomia di Achille (trauma locale) combinata con una lesione da ustione a distanza (infiammazione globale). I topi hanno ricevuto entrambi i trattamenti contemporaneamente e si è scoperto che sviluppavano una robusta quantità di HO che poteva essere analizzata con mezzi istologici, radiologici e molecolari. È interessante notare che le ustioni concomitanti hanno aumentato significativamente la quantità di HO che si è formata e hanno accelerato il suo decorso temporale. L'HO 14-16 si è sviluppata in siti prevedibili intorno al calcagno, all'articolazione della caviglia e alla tibia/perone dell'arto che ha ricevuto la tenotomia. L'affidabilità dello sviluppo di HO in una posizione nota ha permesso un esame mirato delle caratteristiche molecolari e istologiche nelle prime fasi dell'ossificazione ectopica. Ad oggi, il 100% dei topi (oltre 50 animali) con tenotomia e ustioni concomitanti ha sviluppato HO. Inoltre, sono state condotte immagini longitudinali 2D e 3D e analisi spettroscopiche per esaminare il modello di crescita e la composizione biochimica di HO.15,16
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Protocollo
Dichiarazione etica: Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in stretta conformità con le buone pratiche animale come definito nelle linee guida fornite nella Guida per l'uso e la cura di animali da laboratorio: Ottava Edizione del Institute for Research Laboratory Animal (ILAR, 2011) e sono stati approvato dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale dell'Università del Michigan (PRO0001553).
1. mouse Procedure chirurgiche
NOTA: Usare 8-10 settimane vecchio C57BL / 6 topi. Altre epoche, sfondi e ceppi di topi possono anche essere utilizzati per testare le condizioni diverse o make-up genetico. Per la parte tenotomia del procedimento, mantenere condizioni di sterilità utilizzando la maschera di protezione, cofano capelli, e camice sterile, guanti e strumenti. Siti chirurgici devono essere sterilmente preparati con iodopovidone e drappeggio sterile. Evitare l'ipotermia utilizzando una piastra elettrica veterinaria e il riscaldamento soluzioni rianimazione a 37 ° C prima di amministrazione.
- Anestetizzare il mouse utilizzando 2,5% isoflurano per via inalatoria. Utilizzare un cono di lasciare il dorso e arti posteriori facilmente accessibile. Regolare la velocità di somministrazione isoflurano per mantenere la frequenza respiratoria adeguata e la colorazione delle mucose e per garantire l'anestesia controllando il tono muscolare, pizzico piedi, e di riflesso corneale. Applicare blando pomata oftalmica agli occhi del mouse per evitare lesioni agli occhi asciutti durante la procedura. Mantenere un'adeguata temperatura corporea usando una piastra elettrica veterinaria o circolatore acqua calda sotto il campo operatorio.
- Somministrare buprenorfina, 0,1 mg / kg, per via sottocutanea immediatamente prima di un intervento chirurgico per l'analgesia.
- Strettamente radere sito chirurgico sulla zampa posteriore sinistra utilizzando tagliaunghie dal tallone al ginocchio.
- Strettamente radere dorso del mouse, iniziando sopra la colonna vertebrale ed estendendo l'area rasata a sinistra della linea mediana dorsale, aprendo una superficie di almeno 2 cm x 3 cm per accogliere il ustioni.
- Preparare il sito chirurgico, compresa la zampa posteriore al ginocchio con 3 alternati scrub povidone-iodio.
- Eseguire una incisione longitudinale lungo la faccia mediale del tendine d'Achille sinistro. Estendere l'incisione in modo che il tendine di Achille può essere facilmente visualizzato; di circa 0,5 cm.
- Eseguire una tenotomia di Achille con tagliente dissezione del tendine a metà con le forbici tessuti taglienti. Inserire una lama delle forbici del tessuto sul piano tessuto sotto il tendine e sezionare lungo il piano finché la lama è al punto medio del tendine. Chiudere le lame a forbice per tagliare il tendine bruscamente.
NOTA: Assicurare l'inclusione di tutti i tendini posteriori tra cui gastrocnemio, soleo, e tendini Plantaris. - Raggiungere emostasi facendo pressione con garza sterile (ci dovrebbe essere minimo sanguinamento) e chiudere l'incisione cutanea con un punto 5-0 Vicryl.
- Eseguire la dorsale parziale spessore di masterizzazione con un blocco di alluminio del peso di 35 g con measuremen approssimativits 2 centimetri x 2 cm x 3 cm riscaldata a 60 ° C in un bagno d'acqua applicata al dorso rasata del mouse per 17 sec.
NOTA: ottenere la profondità ustione appropriata posizionando il blocco superiore del mouse anestetizzato, garantendo che l'intera superficie del blocco è in contatto con il mouse, però evitare di applicare qualsiasi ulteriore pressione al blocco, cioè permettono gravità essere l'unica forza tiene il blocco in posizione. Una maniglia di plastica sottile fissato su un lato del blocco è conveniente per la manipolazione, la stabilizzazione, e recupero dal bagno di acqua calda. Questo creerà un organo di totale superficie di circa il 30% a bruciare in un 8-10 settimane di età C57BL / 6 del mouse. Questo ustione contatto è stata scelta rispetto ad altri metodi (fiamma o scottature masterizzazione) a causa della uniformità della profondità dell'ustione sulla ferita e la riproducibilità tra animali. - Asciugare il sito ustione con una garza e applicare una medicazione Tegaderm.
- Somministrare fluidi riscaldati rianimazione: Ringer lattato soluzione 1 mliniezione intraperitoneale e 0,5 ml iniezione sottocutanea. Questa amministrazione di una volta di rianimazione è adeguata per il recupero da ustioni e tenotomia.
NOTA: Non tornare topi anestetizzati per gabbie abitative con altri topi, casa individualmente in gabbie pulite sotto controllo fino a quando i topi sono completamente recuperati. Recupero tipica avviene entro 1-6 ore. Siti di masterizzazione in genere guariscono entro 2-4 settimane e raramente sono complicate da infezione della ferita se tenuti in ambienti abitativi puliti. - Somministrare buprenorfina 0,1 mg iniezione sottocutanea / kg ogni 12 ore per 3 giorni dopo la procedura. Monitor crescita HO con scansioni seriali μCT a intervalli appropriati. Crescita ossea ectopica è il primo evidente circa 3 settimane dopo l'intervento per μCT.
NOTA: La maggior parte dello sviluppo HO è completata entro 9 settimane post-op. Non abbiamo osservato una differenza di volume HO o posizione con ripetute μCT scansioni bi-settimanale per 15 settimane rispetto a un unico end-point μCT scansione a 15 settimane.Al termine degli esperimenti, tutti i topi eutanasia con CO 2 inalazione secondo le linee guida istituzionali e verificare la morte con dislocazione cervicale dopo 10 min.
2. μCT Acquisizione e analisi
- Fissare il mouse anestetizzato sul piano dello scanner in posizione prona. Nastro arti posteriori saldamente al letto per evitare di respirare artefatti da movimento. Includere l'aria, l'acqua, e idrossiapatite contenente fantasma sotto il mouse per la calibrazione dell'immagine.
- Aprire il software di analisi Bone e definire una regione di interesse (ROI) che comprende entrambi gli arti posteriori dal anca prossimale alla punta della zampa posteriore distale. Ottenere un'immagine utilizzando i seguenti parametri:. 80 kV, 500 μA e 1.300 esposizione msec, 48 micron dimensioni voxel 14,15
- Calibrare l'immagine di unità Hounsfield (HU) disegnando un ROI in ciascuna delle tre camere fantasma e inserendo la densità media nei campi appropriatiil software.
- Con lo strumento "grabber" nel software, riorientare l'immagine in modo tibia del arto posteriore sinistro è parallelo lungo l'asse Z per consentire la più chiara vista anatomico per la delineazione di strutture ossee corticali ortotopico e HO.
- Cominciando al ginocchio, scorrere distalmente attraverso le fette di immagine fino a quando si incontra HO. Utilizzando lo strumento spline manuale, fare un ROI attorno all'osso ectopica su ogni 5 ° fetta continuando distale attraverso la zampa o fino HO è stato superato. Utilizzare lo strumento estrapolare per estendere e cucire le ROI in un unico ROI che contiene tutte le HO.
- Fare un ROI 3D e scegliere il menu analisi. Calcolare il volume osseo impostando i valori di soglia inferiore e superiore che meglio mostrano la finestra ossea. Utilizzare gli stessi valori soglia fissati per tutte le scansioni.
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Risultati
In questo studio, il protocollo è descritto per il modello precedentemente pubblicata murino di trauma / bruciare indotto HO. 14-17 Questo comporta la creazione di una concomitante lesione muscolo-scheletrico localizzata con un tenotomia Achille e insulto infiammatorio globale, con un spessore parziale ustioni. Ciò provoca la formazione di osso affidabile reattivo al sito tenotomia che può essere seguito con l'imaging seriale. Ad oggi, tutti i topi (più di 50) che hanno sostenuto sia Achille tenotomia e m...
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Discussione
L'ossificazione eterotopica rappresenta una grave compromissione funzionale affrontata dai pazienti che subiscono traumi, ustioni e procedure muscoloscheletriche invasive. La popolazione più a rischio è costituita dai soldati nei conflitti moderni con gravi lesioni da esplosione dovute a meccanismi come gli ordigni esplosivi improvvisati (IED). 18 L'armatura migliorata e le unità mediche posizionate in avanti consentono una migliore sopravvivenza alle lesioni gravi degli arti. Dopo la stabilizzazione inizia...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Ringraziamenti
Ringraziamo Amanda Fair, il CMI, Kathy Sweet e l'ORL di UM per l'assistenza con l'imaging e l'analisi μCT. Finanziamento: BL Finanziato da 1K08GM109105-01 e Plastic Surgery Foundation National Endowment Award.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 topi | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 settimane di età |
| Isoflurano Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorfina – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0,3 mg/ml soluzione |
| Betadine | Owens e Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Suture Vicryl | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Tagliato a metà per coprire adeguatamente il sito dell'ustione |
| µ TC - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Imaging preclinico, Londra, ON, Canada | ||
| Applicazione Microview 2.2 Advanced Bone | Analysis GE Healthcare Imaging preclinico, Londra, ON, Canada |
Riferimenti
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