Qui viene descritta la creazione di un modello di chirurgia della cataratta simulata ex vivo clinicamente rilevante che può essere utilizzato per studiare i meccanismi della risposta al danno dei tessuti epiteliali all'interno del loro microambiente nativo.
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Articolo metodologico
Istituzione di un clinicamente rilevanti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il principale ostacolo alla comprensione di come un tessuto epiteliale esegue la riparazione della ferita è la limitata disponibilità di modelli in cui è possibile seguire e manipolare la risposta della ferita ex vivo in un ambiente che imita da vicino quello della lesione del tessuto epiteliale in vivo. Questo problema è stato affrontato creando un modello epiteliale ex vivo di riparazione delle lesioni clinicamente rilevante basato sulla chirurgia della cataratta. In questo modello di coltura, la risposta dell'epitelio del cristallino alla ferita può essere seguita dal vivo nel microambiente nativo delle cellule e i mediatori molecolari della riparazione della ferita possono essere facilmente manipolati durante il processo di riparazione. Per preparare le colture, le lenti vengono rimosse dall'occhio e viene praticata una piccola incisione nella parte anteriore della lente da cui viene rimossa la massa interna delle cellule delle fibre del cristallino. Questa procedura crea una ferita circolare sulla capsula posteriore del cristallino, la spessa membrana basale che circonda il cristallino. Questa area della ferita in cui sono state attaccate le cellule delle fibre si trova appena adiacente a un monostrato continuo di cellule epiteliali del cristallino che rimane collegato alla capsula del cristallino durante la procedura chirurgica. L'epitelio ferito, il tipo di cellula da cui derivano le cellule fibrose durante lo sviluppo, risponde alla lesione della rimozione delle cellule fibrose muovendosi collettivamente attraverso l'area della ferita, guidato da una popolazione di cellule di riparazione ricche di vimentina i cui progenitori mesenchimali sono endogeni al cristallino1. Queste proprietà sono tipiche di una normale risposta epiteliale di guarigione delle ferite. In questo modello, come in vivo, la riparazione della ferita dipende dai segnali forniti dall'ambiente endogeno che viene mantenuto in modo univoco in questo sistema di coltura ex vivo, fornendo un'opportunità ideale per la scoperta dei meccanismi che regolano la riparazione di un epitelio dopo la ferita.
Introduzione
La clinicamente rilevante, la chirurgia della cataratta finto, ex vivo epiteliale modello guarigione delle ferite qui descritto è stato sviluppato per fornire uno strumento per indagare i meccanismi che regolano la riparazione dei tessuti epiteliali in risposta ad un infortunio. Le caratteristiche principali che sono state finalizzate per nella creazione di questo modello inclusi 1) creare condizioni che strettamente replicato la risposta in vivo a ferire in un ambiente culturale, 2) la facilità di modulare gli elementi regolatori di riparazione, e 3) capacità di immagine il processo di riparazione, nella sua interezza, in tempo reale. La sfida, qui....
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Protocollo
Il seguente protocollo è conforme alle Istituzionale Animal Care and Use Committee linee guida Thomas Jefferson University e con la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Vision Research.
1. Configurazione e preparazione di lenti per la Cultura Ex Vivo Wound
- Mettere tre 100 piatti mm Petri in una, cappa a flusso laminare sterile. Riempire due dei piatti petri metà con tampone Tris / destrosio (buffer TD; 140 mM NaCl, KCl 5 mM, 0,7 mM Na 2 PO 4, 5 mM D-glucosio, 8,25 mM Tris Base, pH a 7,4 con HCl) a RT , lasciando il terzo vuoto. Terreni di coltura pre-caldo (Media 199 integrato con, 1% di....
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Risultati
Ex Vivo Modello creato per studiare il processo di guarigione delle ferite nei microambiente nativo le cellule '
Per studiare i meccanismi coinvolti nella regolazione guarigione delle ferite di un epitelio all'interno microambiente nativo delle cellule, un clinicamente rilevante ex vivo finto modello chirurgia della cataratta è stato creato. Questo modello è stato creato da tessuto lente che offre molti vantaggi per le sue proprietà intrinseche: 1) l'obiettivo è.......
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Discussione
Qui viene descritta una tecnica per la preparazione di un modello di coltura di riparazione delle ferite che prevede l'esecuzione di un intervento di cataratta ex vivo su lenti di embrioni di pollo dopo la loro rimozione dall'occhio. L'epitelio del cristallino risponde a questa ferita clinicamente rilevante con un processo di riparazione che imita da vicino quello che si verifica in vivo e condivide le caratteristiche con la riparazione delle ferite in altri tessuti epiteliali2,4. Sebbene il .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health Grant ad A.S.M. (EY021784).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Utilizzo a 140 mM in tampone TD |
| Cloruro di potassio (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Utilizzo a 5 mM in tampone TD |
| Fosfato di sodio (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | Utilizzo a 0,7 mM in tampone TD |
| D-glucosio (destrosio) | Fisher Scientific | D16-500 | Utilizzo a 0,5 mM in tampone TD |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Utilizzo a 8,25 mM in tampone TD |
| Acido cloridrico | Fisher Scientific | A144-500 | Utilizzo per pH TD tampone a 7,4 |
| Terreno 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-glutammina | Corning/CellGro | 25-005-CI | Utilizzo all'1% in Terreno 199 |
| Penicillina/streptomicina | Corning/ CellGro | 30-002-CI | Uso all'1% in Media199 |
| Piastre di Petri da 100 mm | Fisher Scientific | FB0875711Z | |
| Stericup Filter Unit | Millipore | SCGPU01RE | Uso per filtrare sterilizzare Media |
| Dumont #5 pinze (ne servono 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Piatto per colture cellulari da 35 mm | Corning | 430165 | |
| 27 G 1 ml SlipTip con ago di scorrimento di precisione | BD | 309623 | |
| Forbici fini | Strumenti di scienza fine | 14058-11 | |
| Pinze standard | Strumenti di scienza fine | 91100-12 | |
| Altri elementi necessari: Strumenti di dissezione generale, uova di gallina livornese bianche fertili, incubatrice per uova di controllo (umidificata, 37,7° C), cappa a flusso laminare, microscopio |
Riferimenti
- Walker, J. L., et al. Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D.
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Ristampe e permessi
