Articolo metodologico
L'imaging spettroscopico elettronico può visualizzare e distinguere l'acido nucleico dalle proteine con una risoluzione nanometrica. Può essere combinato con il sistema miniSOG, che è in grado di marcare in modo specifico le proteine marcate in campioni di microscopia elettronica a trasmissione. Illustriamo l'uso di queste tecnologie utilizzando come esempio i fuochi di riparazione della rottura a doppio filamento.
I limiti della risoluzione ottica e la sfida di identificare popolazioni di proteine specifiche in microscopia elettronica a trasmissione sono stati gli ostacoli in biologia cellulare. Molti fenomeni non possono essere spiegati mediante analisi in vitro in sistemi semplificati e necessitano di ulteriori informazioni strutturali in situ, in particolare nel campo tra 1 nm e 0,1 micron, per essere pienamente compreso. Qui, electron spettroscopica di imaging, una tecnica di microscopia elettronica di trasmissione che permette la mappatura simultanea della distribuzione delle proteine e acidi nucleici, e un tag espressione, miniSOG, vengono combinati per studiare la struttura e l'organizzazione di DNA a doppio filamento break riparazione foci.
Nonostante i progressi significativi nella microscopia ottica negli ultimi anni 1, cell-biologi soffrono ancora di una lacuna nella risoluzione. Questo limita comprensione delle relazioni struttura-funzione nei processi cellulari fondamentali che coinvolgono l'interazione coordinata tra complessi macromolecolari (ad esempio, nel rimodellamento della cromatina, la riparazione del DNA, RNA trascrizione e replicazione del DNA). Sebbene microscopi elettronici a trasmissione (TEM) s fornire la risoluzione richiesta, è stato difficile da definire questi processi strutturalmente a causa della incapacità di etichettare specifiche proteine pur essend....
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1. Generazione di linee cellulari miniSOG
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ESI
Confrontando le immagini ESI del nucleo (figura 1) con le immagini TEM convenzionali (ad esempio, la Figura 7-1) rivela un drammatico aumento strutture anatomiche che possono essere facilmente distinguibili. Le creste cromatina appaiono in giallo ed è abbastanza facile identificare le chromocenters in cellule di topo. Nucleoli può essere facilmente distinta dalla cromatina dalla loro struttura rotonda e colore diverso, dal momen.......
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ESI può servire come un ottimo strumento per l'esame diversi stati di cromatina e ribonucleoproteine nel nucleo, perché è in grado di mappare in particolare le aree che sono ricchi di fosforo. Essa aumenta profondamente la quantità di dettagli che può essere ottenuta con un microscopio elettronico e non dipende opposti metodi non specifici. Uno svantaggio di ESI è che richiede sezioni sottili di TEM convenzionale alla stessa tensione di accelerazione. Questo può essere superato lavorando con sezioni seriali o con .......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamo il Dr. Roger Tsien per averci fornito i costrutti miniSOG. Dr. Xuejun Sun per l'aiuto con il TEM. Lisa Lem e Peter Shipple del Cross Cancer Institute per la fornitura di ossigeno. Hilmar Strickfaden è titolare di una borsa di studio post-dottorato presso l'Alberta Cancer Foundation ed è stata sostenuta dalla Bayrische Forschungsallianz. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Canadian Institutes of Health Research e dell'Alberta Cancer Foundation.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre con fondo in vetro da 35 mm | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Piastre con fondo in vetro da 35 mm | grigliate MatTek | P35G-2-14-CGRD | Non realizzato per obiettivi ad immersione |
| LR Bianco: resina acrilica | emsdiasum | 14381 | |
| LR Bianco acceleratore | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidina tetracloridrato 10 mg compresse | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Tetrossido di osmio | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | potrebbe funzionare anche con le versioni precedenti | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | potrebbe funzionare anche con le versioni precedenti | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesio 137 sorgente di radiazioni "MARCO 1" | ( J.L. Shepherd & Associato) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubi | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Coltello diamantato ultra 35° | diatomee | ||
| ultratrim | Diatomee | ||
| Cacodilato di sodio triidrato | emsdiasum | 12300 | Attenzione Tossico! |
| Glutaraldeide EM Grado 8% | emsdiasum | 16020 | Attenzione Tossico! |
| Sodio fosfato bibasico | emsdiasum | 21180 | |
| Sodio fosfato monobasico | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldeide | emsdiasum | 19202 | |
| Tetrossido di osmio 4% soluzione | emsdiasum | 19150 | |
| Micoscopio a fluorescenza invertita Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Acido | cloridricoFisherbrand | A142-212 | |
| Soluzione di idrossido di sodio 10M | Fluka | 72068 | |
| Ossigeno | Medigas | ||
| 3-Ammino-1,2,4-triazolo | Sigma | A8056 | |
| Cianuro di potassio | Sigma | 207810 | Attenzione Tossico! |
| Etanolo | emsdiasum | 15058 | Attenzione Tossico! |
| Lama di rasoio Single Edge in acciaio al carbonio | emsdiasum | 71960 | Attenzione Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Microscopio elettronico a trasmissione 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Filtro energetico | Gatan |
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