Articolo metodologico

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

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DOI:

10.3791/52893

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24 settembre 2015

 ,  , 
1Department of Oncology, Faculty of Dentistry and Medicine, University of Alberta

In questo articolo

Sommario

L'imaging spettroscopico elettronico può visualizzare e distinguere l'acido nucleico dalle proteine con una risoluzione nanometrica. Può essere combinato con il sistema miniSOG, che è in grado di marcare in modo specifico le proteine marcate in campioni di microscopia elettronica a trasmissione. Illustriamo l'uso di queste tecnologie utilizzando come esempio i fuochi di riparazione della rottura a doppio filamento.

Abstract

I limiti della risoluzione ottica e la sfida di identificare popolazioni di proteine ​​specifiche in microscopia elettronica a trasmissione sono stati gli ostacoli in biologia cellulare. Molti fenomeni non possono essere spiegati mediante analisi in vitro in sistemi semplificati e necessitano di ulteriori informazioni strutturali in situ, in particolare nel campo tra 1 nm e 0,1 micron, per essere pienamente compreso. Qui, electron spettroscopica di imaging, una tecnica di microscopia elettronica di trasmissione che permette la mappatura simultanea della distribuzione delle proteine ​​e acidi nucleici, e un tag espressione, miniSOG, vengono combinati per studiare la struttura e l'organizzazione di DNA a doppio filamento break riparazione foci.

Introduzione

Nonostante i progressi significativi nella microscopia ottica negli ultimi anni 1, cell-biologi soffrono ancora di una lacuna nella risoluzione. Questo limita comprensione delle relazioni struttura-funzione nei processi cellulari fondamentali che coinvolgono l'interazione coordinata tra complessi macromolecolari (ad esempio, nel rimodellamento della cromatina, la riparazione del DNA, RNA trascrizione e replicazione del DNA). Sebbene microscopi elettronici a trasmissione (TEM) s fornire la risoluzione richiesta, è stato difficile da definire questi processi strutturalmente a causa della incapacità di etichettare specifiche proteine ​​pur essendo in grado di determinare la composizione biochimica delle strutture visualizzate. In assenza di membrane interne per aiutare a differenziare le strutture nucleari, il nucleo è stato particolarmente impegnativo. Electron spettroscopica di imaging (ESI) risolve alcune di queste limitazioni, consentendo la determinazione e differenziazione di DNA, RNA, e protein-based strutture nucleari 2-5.

Elettrone di imaging spettroscopico:

Per mappare distribuzioni elementari ad alta sensibilità e risoluzione al microscopio elettronico, si può usare uno spettrometro ad immagine che seleziona elettroni che sono stati anelasticamente dispersi attraverso le interazioni con elettroni guscio interno di un elemento nel campione 6. Poiché specifici dell'elemento quantità di energia vengono persi come conseguenza della ionizzazione degli atomi nel campione, questi elettroni possono essere separati e visualizzati usando uno spettrometro che è collegato al microscopio elettronico. Pertanto, l'analisi dello spettro degli elettroni che hanno interagito con il campione rivela informazioni qualitative e quantitative sulla composizione elementare del campione 7. Gli elettroni che non perdono energia quando passa attraverso il campione si trovano nella "picco perdita zero" della perdita di energia degli elettronispettro. L'abbondanza di questi elettroni è correlato alla massa, densità e spessore del campione e comprende elettroni che passano attraverso il campione senza urtare il campione o perdere energia durante il passaggio attraverso il campione. Queste informazioni possono essere utili per la quantificazione assoluta dei numeri di atomi di un elemento specifico presente nel campione 8.

Poiché campioni biologici consistono principalmente di elementi leggeri che mal deviano gli elettroni nel fascio incidente del TEM, metodi di colorazione utilizzando metallo pesante sali devono essere applicate in modo da generare contrasto nel campione. La mancanza di specificità della maggior parte di questi agenti di contrasto e l'incapacità di visualizzare più di una macchia in cui la specificità è possibile ha limitato il valore di microscopia elettronica convenzionale nello studio del nucleo. ESI ha vantaggi significativi rispetto TEM convenzionali, in particolare per lo studio delle strutture del nucleo cellulare.È possibile sfruttare la natura ricca fosforo di DNA e complessi macromolecolari-RNA contenente distinguere complessi nucleoproteici da complessi proteici e risolvere diversi complessi nucleoproteici basate sulla loro densità di acidi nucleici. Il materiale biologico residuo può essere ripreso in base alla sua abbondanza di azoto. Mappatura solo questi due elementi e analisi della loro distribuzione e abbondanza relativa all'interno di diverse strutture anatomiche ci fornisce un sacco di informazioni sul nucleo. Ad esempio, è facile identificare cromatina e ribosomi nella mappa rappresentano fosforo abbondanza. Lo spazio interchromatin, complessi del poro nucleare, e corpi nucleari, invece, possono essere facilmente individuati nell'immagine azoto mappa.

Mini sistema di generatore di ossigeno singoletto (miniSOG)

Mentre ESI rappresenta una potente tecnica per studiare in situ struttura della cromatina, perché ci vuoles vantaggio dei rapporti caratteristici di composizione elementare tra il fosforo e l'azoto, la composizione elementare non può essere normalmente utilizzati per discriminare tra le diverse popolazioni di complessi proteici. Anticorpi marcati con piccole particelle d'oro nella gamma nanometri sono stati ampiamente utilizzati per mappare la posizione delle singole molecole. Poiché la particella oro viene normalmente collegato a un anticorpo secondario, apparirà entro una circonferenza di circa 20 nm circa l'epitopo rilevato dal anticorpo primario. In campioni successivi-embedding, anticorpi possono rilevare solo epitopi che sono esposte alla superficie delle sezioni. Mentre è possibile dimostrare la presenza di un antigene e si riferiscono ad una certa struttura anatomica della cellula, le informazioni che si ottiene è incompleta, poiché la maggior parte degli epitopi sono oscurati da resina. Tecniche, che utilizzano protocolli simili a quelli utilizzati per la microscopia a fluorescenza Pre-embedding, consentire l'accesso agli antigeni tuttol'intera profondità del campione ma i passi permeabilizzazione necessari per consentire l'anticorpo di penetrare cella tipicamente richiede la rimozione di membrane lipidiche e rimuovere i componenti che non possono essere risolti con aldeidi. Inoltre, il fissativo aldeide preferito per la conservazione ultrastruttura, glutaraldeide, comunemente distrugge epitopi e, di conseguenza, è in genere necessario paraformaldeide. Questo è meno efficace a proteina-proteina reticolazione. Un altro svantaggio di anticorpi che sono etichettati con una nanoparticella di oro è che l'oro è un materiale molto elettron-denso che crea un forte contrasto che possono oscurare interessanti dettagli strutturali del campione, che ha più debole contrasto.

L'emergere della proteina verde fluorescente (GFP) come un tag di proteina espressa ha trasformato l'uso di microscopia a fluorescenza per rispondere alle domande di biologia cellulare. Tagging una proteina con un piccolo dominio fluorescente permette mappatura della sua distribuzione in vivo senza la necessità di procedure di permeabilizzazione che possono alterare la struttura. Per tradurre il principio elegante di usare i tag proteine ​​per mappare distribuzioni cellulari delle proteine ​​di microscopia elettronica, un sistema era necessario che sia in grado di produrre un segnale in prossimità della struttura di interesse e generare contrasto nella TEM. Diaminobenzidina polimerizzato è una macchia che viene spesso utilizzato in istologia per rilevare legame degli anticorpi. Questa macchia è di solito depositato con perossidasi (HRP) coniugata con un anticorpo secondario. Sebbene la reazione produce un risultato affidabile, HRP non è cataliticamente attivo nel citosol delle cellule 9. I prodotti di reazione di HRP possono anche diffondono lontano dal sito di generazione in modo che la loro risoluzione è peggiore rispetto al metodo nanogold 10. Per bypassare questi problemi, il sistema / Reash Flash è stato sviluppato 11. È costituita da proteine ​​di fusione ricombinanti che possiedono un motivo tetracysteine. Questo motivo permette vincolanteun fluoroforo biarsenic. Quando eccitato, il flash associato o Reash è in grado di generare l'ossigeno singoletto altamente reattivo e quindi photoconvert diaminobenzidina (DAB) in un polimero che precipita immediatamente al sito delle proteine ​​tag. Il polimero DAB può essere colorato con tetrossido di osmio, che è denso di elettroni e quindi può essere utilizzato per mappare la distribuzione della proteina di fusione ricombinante nel TEM.

Nel 2011, Shu et al. 10 presentato il sistema miniSOG, che consiste in un piccolo 106 amino acidi tag fusione derivato da una flavoproteina di Arabidopsis che è fluorescente e in grado di creare molti radicali ossigeno singoletto eccitato con 448 quando nm luce blu. Tali radicali dell'ossigeno singoletto possono essere utilizzati per foto-diaminobenzidina ossidare per formare polimeri sopra e vicino alla superficie della proteina marcata, che è notevolmente più vicino di anticorpi marcati immunogold 11. Mentre il sistema di flash / Reash richiede portare il fluorocromo e la diaminobenzidina nelle cellule prima di fare il fotoconversione, il sistema richiede solo miniSOG diaminobenzidina e luce e in aggiunta è circa due volte più efficace a polimerizzazione diaminobenzidina. Qui, miniSOG è impiegato in combinazione con ESI per mappare l'ultrastruttura di riparazione del DNA focolai.

Riparazione del DNA focolai (DRF)

DNA non riparato doppie rotture dei filamenti rappresentano una grave minaccia alla cella in quanto possono portare a traslocazioni e la perdita di informazioni genetiche. A sua volta, questo può portare a senescenza, il cancro, e la morte cellulare. Molte proteine ​​che sono coinvolte nella riparazione del DNA a doppia interruzione filo accumulano nei focolai che assemblare intorno a un DNA a doppio filamento pausa 12-14. Anche se la loro funzione non è nota, rappresentano il sito nel nucleo che contiene il DNA a doppio filamento pausa ed è il sito di DNA a doppio filamento break riparazione.

Riparazione del DNA foci (DRF) sono stati caratterizzati da microscopio a fluorescenza e servono come biomarcatori per danno al DNA 12,15. Sono massiccio rispetto alle dimensioni della pausa doppio filamento e sono stati considerati relativamente omogenea fino recenti studi di microscopia super-risoluzione rivelato alcune prove di sub-compartimentalizzazione delle molecole all'interno di ogni fuoco 16. Per comprendere come sono organizzati questi siti, è necessario visualizzare tutte le strutture biologiche sottostanti rispetto all'altro. Ciò non può essere ottenuto mediante microscopia a fluorescenza, ma è possibile attraverso microscopia elettronica 17,18. Qui, viene descritto un metodo che combina elettroni spettroscopica con il metodo miniSOG per illustrare il potenziale di questo approccio combinato di esplorare l'ultrastruttura di DNA a doppio filamento break riparazione.

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Protocollo

1. Generazione di linee cellulari miniSOG

  1. Grow U2OS (osteosarcoma umano) cellule in un piatto da 35 mm contenente 2 ml di glucosio basso modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) che è integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 atmosfera.
  2. Trasfezione le cellule quando sono l'80% confluenti da lipofezione con qualità trasfezione purificato (A269 / 280 rapporto 1,8-2,0) costrutti plasmidici contenenti le sequenze per miniSOG e mCherry contrassegnati proteine ​​di riparazione secondo il protocollo del produttore del reagente trasfezione 19. I plasmidi di espressione miniSOG possono essere ordinati dalla Tsien-Lab: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
  3. Ordinare le cellule che esprimono la proteina ricombinante con il tag miniSOG e mCherry per fluorescenza delle cellule attivate ordinamento due giorni dopo la trasfezione. Raccogliere le cellulecon intensità di fluorescenza intermedio per evitare cellule che sono overexpressing 20.
  4. Cultura le cellule positive su un piatto 10 cm in 10 ml di terreno DMEM che viene supplementato con 10% FBS e 0,6 mg / ml dell'agente selezione G418 (geneticina).
  5. Dopo colonie visibili sono emersi sulle piastre, schermo per mCherry colonie positive utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza e disegnare cerchi intorno a loro (sul fondo del piatto) con un pennarello indelebile. Utilizzare una lente obiettiva aria basso ingrandimento (ad esempio, 10x) e selezionare i cloni che usano una tecnica sterile grattando attentamente le colonie fuori e lentamente li succhia in una sterile, punta della pipetta 1000 ml.
  6. Espandere le colonie selezionate e congelare parti di essi verso il basso con il mezzo di crescita descritto al punto 1.1 supplementato con 10% dimetilsolfossido. Metti alla prova le cellule per la formazione DRF da loro crescente su sterili 18 x 18 mm 2 vetrini e esponendoli a2 Gy di radiazioni. Le cellule che esprimono stabilmente irradiati un miniSOG mCherry taggati proteina riparazione deve mostrare il motivo caratteristica tipica focale di DSB quando visualizzati con un microscopio a fluorescenza utilizzando un filtro-set per l'imaging mCherry.

Cultura 2. Cella

  1. Cultura cellule U2OS esprimono stabilmente la miniSOG e mCherry contrassegnati proteine ​​di riparazione alle condizioni descritte al punto 1.1. Crescere le cellule a 80% di confluenza in un piatto fondo di vetro di diametro 35 mm contenente 2 ml di DMEM. Assicurarsi che il collante che attacca il vetrino per la plastica e la plastica utilizzata è resistente alle soluzioni acquose e alcoliche e resistente alla resina utilizzata!
  2. Prima di effettuare l'esperimento, delineare una piccola superficie di circa 1 mm 2 che contiene cellule che esprimono proteine ​​ectopiche graffiando con una penna di diamante sterile utilizzando un microscopio a fluorescenza per identificare la regione di interesse. In alternativa, utilizzare un piatto fondo di vetro tcappello contiene un vetrino con un sistema a griglia di pre-inciso integrato nel vetrino.
    NOTA: Se si utilizza la microscopia correlativa di alta qualità che combina ESI e fluorescenza immagini microscopiche 21, assicurarsi che lo spessore del vetrino è compatibile con gli obiettivi ad immersione olio. Dovrebbe avere spessore No. 1.5 (0,16-0,18 mm). Scegliere una zona vicino al centro del piatto per la regione da esaminare nella TEM per evitare problemi con la polimerizzazione della resina che può verificarsi in prossimità dei bordi (vedi punto 4,10-4,13).

3. DNA Damage induzione

  1. Irradiare le cellule con radiazioni gamma, utilizzare un farmaco radiomimetico, o indurre il danno da micro irradiazione laser su un microscopio confocale (ad esempio, come descritto in 18,22 o 23).
  2. In questo esempio, irradiare le cellule con 2 e 6 Gy di raggi gamma in un microirradiate cesio 137-sorgente di radiazione laser o utilizzando il sol 405 nmid laser a stato di un microscopio confocale dopo sensibilizzare le cellule per 20 minuti con 0,5 mg / ml Hoechst.

Preparazione del campione 4.

  1. Fissare le cellule con 1 ml di 4% paraformaldeide cautela in tampone cacodilato 0.1 M di sodio o in 0,1 M tampone fosfato pH 7,4 per 30 minuti a RT al buio.
    ATTENZIONE: Paraformaldeide e cacodilato sodio sono tossici! Indossare guanti e smaltire in modo adeguato le sostanze tossiche.
  2. Lavare le cellule due volte con 4 ml di 0,1 M tampone sodio cacodilato pH 7,4 o tampone fosfato pH 7,4.
  3. Trattare le cellule fissate con glicina 2 ml di 50 mM, 5 mM amminotriazolo e 10 mM cianuro di potassio cautela in 0,1 M tampone sodio cacodilato o tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4) (controllare il pH!) Per 30 minuti per bloccare non reagito gruppi aldeidici e per sopprimere le specie reattive dell'ossigeno generati da gruppi eme, che può aumentare il fondo.
    ATTENZIONE: cianuro di potassio è estremamente tossico! Wguanti orecchio, lavorano sotto un cappuccio e smaltire adeguatamente le sostanze tossiche. La reazione è molto sensibile al pH, quindi è importante che il pH verificato e preciso.
  4. Registrare la zona che è stata selezionata al passo 2.2 in 2D o 3D su un microscopio a fluorescenza invertito, se la microscopia correlativa si desidera.
  5. Preparare una / ml di soluzione di cloridrato ATTENZIONE diaminobenzidina 1 mg ponendo un 10 mg diaminobenzidina cloridrato in una provetta da 2 ml. Aggiungere 980 ml ​​di H 2 O distillata e 20 ml di acido cloridrico concentrato (11,65 M) e miscelare fino a che la soluzione è marrone chiaro e trasparente. Diluire questa soluzione 0,1 M di fosfato di sodio 0,1 M o tampone cacodilato ad una concentrazione finale di 1 mg / ml mentre regolando il pH con idrossido di sodio fino a pH tra 7,0 e 7,6 (pH 7.4 è raccomandato).
    ATTENZIONE: diamminobenzidina è tossico! Indossare guanti e smaltire in modo adeguato le sostanze tossiche.
  6. Per fotoossidazione, replace buffer con 2 ml di una / ml soluzione di cloridrato diaminobenzidina 1 mg in 0,1 M tampone sodio cacodilato o tampone fosfato. Protect questa soluzione dalla luce e raffreddarlo in ghiaccio a 4 ° C al fine di aumentare la solubilità di ossigeno. Saturare la soluzione con facendovi gorgogliare ossigeno attraverso la soluzione (utilizzare un tubo che viene inserito nella soluzione e collegato ad una bombola di ossigeno). Controllare di nuovo il pH e regolare se necessario.
    NOTA: E 'fondamentale per la reazione fotossidazione che il pH è compreso tra pH 7,0 e pH 7,6.
  7. Montare il piatto con le cellule fissate con cura su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di una lente obiettivo 40x olio di immersione e spostarlo l'area di interesse. Excite il tag miniSOG con luce blu utilizzando cubi filtro per GFP o PCP. MiniSOG ha un massimo di eccitazione a 448 nm con una spalla a 473 nm 10.
  8. Continuare con l'illuminazione, anche dopo il verde miniSOG fluorescenza ettaris completamente scomparsi e finché il prodotto fotoossidazione marrone della diaminobenzidina polimerizzata emerge nel canale luce trasmessa. Quando il prodotto di ossidazione è visibile nella maggior parte delle cellule, disattivare l'illuminazione a fluorescenza per arrestare la foto-ossidazione.
    NOTA: Foto-ossidazione può richiedere diversi minuti a seconda della lente dell'obiettivo, le lunghezze d'onda di trasmissione filtro e l'efficienza, e la sorgente di illuminazione.
  9. Postfix le cellule con 1 ml di 2% glutaraldeide in 0,1 M di sodio cacodilato pH 7,4 tampone o tampone fosfato pH 7,4 per 30 min.
  10. Fissare le membrane delle cellule con 0,1% -0,5% tetrossido di osmio per 20 min in 0,1 M tampone sodio cacodilato pH 7,4 o 0,1 M tampone fosfato a pH 7,4.
    NOTA: si consiglia di utilizzare la concentrazione più bassa possibile di tetrossido di osmio necessario per stabilizzare le membrane. Poiché i precipitati DAB polimerizzate presentano un'alta densità di azoto, che può essere rilevata direttamente da ESI, un forteosmio colorazione non è necessario per identificare la proteina miniSOG-tag e potrebbe essere dannoso per la ESI. Tetrossido di osmio è molto tossica! Lavorare in una cappa aspirante e smaltire adeguatamente i rifiuti tossici.
  11. Disidratare le cellule attraverso una serie di etanolo usando 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% etanolo (passaggi ogni 5 min). Successivamente, incubare le cellule in una miscela 1: 1 di etanolo al 100% e resina acrilica (LR bianco) e mettere il piatto su un agitatore per 4 ore per facilitare l'infiltrazione nelle cellule prima incubando le cellule per almeno un altro 4 ore a 100 resina acrilica% (LR bianco).
  12. Per polimerizzare la resina, tagliare il coperchio di una etichetta provetta 2 ml con una lama di rasoio e rivestire il cerchio con acceleratore resina acrilica. Assicurarsi che l'acceleratore copre solo il cerchio e non scorre nel tubo. Successivamente, compilare accuratamente il tubo di circa due terzi con resina LR bianco con una pipetta Pasteur. Fare attenzione che la resina non entrare in contatto with l'acceleratore sul cerchio!
  13. Rimuovere la resina che infiltrato le cellule nel piatto e posizionare il piatto capovolto sul tubo microcentrifuga permanente posizione verticale in modo che la larghezza del tubo riempie quasi completamente la finestra di osservazione di vetro rivestita del piatto.
  14. Attendere 1 per 2 min per l'acceleratore per sigillare il tubo e il vetrino, poi invertire il tubo in modo che la resina nel tubo ora copre le cellule.
  15. Porre la capsula con il tubo in un forno a 60 ° C e curare per 12 hr.
  16. Quando il blocco viene guarito, rimuovere il piatto con la resina-riempito provetta attaccata dal forno e separare la provetta dal piatto. Facilitare la separazione dai cicli di gelo e disgelo in azoto liquido e acqua calda.
  17. Eliminare il piatto fondo di vetro e tagliare con attenzione aprire la provetta con una lametta per rimuovere il blocco.
  18. Etichettare il blocco con un pennarello indelebile.
  19. Utilizzare una lama di rasoio per trim il blocco in modo che solo la regione 1 mm 2 che contiene l'area precedentemente segnato con la penna diamante o tungsteno (o contiene l'area con le cellule di interesse) rimane.
  20. Montare il blocco in un ultramicrotomo, tagliare il blocco con un coltello taglio e tagliare sezioni ultrasottili di circa 50 nm con un coltello di diamante.
  21. Raccogliete le sezioni ad alta trasmissione 300 reti mesh. Queste griglie sono molto piccoli bar griglia e coprono quindi un minor numero di cellule nella zona di interesse.
  22. Cappotto sezioni sulle griglie con circa 0,2-0,4 nm di carbonio utilizzando un dispositivo a induzione di carbonio per aiutarli a stabilizzare sotto il fascio di elettroni del TEM.

5. Microscopia Elettronica

  1. Caricare le griglie in un TEM che è dotato di un filtro di energia. Dopo aver sintonizzato il microscopio e il filtro di energia in base alle istruzioni del fabbricante, controllare le celle delle sezioni in modalità basso ingrandimento (trasmissione normale) e confrontareloro di fluorescenza dei dati quando opportuno (ottenuto nel passaggio 4.4).
  2. Una volta che un nucleo con caratteristiche interessanti (danni al DNA delle tracce o riparazione del DNA foci) viene trovato, passare alla modalità di filtraggio energia e registrare una mappa di spessore.
    NOTA: Questa procedura include la registrazione di una perdita zero e un'immagine non filtrata. Spessori fino a 0,3 cammino libero medio (30% degli elettroni del fascio incidente viene dispersa dal campione) sono abbastanza sottile per generare buone mappe elementari.
  3. Mappe rapporto record di fosforo e azoto elementi utilizzando il software che controlla il filtro energia del microscopio utilizzato. Registrare le immagini successive fosforo mappa giuntati a 175 eV perdita di energia con una larghezza di 20 eV feritoia e pre-edge immagini a 120 eV perdita di energia, anche con una larghezza di 20 eV feritoia. Per le mappe di azoto, registrare immagini successive giuntati a 447 eV con fenditura di 35 eV e pre-edge immagini a 358 eV, anche con una larghezza di 35 eV feritoia.
    NOTA: Poiché il contenuto degli elementi di immagine (phosphOrus e azoto) è relativamente bassa (circa. 1%), scegliere "Rapporto Immagine" (qualitativa mappa elementale) sopra il "metodo 3 finestra" (quantificare mappa elementale) al fine di generare immagini con un segnale migliore di rumore.

Elaborazione 6. Immagine

  1. Aprire le mappe rapporto elementari in un software di elaborazione delle immagini in grado di gestire il formato file delle immagini acquisite (ad esempio, Digital Micrograph). Copiare la mappa azoto nel canale rosso e la mappa di fosforo nel canale verde di un'immagine RGB, sovrapporre e allineare le mappe.
  2. Esportare l'immagine composita come un file di formato di file di immagine con tag (TIFF). Apri l'immagine con un software di elaborazione di immagini che può utilizzare strati (ad esempio, Photoshop).
  3. Regolare la gamma dinamica di ciascun canale di riscalare i valori minimo e nell'immagine di un set di dati a 8 bit (da 0 a 255).
  4. Sottrarre il fosforo dalla mappa di azoto (utilizzando laFinestra "livelli") al fine di generare una mappa qualitativa che mostra la distribuzione delle proteine.
  5. Convertire le mappe del acido nucleico (fosforo) e proteine ​​(azoto) creato nella fase precedente in "scala di colore" e creare una tabella di ricerca gialla nello spazio colore CMYK per la mappa che mostra la distribuzione degli acidi nucleici e un tavolo ciano di ricerca per visualizzare la carta non nucleoproteina. I colori sono scelti per generare il massimo contrasto tra le due mappe elementari.
  6. Creare una nuova immagine e importare i mappe che mostrano le distribuzioni di fosforo e proteine ​​come diversi strati. Utilizzare la modalità di trasparenza "schermo" per vedere entrambi gli strati sovrapposti l'uno sull'altro.
  7. Aprite l'immagine a perdita zero acquisito nel passaggio 5.2. Questa immagine rappresenta un'immagine dell'area registrata che assomiglia un'immagine TEM convenzionale, ma contiene solo gli elettroni che sono passati attraverso il campione senza urtare il campione. Esportazionequesta immagine come immagine TIFF.
  8. Aprite l'immagine perdita pari a zero esportato in un editor di foto e copiarlo nella strato superiore della immagine che mostra la mappa elementare. Allineare l'immagine utilizzando la modalità di trasparenza "schermo".
  9. Facoltativamente soglia dell'immagine perdita zero per segmentare il segnale che proviene dal miniSOG. Aggiungere l'immagine risultante come livello separato come descritto sopra.

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Risultati

ESI

Confrontando le immagini ESI del nucleo (figura 1) con le immagini TEM convenzionali (ad esempio, la Figura 7-1) rivela un drammatico aumento strutture anatomiche che possono essere facilmente distinguibili. Le creste cromatina appaiono in giallo ed è abbastanza facile identificare le chromocenters in cellule di topo. Nucleoli può essere facilmente distinta dalla cromatina dalla loro struttura rotonda e colore diverso, dal momen...

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Discussione

ESI può servire come un ottimo strumento per l'esame diversi stati di cromatina e ribonucleoproteine ​​nel nucleo, perché è in grado di mappare in particolare le aree che sono ricchi di fosforo. Essa aumenta profondamente la quantità di dettagli che può essere ottenuta con un microscopio elettronico e non dipende opposti metodi non specifici. Uno svantaggio di ESI è che richiede sezioni sottili di TEM convenzionale alla stessa tensione di accelerazione. Questo può essere superato lavorando con sezioni seriali o con ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. Roger Tsien per averci fornito i costrutti miniSOG. Dr. Xuejun Sun per l'aiuto con il TEM. Lisa Lem e Peter Shipple del Cross Cancer Institute per la fornitura di ossigeno. Hilmar Strickfaden è titolare di una borsa di studio post-dottorato presso l'Alberta Cancer Foundation ed è stata sostenuta dalla Bayrische Forschungsallianz. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Canadian Institutes of Health Research e dell'Alberta Cancer Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre con fondo in vetro da 35 mmMatTekP35G-1.5-14-C
Piastre con fondo in vetro da 35 mmgrigliate MatTekP35G-2-14-CGRD Non realizzato per obiettivi ad immersione
LR Bianco: resina acrilicaemsdiasum14381
LR Bianco acceleratoreemsdiasum14385
3,3′-Diaminobenzidina tetracloridrato 10 mg compresseSigmaD5905
Slim Bar Grids 300 MeshSPI1161123
Tungsten-Point Lab Penemsdiasum41148
Tetrossido di osmioemsdiasum19100
Carbon Coater 208 carbonCressington
Ultra microtome Leica EM UC6Leica
Photoshop CS5Adobepotrebbe funzionare anche con le versioni precedenti
Digital Micrograph V.2.30Gatanpotrebbe funzionare anche con le versioni precedenti
Hoechst 33342SigmaH-1399
EffecteneQuiagen
MiniSOG-ConstructsTsien-Labtsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesio 137 sorgente di radiazioni "MARCO 1" ( J.L. Shepherd & Associato)
ImageJ/FiJiopen sourcehttp://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubiFisherbrand05-408-146
Coltello diamantato ultra 35°diatomee
ultratrimDiatomee
Cacodilato di sodio triidratoemsdiasum12300Attenzione Tossico!
Glutaraldeide EM Grado 8%emsdiasum16020Attenzione Tossico!
Sodio fosfato bibasicoemsdiasum21180
Sodio fosfato monobasicoemsdiasum21190
Paraformaldeideemsdiasum19202
Tetrossido di osmio 4% soluzioneemsdiasum19150
Micoscopio a fluorescenza invertita Axiovert 200MZeiss
AcidocloridricoFisherbrandA142-212
Soluzione di idrossido di sodio 10MFluka72068
OssigenoMedigas
3-Ammino-1,2,4-triazoloSigmaA8056
Cianuro di potassioSigma207810Attenzione Tossico!
Etanoloemsdiasum15058Attenzione Tossico!
Lama di rasoio Single Edge in acciaio al carbonioemsdiasum71960Attenzione Sharp!
DMEMSigmaD 5546
FBSLife Technologies16000-044
G418Life Technologies11811-023
DMSOSigmaD2650
Microscopio elettronico a trasmissione 200 kVJEOL2100
GIF Tridiem 863 Filtro energeticoGatan
Coltello da taglio per

Riferimenti

  1. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
  2. Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
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