Caratterizzazione di metabolica Stato a non umani Primati con il endovenosa glucosio test di tolleranza

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è quello di presentare un metodo standard per eseguire test orale di tolleranza al glucosio per via endovenosa (IVGTTs) per valutare il controllo glicemico nei primati non umani e valutare il loro stato metabolico da sano a dismetabolica.

Abstract

Il test di tolleranza al glucosio per via endovenosa (IVGTT) svolge un ruolo chiave nella caratterizzazione di omeostasi del glucosio. Quando prese insieme con i profili sierici biochimici, comprensivo dei livelli di glucosio nel sangue sia la Fed e digiunato stato, HbA1c, i livelli di insulina, la storia clinica di dieta, la composizione corporea, e lo stato di peso corporeo, una valutazione del controllo glicemico normale e anormale può essere fatto . Interpretazione di un IVGTT avviene attraverso la misurazione delle variazioni dei livelli di glucosio e insulina nel tempo in relazione alla sfida destrosio. I componenti critici da considerare sono: i livelli di picco di glucosio e di insulina raggiunti in relazione a T0 (termine dell'infusione di glucosio), il tasso di clearance del glucosio K derivato dal versante della clearance del glucosio rapida nei primi 20 minuti (T1 a T20), il tempo per tornare al basale del glucosio, e l'area sotto la curva (AUC). Queste misure IVGTT mostrerà cambiamenti caratteristici come mosse omeostasi del glucosio da un t sanoOA malata stato metabolico ^5. Qui descriveremo la caratterizzazione dei primati non umani (Rhesus e Cynomolgus macachi), che sono il modello più rilevante degli animali di diabete di tipo II (T2D) negli esseri umani e la IVGTT e profili clinici di questi animali da un magro sano, a dismetabolica obesi, e lo stato ^{8, 10, 11} T2D.

Introduzione

Il IVGTT è un saggio funzionale conveniente che viene normalmente utilizzato per determinare la funzione β-cellule nell'uomo a diversi stati metaboliche ^{5, 7.} In modelli animali di DT2, è ben riconosciuto come uno strumento per caratterizzare animali che mostrano progressione della malattia metabolica una sana ad un dismetabolica stato hyperglycemic ^{8, 9.} Il modello animale più vicino di T2D è dimostrata nei primati non umani (NHPs), di cui rhesus e cynomolgus macachi sono esempi notevoli. Questi animali naturalmente sviluppano T2D con gli stessi fattori di rischio di età e obesità contribuendo alla sua incidenza come negli esseri umani ^10. Inoltre, vi è una progressione della malattia simile e patologia del pancreas che mostra depositi di amiloide come la malattia progredisce dismetabolici ^11.

Qui riportiamo sul nostro metodo standard di esecuzione di un IVGTT in primati non umani come parte della nostra colonia caratterizzazione dello stato metabolico in questi animali. Questo metodo èfacile da eseguire rispetto ad altri, più lunga e costose tecniche ^2. Il IVGTT è utile per caratterizzare una grande colonia di animali rapidamente e frequentemente. Quando prese in considerazione il livello di emoglobina glicata (HbA1C), storia dieta e l'assunzione di cibo dell'animale, nonché la loro magra massa grassa e corporeo per cento, il IVGTT è normalmente sufficiente per caratterizzare stato metabolico di un animale e la progressione verso il diabete conclamato ^{6 , 8.}

HbA1C rappresenta il livello medio glicemico durante la vita di un globulo rosso, fornendo una misura affidabile dei livelli di glucosio nel corso degli ultimi sei settimane a tre mesi. Misurato dal campione di sangue al basale a digiuno del IVGTT, questo valore fornisce una finestra nel controllo glicemico durante i mesi tra procedure. Se l'animale è passata da dismetabolica per diabetici dalla loro ultima IVGTT, un valore di HbA1C molto superiore al loro valore precedente indicherebbeche la transizione è iniziata subito dopo il loro ultimo IVGTT, mentre, un valore di HbA1c più vicino al loro valore precedente indicherebbe che hanno solo di recente la transizione. In generale, nei macachi rhesus, HbA1C valori superiori al 6% sono considerati anomali, e indicare scarso controllo glicemico ^{10, 23.}

glicemia devono essere interpretate nel contesto del comportamento e della salute generale dell'animale nel suo complesso. macachi diabetici - come gli esseri umani - mostra iperfagia, polidipsia, poliuria e. alloggiamento gruppo di animali fornisce sfide significative per la misurazione di questi indicatori e la cura individuale necessari per dismetaboliche e scimmie diabetiche. Si consiglia singolarmente accogliere gli animali in modo che la cura più personalizzata può essere fornito, e gli indicatori comportamentali della salute della scimmia più facilmente essere monitorato ^8. Inoltre, macachi diabetici esporrà perdita di peso, nonché un profilo lipidico elevata (maggiorecolesterolo, ipertrigliceridemia) e del metabolismo minerale disturbato nella chimica del siero. E 'importante misurare i marcatori di funzionalità epatica e renale in chimica del siero, i danni a questi organi sono spesso complicazioni di avanzare metabolica disturbo / diabete, e può essere co-determinanti della glicemia, lipidi e gli squilibri minerali ^{9, 11, 18, 24} .

Con questo metodo, i valori storici generati da più, caratterizzazioni frequenti durante la vita di una scimmia sono di particolare pregio. Se altre procedure, come un morsetto di glucosio o assortite infusione di glucosio (GGI), sono necessari per valutare pienamente la salute di un animale, è comunemente dopo caratterizzazione iniziale quando la loro storia non è più disponibile. Tuttavia, una volta che una linea di base è stato stabilito, ripetuti IVGTTs di una frequenza di ogni tre mesi sono normalmente sufficienti per monitorare i progressi di un animale. Ciò è particolarmente importante quando gli animali sono arruolati in più studi tutta unaanno solare in base alla loro stato metabolico. Mentre la loro salute può rimanere relativamente stabile per anni alla volta, quando lo stato metabolico di un animale peggiora, un drammatico aumento nella resistenza all'insulina e intolleranza al glucosio può verificarsi molto rapidamente. I valori di HbA1C consentono per alcuni interpolazione del declino o il miglioramento dello stato di salute dell'animale, fra le procedure previste tre mesi. Per questa ragione, questo metodo è ideale per la caratterizzazione animali utilizzati in diversi studi longitudinali nel corso della loro vita naturale.

Protocollo

Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal David H. Murdock Research Institute IACUC trova nel campus North Carolina Research (NCRC), in base al protocollo 14-017, Caratterizzazione di un modello di primate non umano di diabete e prediabete / insulino-resistenza e l'efficacia di terapie per migliorare la sensibilità all'insulina e la funzione metabolica.

1. Selezione degli animali e Studio Preparazione

1. Selezionare la dieta e il peso degli animali stabili sulla base delle registrazioni mensili assunzione di cibo e il peso corporeo.
   NOTA: Gli animali che hanno presentato una recente diminuzione dell'appetito non dovrebbero essere caratterizzati fino alla loro assunzione di cibo si è stabilizzata.
   1. Per gli animali maturi (> 5 - 6 anni), non selezionare animali il cui peso tra mesi consecutivi corpo differire di oltre il 10% senza prima esaminare la scimmia e escludere altre cause che cambiare lo stato metabolico per il drammatico cambiamento di peso.
2. Per glucosio, insulina e C-Peptide analiti, preparano provette per il prelievo del campione ₂ EDTA K con inibitore della proteasi (Aprotinina e DPP4I).
   NOTA: Il cocktail DPP4I + Aprotinin fornisce un ampio spettro di inibizione della proteasi questo dovrebbe essere richiesto per analiti aggiuntivi (glucagone, GLP-1). Nel caso in cui analiti aggiuntivi non sono raccolti, i tubi del sangue dovrebbero essere preparati nello stesso modo per mantenere la coerenza nella raccolta dei campioni. I campioni per le analisi non convalidati per questo metodo devono essere raccolti separatamente, secondo le raccomandazioni del costruttore.
   1. Preparare il cocktail inibitore della proteasi mescolando 100 mg liofilizzato Aprotinin con 10 ml di DPP4I. Aggiungere 10 ml di miscela di aprotinina + DPP4I a ciascun tubo di sangue per ogni millilitro di sangue raccolto.
   2. Aggiungere un ulteriore 10 ml di cocktail di inibitori delle proteasi in ogni provetta per un possibile eccedenza di raccolta. Conservare le provette-sangue trattata a -20 ° C fino al momento dell'uso. Mantenere i tubi in ghiaccio durante la Operazinuovamente e girare a 4 ° C.
   3. Utilizzare un tubo di separazione del siero per raccogliere un campione di sangue al basale per l'analisi di serie ematochimiche. Per il completo conta dei leucociti (CBC), utilizzare uno standard K ₂ EDTA, senza inibitori della proteasi. Utilizzare cryovials a plasma aliquota e siero dopo che i campioni di sangue sono stati filata verso il basso.
   4. Etichettare i tubi di sangue e le cryovials adeguatamente con l'identificazione degli animali, la data, procedura, timepoint, e il volume del campione. Etichettare i cryovials con l'analita (s) nel plasma per il dosaggio appropriato.
3. Preparare la soluzione fisiologica eparinizzata iniettando 0,15 ml di 1.000 unità USP per eparina ml in una sacca da 250 ml di soluzione fisiologica. Ottenere una soluzione di 0,06 mg di eparina / ml. Disegnare 40 - 60 ml di questa soluzione in una serratura salina per il lavaggio tra i campioni. Disegnare un ulteriore 1 ml e 5 ml in siringhe separate per lavaggio la porta di infusione di destrosio prima e dopo l'infusione, rispettivamente.

2.La sedazione degli animali e preparazione

1. Rimuovere cibo dalla gabbia dell'animale non meno di 14 ore prima della procedura, e non più di 18 ore.
   NOTA: È importante che gli animali lasciati a digiuno per la procedura per evitare ogni variazione post-prandiale in valori glicemici. E 'anche una precauzione per evitare rigurgito e aspirazione del contenuto dello stomaco mentre anestetizzato.
2. animali sedare per la durata della procedura di IVGTT con ketamina somministrato per via intramuscolare come un anestetico generale, a 10 mg / kg. Somministrare ulteriori ketamina (5 - 10 mg / kg) ad intervalli di 20 - 30 minuti, o quando necessario, durante la procedura.
   1. Pesare l'animale sedato. Posto l'animale in una posizione lateralmente reclinata su un tavolo procedimento riscaldata.
   2. Monitorare parametri clinici ogni 15 a 20 minuti per garantire l'animale è in un piano stabile di anestesia. Misurare la frequenza cardiaca (100 - 200 bpm) e SPO ₂ (> 92%), con un pulsossimetro. Misurare la frequenza respiratoria (20 - 50 respiri / min) w esimo un cronometro, contando respirazioni visivamente oppure a mano più di quindici secondi e moltiplicando per quattro. misurare la temperatura (> 97 ° C) per via rettale. Monitorare il colore della mucosa intorno la gomma e labbri (umide, rosa).
3. Preparare due siti cannula. Utilizzare tosatrici per tagliare i capelli dalla zona di interesse in cui verrà inserito il catetere, e sterilizzare l'intera regione, con alternanza di macchie di clorexidina e il 70% di alcol.
   1. Mettere una catetere nella regione delle vene sinistro o destro o cefalica safena e allegarlo a un filo eparina salina (0,06 mg di eparina / ml) con una valvola a tre vie. Questo è il sito prelievo di sangue campionamento.
   2. Posizionare il secondo catetere in un'altra gamba o un braccio nella regione delle vene cefaliche o safena e allegare una porta. Usare questo sito per l'infusione di destrosio. Utilizzare un piccolo, 1 ml di soluzione fisiologica eparinizzata a filo per mantenere il brevetto cannula prima dell'infusione destrosio.

e_title "> 3. Procedura IVGTT

NOTA: La procedura IVGTT è composto da 8 campionamento prelievo di sangue time-punti (Tabella 1).

1. Prendere il campione di riferimento e utilizzare un glucometro tenuto in mano per misurare il livello di glicemia a digiuno. Ottenere un campione di siero per l'analisi chimica standard così come un campione di sangue intero per un CBC per valutare la salute generale dell'animale. Raccogliere campioni di plasma per saggiare i livelli di glucosio e di insulina dal campione di riferimento utilizzando un kit convalidato per l'uso con macachi come da istruzioni del produttore ^{8, 9.}
   NOTA: È importante avere un pre-draw di 0,5 ml prelevati dalla cannula prima di prendere qualsiasi campione per la raccolta di sangue per rimuovere il sangue residuo o eparina nello spazio morto della cannula.
2. Dopo aver ottenuto il campione di riferimento, infondere la dose di destrosio al 50% (250 mg / kg) più di 30 secondi nella porta di infusione di destrosio.
   NOTA: modelli dose più alta (500 mg / kg) possono essere utilizzati,anche se la dose deve essere fissato attraverso procedure al fine di fare confronti longitudinali.
   1. Lavare la porta per infusione con 5 ml di soluzione fisiologica eparinizzata per assicurarsi che non vi sia destrosio sinistra in porto. Il termine dell'infusione è il T0. Avere il tecnico sostituire i guanti, come il destrosio residua dalla infusione può contaminare i successivi campioni di sangue.
3. Il primo punto tempo di campionamento post-infusione è a T3 min, dalla fine dell'infusione destrosio, seguita da T5 min, T7 min, T10 min, T15 min, T20 min, e l'ultimo punto tempo di campionamento è a T30 min. Raccogliere il plasma da ogni timepoint a livelli di glucosio test e di insulina con il campione di riferimento (vedi punto 3.1).
   1. Al T3 min punto di tempo, utilizzare il glucometro tenuto in mano per controllare ancora una volta il livello di glucosio nel sangue.
      NOTA: Le letture glucometro al basale e T3 sono solo per confermare l'infusione del glucosio. al T3 min punto di tempo il livello di glucosio nel sangue dovrebbe essere ~ 100 mg / dl più alto compared al digiuno di base di glucosio nel plasma livello.

4. il recupero degli animali e Sample Processing

1. Rimuovere le cannule e applicare pressione ai siti cateterizzati per emostasi dopo il T30 min time-point. Monitorare l'animale fino a che non ha ripreso conoscenza ed è seduto. alimentazione offerta una volta che l'animale è completamente recuperato.
2. Porre immediatamente ogni campione di sangue intero in K ₂ tubi EDTA su ghiaccio. Centrifugare a 3.000 rpm ad una temperatura di 4 ° C entro 10 minuti di raccolta. campioni Aliquota di plasma in cryovials, congelare e conservare a -80 ° C fino al momento dell'analisi.
   1. Lasciare il sangue nel tubo siero per analisi standard di chimica siero riposare a temperatura ambiente per non meno di 20 minuti e non più di 30 minuti prima della centrifugazione a 3000 rpm a temperatura ambiente. Congelare i campioni di siero fino analizzati entro 48 ore di raccolta.
      NOTA: refrigerare il campioni di sangue intero raccolti per analisi CBC fino comesayed entro 24 ore di raccolta.

5. Il trattamento dei dati

1. Dopo aver stabilito le curve plasmatici di insulina e glucosio, determinare il tasso di clearance del glucosio K dalla pendenza del logaritmo naturale di valori di glucosio di cui sopra della linea di base ^{16, 17.}
   NOTA: Un NHP sana può essere dovrebbe avere un tasso di clearance del glucosio K ben al di sopra 1, spesso superiore a 2 o più, come un animale sano spesso tornare ai valori di glucosio basali entro 30 min. Poiché la produzione di insulina cade, il tasso di clearance del glucosio K scenderà più drammaticamente, al di sotto 1.
2. Calcolare la AUC nel suo complesso, come somma dei totali della zona dei trapezi rappresentano l'area sotto la curva di ogni segmento di linea tra punti temporali, attraverso T30 ^{16, 17.}
   NOTA: Tradizionalmente, l'AUC dei primi dieci minuti della procedura è considerato il acute risposta insulinica al glucosio (AIR), mentre l'AUC dall'ultimo 20 min della procedura è considerata la risposta tardiva insulina (LIR). Come l'animale diventa più dismetabolica, l'AUC insulina aumenta, riflettendo la compensazione per l'aumento di insulina insensibilità. Poiché le transizioni animali al diabete conclamato, tuttavia, l'AUC diminuirà, spesso inizialmente nella fase acuta di insulina, catturato dalla AIR.

Risultati

I risultati mostrati nella Figura 1 sono dimostrative di glucosio e di insulina curve tipiche maturi, sani e diabetici macachi Cynomolgus nel corso di un 30 min IVGTT. I dati provenienti da scimmie diabetiche sane e avanzate sono mostrati al fine di contrastare le ovvie differenze tra gli animali da entrambe le estremità estreme della gamma di caratterizzazione metabolica. Questo protocollo IVGTT è stato usato con successo da in macachi Rhesus con risultati simili gli au...

Discussione

Il IVGTT valuta la capacità di rilascio di insulina glucosio-stimolata da una singola infusione di destrosio base al peso corporeo ^{5, 12, 13.} Dal test, il livello di glucosio nel sangue a digiuno e il livello di insulina è raggiunta, e permette una valutazione della capacità degli animali alla rilascio di insulina e restituire il livello di glucosio elevata nei confronti della linea di base. Questo fornisce all'utente informazioni per caratterizzare l'animale come un livello normale e controllo sano l...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Allegra X-15R Centrifuga			al plasma: 4 ° C a 3.000 giri/min per 10 min
Siero per centrifuga			: 22 ° C a 3.000 giri/min per 10 min
Thermo Scientific -86 ° C Congelatore, serie Forma 88000	Modello: 88500A
			I.V. D50
2 x 2	Midwest Veterinary Suppy	366.23000.4	Usato a secco, con 70% di alcol e 2% di soluzione di clororex
4 ml di provette per separatore di siero	Provetta per la raccolta del sangue	Midwest Veterinary Supply	366.45000.4
K2EDTA, 2 ml	VWR	95057-239	provette per la raccolta del sangue
Aprotinina, 100 mg	Sigma	A1153-100MG	per la raccolta del sangue additivo per proteasi
22 G x 1" Cateteri	Midwest Veterinary Suppy	193.75250.2	Catetere per via endovenosa
Tappo di iniezione con tappo	Midwest Veterinary Suppy	001.11500.2	%50 porta per infusione di destrosio
Nastro poroso, 1/2" x 10 yd	Midwest Veterinary Suppy	001.85000.2	mantiene l'aderenza dei cateteri e dell'epatite. Serrature
Soluzione di clorexidina 2%	Midwest Veterinary Suppy	193.08855.3	sito del catetere di preparazione
70% Etanolo	VWR	71001-654	sito del catetere di preparazione
laccio emostatico	Webster	07-8003432
rubinetto a 3 vie	Midwest Veterinary Supply	366.28510.4
set di prolunga da 37"	Webster	07-8454200	Exel
50-60cc LL Siringhe	Midwest Veterinary Suppy	001.12250.2	Soluzione salina eparinizzata Flush
250 ml Sacca 0,9% soluzione salina	Webster	07-8365593	Flush
1.000 U Eparina, 10 ml	Webster	07-883-4916
Ketamina (Ketaset) 100  mg / ml	Fort Dodge	(AV ordinato)
Strisce reattive per glucosio Precision Xtra 50 / bx	Abbott (American Diabetes Wholesale)	9381599728K7	test baseline / livelli di glucosio nel sangue T3
Masimo Rad 57	DRE	6052057V	pulsossimetro
Pavia termometro rettale	Patterson	07-8391335
Glucometro Precision Xtra	Abbott	9381599728K7	Glucometro portatile