Method Article

A High Yield e Cost-efficient Sistema Espressione di granzimi umane in cellule di mammifero

DOI:

10.3791/52911

⸱

June 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Medicine Program, Boston Children’s Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Medicine, University of Fribourg, 3Centre Médical Universitaire, University of Geneva

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo qui un sistema di espressione granzima efficiente in termini di costi utilizzando cellule HEK293T che produce alte rese di proteasi pura, completamente glicosilata ed enzimaticamente attiva.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quando i linfociti T citotossici (CTL) o le cellule natural killer (NK) riconoscono le cellule tumorali o le cellule infettate da patogeni intracellulari, rilasciano il loro contenuto di granuli citotossici per eliminare le cellule bersaglio e il patogeno intracellulare. La morte delle cellule ospiti e dei patogeni intracellulari è innescata dalle granuli di serina proteasi, granzimi (Gzms), trasportate nel citosol della cellula ospite dalla proteina che forma i pori perforina (PFN) e nei patogeni batterici dalla proteina procariotica che distrugge la membrana procariotica granulisina (GNLY). Per studiare i meccanismi molecolari di morte cellulare bersaglio mediata dai Gzms in contesti sperimentali in vitro, sono necessari sistemi di espressione e purificazione proteica che producono elevate quantità di enzimi attivi. I sistemi di espressione proteica secreta nei mammiferi implicano il potenziale per produrre proteine correttamente ripiegate e completamente funzionali che subiscono modifiche post-traduzionali, come la glicosilazione. Pertanto, abbiamo utilizzato un metodo di precipitazione del calcio efficiente in termini di costi per la trasfezione transitoria di cellule HEK293T con Gzm umani clonati nel plasmide di espressione pHLsec. La purificazione del Gzm dal surnatante di coltura è stata ottenuta mediante cromatografia di affinità con nichel immobilizzato utilizzando il tag di poliistidina C-terminale fornito dal vettore. L'inserimento di un sito enterokinasi all'N-terminale della proteina ha permesso la generazione di proteasi attiva che è stata infine purificata mediante cromatografia a scambio cationico. Il sistema è stato testato producendo alti livelli di Gzm umano citotossico A, B e M e dovrebbe essere in grado di produrre praticamente ogni enzima nel corpo umano ad alte rese.

Introduction

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I Gzms sono una famiglia di serina proteasi altamente omologhi localizzate nei lisosomi specializzati di CTL e cellule NK 1. I granuli citotossici di queste cellule killer contengono anche i-membrana interrompere proteine ​​PFN e GNLY che vengono rilasciati contemporaneamente alle Gzms accreditato in una cella di destinazione destinata per l'eliminazione 2,3. Ci sono cinque Gzms nell'uomo (GzmA, B, H, K e M), e 10 Gzms nei topi (GzmA - G, K, M e N). GzmA e GzmB sono i più abbondanti e ampiamente studiati sugli esseri umani e nei topi 1. Tuttavia, studi più recenti hanno cominciato a studiare le vie di morte cellulare e gli effetti biologici supplementari mediati dalle altre, cosiddette Gzms orfani in materia di salute e di malattia 4.

La funzione più nota delle Gzms, in particolare di GzmA e GzmB, è l'induzione della morte cellulare programmata in cellule di mammifero quando espresso nelle cellule bersaglio da parte PFN 5,6. Tuttavia, Studi più recenti hanno anche dimostrato effetti extracellulari dei Gzms con profondo impatto sulla regolazione immunitaria e infiammazione, indipendentemente dalla consegna citosolica da PFN 7,8. Lo spettro di cellule che vengono uccisi in modo efficace dopo l'entrata citosolico dei Gzms è stato recentemente ampliato da cellule di mammifero a batteri 9,10 e anche alcuni parassiti 11. Queste scoperte recenti aperto un campo completamente nuovo per i ricercatori GZM. Pertanto, un alto rendimento del sistema di espressione mammifero economicamente efficiente faciliterà notevolmente la strada a tali studi futuri.

Umani, topi e ratti Gzms nativi sono stati purificati con successo dalla frazione granello di CTL e NK cellule linee 12-14. Tuttavia, nelle nostre mani il rendimento di tali tecniche di purificazione è nella gamma di cultura inferiore a 0,1 mg / L cella (osservazioni non pubblicate e 12). Inoltre, la risoluzione cromatografica di un singolo GZM senza contaminazione da other Gzms e / o proteine ​​che sono presenti anche nei granuli è impegnativo (dati inediti e 12,14). Gzms ricombinanti sono state prodotte in batteri, lieviti 15 16, cellule di insetto 17 e in anche in cellule di mammifero, come HEK 293 18,19. Solo i sistemi di espressione di mammifero portano il potenziale di produrre enzimi ricombinanti con modificazioni post-identico alla proteina citotossica nativo. Modificazioni post-traduzionali sono stati implicati con l'assorbimento specifico per endocitosi e la localizzazione intracellulare della proteasi all'interno delle cellule bersaglio 20-22. Pertanto, utilizzando pHLsec 23 (un gentile dono di Radu Aricescu e Yvonne Jones, dell'Università di Oxford, Regno Unito) come spina dorsale plasmide per l'espressione GZM, abbiamo istituito un sistema semplice, tempo e conveniente per alto rendimento produzione di proteine ​​in HEK293T cellule. pHLsec combina un esaltatore di CMV con un pollo Β-actina promotore; insieme, questi elementi dimoted il più forte promotore attività in varie linee cellulari 24. Inoltre, il plasmide contiene un coniglio Β-globina introne, segnali Kozak e secrezione ottimizzati, a-6xHis-tag Lys e un poli-A segnale. Gli inserti possono essere clonate convenientemente tra il segnale di secrezione e Lys-6xHis-tag (Figura 1) assicurando espressione ottimale e efficienza secrezione di proteine ​​prive appropriate domini N-terminali. Per l'espressione delle Gzms, abbiamo sostituito la sequenza segnale di secrezione endogena con il segnale di secrezione fornito dal vettore seguito da un enterokinase (EK) sito (DDDDK) in modo che il trattamento EK attivato il Gzms secrete (Gzms attivi iniziare con N-terminale sequenza aminoacidica IIGG 25). Inoltre, a favore di questo metodo, le cellule HEK293T crescono rapidamente in basso prezzo medio, come Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM), e sono adatti per il calcio-fosfato metodo trasfezione conveniente.

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Protocol

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1. Produzione del plasmide espressione pHLsec-GZM

  1. Preparare RNA totale da cellule NK umane (cellule primarie preparato come al 26 o la linea delle cellule NK NK-92 che esprimono tutte le cinque Gzms umane), utilizzando un metodo di isolamento RNA adatto e invertire trascrivere con un primo filamento kit cDNA sintetizzare, a seguito della manufacturer` raccomandazioni s. Amplificare GZM cDNA usando la PCR e clonazione in pHLsec come descritto in 23 (gentile dono di Radu Aricescu e Yvonne Jones, dell'Università di Oxford, Regno Unito) utilizzando i siti AGEI e KpnI (Figura 1).
    NOTA: Utilizzare i seguenti primer indicati nella tabella 1.
  2. Confermare inserti corretti di sequenziamento. Espandere i plasmidi di espressione nelle cellule DH5α e purificare utilizzando un kit di isolamento plasmide privo di endotossine e seguire le istruzioni del produttore.
  3. Risospendere i plasmidi purificati in privo di endotossine, acqua sterile ad una concentrazione di 2 mg / ml e conservare a -20 ° C untiuso l.

2. Espressione dei Gzms nelle cellule HEK293T

  1. Preparazione dei reagenti
    1. Preparare terreno di coltura standard. Per di Dulbecco modificato (DMEM) contenente alte concentrazioni di glucosio (25 mm), Glutamax (4 mm), piruvato di sodio (1 mm) aggiungere il 10% di siero standard fetale bovino (FCS), la penicillina (100 unità / ml), streptomicina ( 100 mg / ml).
    2. Preparare medio trasfezione. Per mezzo di coltura senza penicillina streptomicina aggiungere 25 mg / ml clorochina (aggiungere appena il giorno della trasfezione da 1,000x scorte in PBS, conservati a -20 ° C).
    3. Preparare mezzo privo di siero cultura: per mezzo privo di siero per HEK293 cellule aggiungono glutamina (4 mm), la penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 mg / ml), e di 2,5 mg / L amfotericina B.
    4. Preparare le soluzioni descritte in Tabella 2 e filtro con un filtro da 0,45 micron prima dell'uso:
  2. Espansione cellule HEK293T
    1. Crescere HEK293T cellule in 20 ml di cultomedio ure con 150 x 25 millimetri piatti di coltura dei tessuti.
    2. Cellule Split a 80% di confluenza (split-rapporto di 1: 4, di solito ogni giorno 3 °). Cellule liberamente allegare, possono essere staccati meccanicamente senza tripsinizzazione rigorosamente pipettando su e giù.
    3. Cellule piastra la sera prima trasfezione per dare il 60-70% di confluenza al giorno di trasfezione (densità di semina ~ 2 x 10 5 cellule / ml). Una dimensione di preparazione al solito composto da 20-25 piatti della cultura.
  3. Fosfato di calcio trasfezione
    1. 1 ora prima della trasfezione, cambiare il terreno di coltura standard per 20 ml di mezzo di trasfezione. Vicino alla fine di questo step 1 ora di incubazione, miscelare 400 mg di DNA plasmidico con 10,95 ml DDH 2 0 e 1,55 ml di 2M CaCl 2 in provette da 50 ml (1 tubo / 5 piatti).
    2. 1 a 2 minuti prima della trasfezione, aggiungere 12,5 ml 2x HBS a 12,5 ml della soluzione di DNA-Calcium, mescolare per inversione dei tubi e incubare per 30 secondi a temperatura ambiente.
    3. Aggiungi the composto preparato in 2.3.2 direttamente alle cellule (5 ml per piatto), goccia a goccia nel mezzo. Spruzzare uniformemente su tutta la superficie, girando il mezzo per un colore leggermente arancione.
    4. Incubare le piastre di coltura per 7 a 11 h in un incubatore di coltura tissutale (37 ° C, 5% CO 2 in aria umidificata). Dopo l'incubazione, un bel precipitato è visibile. Rimuovere il supporto transfezione, lavare accuratamente con PBS preriscaldata e aggiungere 20 ml di terreno di coltura senza siero preparati a 2.1.3. Incubare per 72 ore in un tessuto culturale incubatore.
    5. Analizzare l'efficienza di trasfezione ed espressione eseguendo un campione (~ 20 ml) del surnatante cellulare su SDS-PAGE e colorazione con Coomassie Brilliant Blue per visualizzare una banda granzyme.
  4. Purificazione di Gzms dalla cultura surnatante da Nickel-IMAC
    1. Dopo l'incubazione, decantare il surnatante di colture cellulari in 250 mL e chiaro per centrifugazione. Effettuare un primo giro (400 xg, 10 min, 4 °C) che cancellerà il mezzo da cellule indipendenti. Trasferire il surnatante in freschi 250 ml provette e centrifugare a 4000 xg, 30 min a 4 ° C per rimuovere i detriti rimanenti.
    2. Aggiungere 5 ml di 5 M NaCl, 6,25 ml di 2 M Tris-Base (pH 8) e 1 ml di 0,25 M Niso 4 per 250 ml di surnatante eliminato. Filtrare il surnatante con un gruppo filtro di vuoto 500 ml (0,45 mm).
    3. Equilibrare una colonna Nichel-IMAC con la Sua vincolante tampone A (10 volumi di colonna, CV) utilizzando un sistema FPLC adeguato.
    4. Applicare il surnatante eliminato alla colonna equilibrata ad un flusso di 0,5 ml / min a 4 ° C.
    5. Dopo che è stato applicato il surnatante, lavare colonna con la sua impegnativa buffer finché assorbimento UV linea di base viene raggiunto (di solito 10 CV).
    6. Eluire Gzms con lineare 20 ml gradiente (Da 0 a 250 mM imidazolo) ad una portata di 0,5 ml / min, mentre la raccolta 2 ml-frazioni. Analizzare le frazioni di eluizione di SDS-PAGE e colorazione Coomassie.
  5. Enterokinase (EK)trattamento e pulizia finale mediante cromatografia a scambio cationico
    1. Pool GZM contenenti frazioni in un tubo dialisi con ≤10 MWCO. Conservare un piccolo campione a -20 ° C, come il controllo pre-EK.
    2. Aggiungere EK a 0,02 unità / 50 ml di surnatante iniziale direttamente alla frazione pool nel tubo di dialisi e dializza O / N (almeno 16 ore) a temperatura ambiente in EK-buffer (4 L, cambiamento tampone volta).
    3. Il giorno dopo, analizzare EK trattata Gzms rispetto al pre-EK controllo da SDS-PAGE e colorazione Coomassie.
    4. Quando l'elaborazione N-terminale è completo, cambiare tampone di dialisi a S tampone A (4 L) e dializza per altri 4 ore a RT. Dializzato filtro (0,45 micron).
    5. Equilibrare un S-colonna con tampone A. S Caricare il campione nella colonna ad una velocità di flusso di 0,5 ml / min a 4 ° C.
    6. Dopo il caricamento del campione, lavare la colonna con tampone S A fino UV basale assorbanza viene raggiunta (circa 10 CV). Eluire le Gzms con un gradiente lineare di 30 ml (150 a 1,000 mM NaCl). GzmA eliuti a ~ 650 mM NaCl, GzmB a ~ NaCl 700 mm e GzmM a ~ NaCl 750 mm.
    7. Analizzare le frazioni di eluizione di SDS-PAGE e test colorimetrici (vedi sotto). Pool frazioni contenenti Gzms e concentrato (circa 30 volte, ad una concentrazione di circa 100 mM) in filtri di spin (15 ml, 10 MWCO). Aliquota i preparativi GZM concentrate e conservare a -80 ° C.

Attività 3. Test GZM

  1. Preparazione dei reagenti
    1. Preparare colorimetrico tampone: 50 mm Tris-Base, pH 7.
      1. Per la misura di GzmA, aggiungere Na-CBZ-L-lisina thiobenzyl estere (S-Bzl) (BLT) al tampone ad una concentrazione finale di 0,2 mM e 5,5'-ditio-bis (acido 2-nitrobenzoico) (DTNB) ad una concentrazione di 0,22 mM. Per GzmB, includere 0,2 mm DTNB mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (DAA) e 0,22. Per GzmM, includere 0,2 mm Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (PNA) (AAPL). Peptidi sintetici sono aggiunti da adeguate soluzioni madre (in DMSO, stored a -20 ° C) al buffer appena prima del dosaggio.
    2. Preparare tampone clivaggio: NaCl 100 mM, 50 mM Tris-Base, pH 7.5
  2. Test colorimetrici
    1. Distribuire piccoli campioni GZM (<5 ml) da frazioni di eluizione o stock concentrati nelle piastre a 96 pozzetti a fondo piatto. Includere un controllo positivo (preparati GZM testate o greggio lisati cellulari NK) e un controllo negativo (tampone solo).
    2. Aggiungere 100 ml di tampone a ciascun pozzetto (utilizzando una pipetta multicanale). Incubare per 10 minuti a 37 ° C. Misurare OD a 405 nm in un lettore per micropiastre.
  3. Test Decolleté
    1. Per i saggi scissione utilizzando substrati purificati, co-incubare un substrato proteico (nativa o ricombinante, 100-400 nM; alcuni esempi di substrati GZM efficienti sono presentati nella sezione risultato e nella nota alla fine di questa sezione) con diluizioni seriali di un GZM (a partire da 400 nM) in tampone per varie volte.Analizzare mediante SDS-PAGE e Coomassie o macchie d'argento; o mediante Western blotting utilizzando anticorpi specifici.
    2. Per i saggi scissione utilizzando lisati cellulari, sospendere 10 6 cellule HeLa (o qualsiasi linea cellulare tumorale disponibile) in 1 ml di tampone di saggio e lyse congelando in un / bagno di ghiaccio secco etanolo e scongelamento a 37 ° C per tre volte. Rimuovere detriti cellulari mediante centrifugazione (15.000 xg per 10 min a 4 ° C).
    3. Co-incubare il lisato liquidati con Gzms a diverse concentrazioni e tempi di cui sopra. Cleavage viene rilevata mediante immunoblotting utilizzando anticorpi appropriati.
      NOTA: Alcuni esempi di substrati in buona fede per la quale gli anticorpi commerciali sono disponibili: Offerta (BH3-interagente agonisti morte di dominio) e caspasi 3 spaccati da GzmB 27,28; più ribonucleoproteins nucleari eterogenei (hnRNPA1, A2 e U) spaccati da GzmA 29; citomegalovirus phosphoprotein 71 da GzmM 30.

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Results

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Nella seguente sezione presenteremo una documentazione completa di un preparato GzmA per illuminare il metodo. Abbiamo anche con successo purificati GzmB e GzmM, producendo risultati simili in materia di efficienza e l'attività di depurazione. Tuttavia, da tali preparati più tardi mostreremo solo pochi pezzi selezionati di dati. Preparazioni GzmB dalle cellule 293T seguenti l'attuale protocollo sono stati utilizzati in diversi studi pubblicati, mettendo in evidenza la loro attività in diversi sistemi di dosaggio biologi...

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Discussion

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Il ruolo classico e ampiamente studiato di GzmA e GzmB è l'induzione di apoptosi nelle cellule di mammifero dopo la loro consegna citosolico dal formano pori proteine ​​PFN 1. Recentemente, lo spettro citotossica delle Gzms stato ampliato significativamente da cellule di mammifero ai batteri 9,10, così come a certi parassiti 11. Inoltre, i non classici, funzioni extracellulari di GzmA e GzmB nonché il significato biologico dei vari Gzms orfani sono ancora oscuri. Pertanto, l'espr...

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione Novartis per la Ricerca Medico-Biologica e dal Pool di Ricerca dell'Università di Friburgo (a MW). Ringraziamo Li Zhao, Zhan Xu e Solange Kharoubi Hess per il supporto tecnico, così come Radu Aricescu e Yvonne Jones (Oxford University, Regno Unito) per aver fornito il plasmide pHLsec e Thomas Schürpf (Harvard Medical School) per le utili discussioni.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagente TRIzolInvitrogen15596-026Kit di isolamento dell'RNA totale
SuperScript II Trascrittasi inversaInvitrogen18064-014
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltàNEBM0530L
Maxi kit di plasmidi EndoFreeQIAGEN12362
EX-CELL 293 Terreno senza siero per cellule HEK 293Sigma14571C
DMEM, glucosio alto, integratore GlutaMAX, piruvatoGibco31966-021
SnakeSkin tubo per dialisi, 10K MWCOThermo Scientific68100
Enterokinasi da intestino bovinoSigmaE4906ricombinante, ≥ 20  unità/mg di proteina
HisTrap Excel 5 ml colonnaGE Healthcare17-3712-06 Nichel IMAC
Colonna HiTrap SP HP da 5 mlGE Healthcare17-1152-01 Colonna S
N-&alfa;-Cbz-L-lisina tiobenzilestere (BLT)Substrato SigmaC3647GzmA
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)MP Biomedicals2193608 _10mgsubstrato GzmB
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)Substrato di BachemGzmM
5,5′-ditio-bis(acido 2-nitrobenzoico) (DTNB)Reagente di Ellman SigmaD8130

References

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