Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

Sommario

I neutrofili svolgono un ruolo importante non solo nella difesa dell'ospite contro i microrganismi invasori, ma sono anche coinvolti nella sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali. Qui, descriviamo le tecniche relative all'isolamento di neutrofili con proprietà antitumorali e i metodi per monitorare la funzione dei neutrofili antitumorali in vitro e in vivo.

Abstract

Neutrofili, il più abbondante di tutte le cellule bianche del sangue nella circolazione umana, svolgono un ruolo importante nella difesa dell'ospite contro microrganismi invasori. Inoltre, i neutrofili giocano un ruolo centrale nella sorveglianza immunitaria di cellule tumorali. Essi hanno la capacità di riconoscere le cellule tumorali e indurre la morte delle cellule tumorali tramite un meccanismo di contatto-dipendente delle cellule coinvolgono il perossido di idrogeno o attraverso citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC). I neutrofili con attività anti-tumorale possono essere isolate dal sangue periferico di pazienti affetti da cancro e di topi portatori di tumore. Questi neutrofili sono chiamati neutrofili tumore trascinato (TEN) per distinguerli dai neutrofili di soggetti sani o topi ingenua che non mostrano una significativa attività citotossica tumorale. Rispetto ad altri globuli bianchi, neutrofili mostrano diversa galleggiabilità rendendo così possibile ottenere a> 98% popolazione neutrofili puro quando sottoposto ad un gradiente di densità. Tuttavia, in aggiuntaalla popolazione normale neutrofili alta densità (HDN), in pazienti affetti da cancro, in topi portatori di tumore, come pure in condizioni infiammatorie croniche, popolazioni neutrofili bassa densità distinti (LDN) appaiono nella circolazione. LDN co-purificare con la frazione mononucleare e può essere separato dalle cellule mononucleari utilizzando sia strategie di selezione positiva o negativa. Una volta che la purezza dei neutrofili isolati è determinata mediante citometria di flusso, possono essere utilizzati per in vitro e in vivo saggi funzionali. Descriviamo tecniche per il monitoraggio dell'attività antitumorale di neutrofili, la loro capacità di migrare e per produrre specie di ossigeno reattive, così come il controllo della loro capacità fagocitica ex vivo. Descriviamo ulteriormente le tecniche per etichettare i neutrofili per il monitoraggio in vivo, e di determinare la loro capacità anti-metastatica in vivo. Tutte queste tecniche sono essenziali per capire come ottenere e caratterizzare neutrofili con antitumoralefunzione.

Introduzione

I neutrofili sono stati inizialmente caratterizzati come le cellule immunitarie innate che servono come prima linea di difesa contro i microrganismi invasori. Oggi è noto che i neutrofili hanno più funzioni di vasta portata, essere coinvolti in montaggio le risposte immunitarie adattive contro antigeni estranei ^1,2, regolando emopoiesi ^3, l'angiogenesi e la guarigione delle ferite ^{4 5.} Inoltre, i neutrofili possono influenzare la crescita tumorale e nella progressione metastatica in virtù delle loro pro e anti-tumorali attività ^6,7. I neutrofili sono caratterizzati da un nucleo segmentato polimorfico (quindi definito po....

Protocollo

Animali: 5-7 settimane BALB / c topi sono acquistati da Harlan (Israele). Tutti gli esperimenti su animali sono stati approvati dalla Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali della Hebrew University (IACUC). Campioni umani: Raccolta di sangue da pazienti oncologici e volontari sani è stato approvato dal Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Induzione di neutrofili con proprietà anti-tumorali in vivo, utilizzando un modello murino del cancro della mammella.

Nota: Tutti i passaggi devono essere eseguiti utilizzando soluzioni sterili in un flusso d'aria laminare mobile (LA....

Risultati

In un recente studio abbiamo identificato una funzione anti-metastatico per i neutrofili ^6. I neutrofili da topi portatori di tumore acquisire un fenotipo citotossico e hanno la capacità di uccidere le cellule tumorali ^6. Questo è in contrasto con neutrofili da topi naive che non hanno alcun significativo effetto antitumorale ^6. Molte delle tecniche descritte nella sezione protocollo sono stati utilizzati per studiare la funzione dei neutrofili antitumorale in vitro e in viv.......

Discussione

I neutrofili sono la più abbondante di tutte le cellule bianche del sangue e sono i primi interventi in caso di infezioni e infiammazioni. Come tali, essi sono molto sensibili a segnali esterni e sono facilmente attivati. Inoltre, i neutrofili hanno una breve emivita e un rapido turnover. Insieme, queste caratteristiche sollevano varie difficoltà nel lavorare con neutrofili, tale che sono richieste uniche strategie sperimentali. Per esempio, ci sono diverse strategie di purificazione dei neutrofili, ognuno con i suoi pr.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
LINEE CELLULARI
Cellule di carcinoma mammario di topo 4T1	ADCC	CRL-2539	Mezzo di crescita: DMEM + 10 % di prodotti e attrezzature in plastica FBS INATTIVATI
coltura tissutale a 24 pozzetti	Falcon	353047	Piastra sterile
per coltura tissutale da 100 mm	Corning	430167
Pallone sterile per coltura tissutale da 25 cm2	Nunc	156340	Piatto sterile
per coltura di grado batterico da 90 mm.	Miniplast, Ein Shemer, Israele	20090-01-017
Sterile 15 ml Sterile Conico Centrifuga Tubo	Miniplast, Ein Shemer, Israele	835015-40-111	Provetta
centrifuga conica sterile sterile da 50 ml	Miniplast, Ein Shemer, Israele	835050-21-111	Falcon sterile
12 x 75 mm Tubo in polistirene a fondo tondo	sterile Millicell 24 Becton Dickinson	352058
con pori di 5μ m	Merck Millipore	PSMT010R1	Piastra Sterile
a 96 Pozzetti a Fondo Piatto Bianca	Costar	3917
Filtro per cellule sterili (40 mm)	BD Falcon	352340	Ago sterile
20G x 1,5"	BD Microlance 3	301300	Ago sterile
23G x 1"	BD Microlance 4	300800	Ago sterile
25G x 5/8"	BD Microlance 5	300600
Siringa sterile da 0,3 ml con ago da 30 G x 8 mm	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	Clip sterili
da 9 mm.	BD, AutoClip	427631	Magnete EasySep sterile
	STEMCELL Technologies	18000
MACS LS	Miltenyi Biotech	130-042-201	Magnete
separatore MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Vetrino per microscopio	Menzel-Glä ser Superfrost  Agitatore	Thermo J1800AMNZ
nbsp;	Sky line,	S-3.02.10L
	TECAN	InfiniteF200Pro
POWDER
Albumina sierica bovina (BSA), frazione V	Sigma	A7906
Bromodeossiuridina (BrdU)	BD Pharmingen	550891	CFSE sterile
(5-(e 6-)-carbossifluoresceina diacetato, succinimidil estere)	Sonde molecolari	C1157
destrano T500	Sigma	31392
eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina	Sigma	H3149
Sodio azide (NaN3)	Sigma	S8032	Altamente tossico, maneggiare con cura
Polvere di tioglicolato	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
TERRENI E SUPPLEMENTI
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Sigma	D5796	Sterile
Opti-MEM® Ho ridotto il siero medio	Life Technologies	31985062	Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758	Siero
bovino fetale sterile (FBS), inattivato termicamente	Sigma	F9665	sterile
L-Glutammina	Biological Industries, Beth HaEmek, Israele	03-020-1A	Sterile
Sodium piruvato	Biological Industries, Beth HaEmek, Israele	03-042-1B
Penicillina sterile Streptomicina x 1000 soluzione	Biological Industries, Beth HaEmek, Israele	03-031-5
Soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) senza Mg2+ e Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israele	02-023-1	PBS sterile
x 10 senza Ca2+ e Mg2+	Industrie biologiche, Beth HaEmek, Israele	02-023-5A	Acqua sterile
di grado HPLC	J.T. Baker	4218-03	Autoclave
SOLUZIONI
ACK Tecnologie per la vita di ammonio-cloruro-potassio		A10492-01
Soluzione di bromodeossiuridina (BrdU) (10 mg/ml) in PBS			Sciogliere 10 mg di BrdU in 1 ml di PBS e filtro sterile.
CFSE, 5 mM in DMSO			Sciogliere 2,8 mg di CFSE in 1 ml di DMSO. Dividere in aliquote da 10 ml in provette sterili da 200 ml e conservare al buio a -20oC.
Soluzione di eosina Y	Sigma	HT110-2-32
Soluzione salina bilanciata di Hanks	Biological Industries, Beth HaEmek, Israele	02-016-1A	Eparina sterile
, 20 mg/ml in PBS			Sciogliere 100 mg di eparina in 5 ml di PBS sterile e filtrare sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.
Histopaque-1119	Sigma	11191	Filtro sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.
Histopaque-1077	Sigma	10771	Filtro sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.
Tampone per lisi per colture cellulari Luciferasi x5	Promega	E153A	Diluire 1:5 in acqua sterile appena prima dell'uso.
Soluzione di saggio della luciferasi	Promega	E1501	Contiene polvere di substrato del saggio della luciferasi (E151A) e tampone del saggio della luciferasi (E152A)
di ematossilina di Mayer	Sigma	MHS-32
PBS + 0,5% BSA			Sciogliere 2,5 g di BSA in 500 ml di PBS e filtrare in modo sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.
PBS + 1% BSA			Sciogliere 1 g di BSA in 100 ml di PBS e filtrare in modo sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.
5x PBS con il 2,5% di BSA			Sciogliere 12,5 g di BSA in una miscela di 250 ml di acqua sterile di grado HPLC e 250 ml di PBSx10 e filtro sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.
PBS contenente lo 0,5% di BSA e 2 mM di EDTA			Sciogliere 250 mg di BSA in 50 ml di PBS sterile e aggiungere 200 ml di EDTA 0,5M pH 8,0, filtro sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.
Tampone FACS (PBS contenente 0,5% BSA, 2 mM EDTA e 0,02% NaN3)Sciogliere			250 mg di BSA in 50 ml di PBS sterile e aggiungere 200 ml di EDTA 0,5M pH 8,0 e 500 ml di NaN3 filtro sterile attraverso un filtro da 0,2 mm.
Soluzione salina (0,9% NaCl)			Sciogliere 9 g di NaCl in 1.000 ml di ddw, autoclavare in autoclave
soluzione			Sciogliere 2 g di NaCl in 1.000 ml di ddw, autoclavare in autoclave
		NaCl all'1,6%	Sciogliere 16 g di NaCl in 1.000 ml di ddw, autoclave
al 2% di azoturo			di sodio Sciogliere 1 g di azide di sodio in 50 ml di ddw sterile, conservare a 4oC. Altamente tossico.
Soluzione di tioglicolato			%                                                                            Sciogliere 3 g di polvere di tioglicolato in 100 ml di ddw.                                                                             Far bollire fino a quando la soluzione diventa gialla e sterilizzare in autoclave.
Soluzione di blu di tripano (0,4%)	Sigma	T8154	Diluire 1:10 in PBS per ottenere una soluzione allo 0,04%.
Soluzione di tripsina B	Biological Industries, Beth HaEmek, Israele	03-046-1	Sterile
1 mg/ml Zymosan A			Risospendere 1 mg di Zymosan A in 1 ml di PBS sterile in una provetta Eppendorf. Agitare energicamente e incubare la provetta a 37 oC per 30 minuti. Non sterilizzare in autoclave. Preparare la soluzione appena prima dell'uso.
Kit di
selezione EasySep PE	STEMCELL Technologies	18557
EasySep PE cocktail di selezione	STEMCELL Technologies	18151
le nanoparticelle magnetiche EasySep	STEMCELL Technologies	18150
Kit MicroBead per topi Anti-Ly6G	Miltenyi Biotec	130-092-332
Kit per l'arricchimento dei neutrofili del topo EasySep	STEMCELL Technologies	19762
Kit per l'arricchimento dei neutrofili umani EasySep	STEMCELL Technologies	19257
Kit di flusso FITC BrdU	BD Pharmingen
isolamento dei neutrofili 559619 MACS Kit per	Miltenyi Biotec	130-097-658
	Azienda chimica delle Cayman	500290
ANTICORPI Anticorpi
anticorpi bloccanti FcR	Biolegend	101302
Anticorpo purificato anti-Ly6G per ratti	BD Pharmingen	551459	Clone 1A8
PE-coniugato ratto anti-topo anticorpo Ly6G	Biolegend	127608	Clone 1A8
FITC-coniugato ratto anti-topo Ly6G	BD Pharmingen	551460	Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 ratto anti-topo Ly6G	TONBO Biosciences	65-1276	Clone 1A8
violetFluor 450-coniugato ratto anti-topo Ly6G	TONBO Biosciences	75-1276	Clone 1A8
FITC-coniugato ratto anti-topo CD11b	BD Pharmingen	553310	Clone M1/70
FITC-coniugato ratto anti-topo Ly-6G e Ly-6C (GR-1)	BD Pharmingen	553127	Clone RB6-8C5
PE-coniugato ratto anti-topo CD45	BD Pharmingen	553081	Clone 30-F11
Ratto coniugato FITC anti-topo F4/80	Abcam	ab60343	Clone BM8
Mouse coniugato FITC anti-umano CD66b	Biolegend	305103	Clone G10F5
Anticorpo purificato per il controllo dell'isotipo di ratto (IgG2a, k)	BD Pharmingen	553927	Clone R35-95
LEAF criceto armeno purificato anticorpo CD3e anti-topo	BioLegend	100314	Clone 145-2C11

A CALDO Piastra per da Piastra di migrazione Colonna di separazione sterile orbitale Plus & Lettore di piastre ELMI Soluzione la di NaCl allo 0,2% la soluzione di al 3Kit di il test di fagocitosi