Cardiac pressione Volume Analysis Loop Utilizzando conduttanza Cateteri nei topi

Sommario

L'analisi del ciclo pressione-volume cardiaco è il modo più completo per misurare la funzione cardiaca nel cuore intatto. Descriviamo una tecnica per eseguire e analizzare i loop di volume della pressione cardiaca, utilizzando cateteri di conduttanza.

Abstract

L'analisi del loop pressione-volume cardiaco è il "gold standard" nella valutazione delle misure dipendenti dal carico e indipendenti dal carico della funzione sistolica e diastolica ventricolare. Le misure della contrattilità e della compliance ventricolare si ottengono attraverso l'esame della risposta cardiaca alle variazioni del postcarico e del precarico. Queste tecniche sono state originariamente sviluppate quasi tre decenni fa per misurare la funzione cardiaca nei grandi mammiferi e negli esseri umani. L'applicazione di queste analisi ai piccoli mammiferi, come i topi, è stata realizzata attraverso l'ottimizzazione delle tecniche microchirurgiche e la creazione di cateteri di conduttanza. I cateteri a conduttanza consentono di stimare il pool sanguigno sfruttando la relazione tra conduttanza elettrica e volume. Se eseguite correttamente, queste tecniche consentono di testare la funzione cardiaca in modelli murini mutanti genetici o in studi di trattamento farmacologico. L'accuratezza e la precisione di questi studi dipendono da un'attenta attenzione alla calibrazione degli strumenti, all'esecuzione sistematica di misurazioni emodinamiche e all'analisi dei dati. Esamineremo i metodi di conduzione di esperimenti ad anello pressione-volume utilizzando un catetere di conduttanza nei topi.

Introduzione

Analisi del ciclo del volume pressione cardiaca fornisce informazioni dettagliate della funzione cardiaca e sono il gold standard per la valutazione funzionale ^1. Mentre le tecniche di imaging come l'ecocardiografia o risonanza magnetica cardiaca forniscono misure funzionali, queste misure sono fortemente dipendenti dalle condizioni di carico. Misure indipendenti dal carico di contrattilità cardiaca e relax richiedono misure dinamiche della pressione ventricolare e rapporto di volume entro una gamma di precarico e postcarico. Questa comprensione della relazione pressione-volume nasce dal lavoro pionieristico di Sagawa e colleghi ^2,3. Hanno dimostrato in ex vivo cuori canini perfusi che le misure contrattilità derivati ​​ciclo pressione-volume erano indipendenti di condizioni di carico ^4.

In vivo applicazione di queste analisi è diventato possibile con lo sviluppo di cateteri conduttanza nel 1980. Questo progresso tecnico ha permesso Kass e colleghi per eseguire pressione-volume l'analisi di circuiti negli esseri umani ^5,6. La miniaturizzazione dei cateteri di conduttanza e miglioramenti nelle tecniche chirurgiche alla fine degli anni 1990 ⁷ ha fatto l'analisi di roditore funzione cardiaca fattibile, consentendo studi genetici e farmacologici da eseguire. Questo progresso ha da portare alla diffusione di analisi del ciclo pressione-volume e ha generato una grande quantità di comprensione mammiferi fisiologia cardiaca.

Un concetto fondamentale l'uso di cateteri conduttanza e l'interpretazione dei dati ottenuti è il rapporto tra volume e conduttanza. Conduttanza è inversamente proporzionale alla tensione, che viene misurata utilizzando un catetere con elettrodi posti prossimalmente, solitamente poste sotto la valvola aortica, e distalmente, all'apice LV ^8. Le variazioni di tensione o conduttanza sono misurate dai cambiamenti nel flusso di corrente da prossimale a distale dell'elettrodo. Anche se la pozza di sangue contribuisconos significativamente alla conduttanza, il contributo della parete ventricolare, definito conduttanza parallelo (V _p), alla conduttanza misurata deve essere sottratto per ottenere misurazioni di volume LV assolute.

I metodi per eseguire questa correzione, chiamato calibrazione salina, sono discussi nel protocollo di seguito. La relazione matematica tra conduttanza e volume, descritto da Baan e colleghi, è che il volume = 1 / α; (ρ ^L 2) (GG _p), dove α = campo uniforme fattore di correzione, ρ = resistività del sangue, L = distanza tra gli elettrodi, G = conduttanza e G _p = conduttanza non sangue ^9. Da segnalare, il campo fattore di correzione uniforme nei topi avvicina 1.0 a causa di piccoli volumi ^camera 10. Accoppiato con trasduttori di pressione, catetere conduttanza fornisce dati relativi alla pressione simultanea e di volume in tempo reale.

PRESSU cardiacari-analisi del volume presenta particolari vantaggi rispetto ad altre misure della funzione cardiaca, in quanto consentono di misurazione della funzione ventricolare indipendente dalle condizioni di carico e di frequenza cardiaca. Specifici indici cardiaci indipendenti dal carico di contrattilità includono: telesistolico relazione del volume di pressione (ESPVR), d P / d t _max -end-diastolico relazione del volume, elastanza massimo _(E max) e del precarico lavoro ictus recruitable (PRSW). Una misura indipendente dal carico di funzione diastolica è il volume di pressione rapporto fine diastole (EDPVR) ^11. Il protocollo che segue descrive il comportamento di analisi del ciclo di volume pressione cardiaca, utilizzando sia un carotidea ed un approccio apicale. Mentre la metodologia per eseguire questi studi sono stati descritti in dettaglio in precedenza ^8,11, rivedremo passaggi chiave per ottenere misurazioni della pressione volumi precisi, tra cui la correzione sia saline e la calibrazione provetta, e di fornire una dimostrazione visiva di thesprocedure e. La ricerca con animali effettuati per questo studio è stata gestita secondo protocolli approvati e ai regolamenti sul benessere degli animali di cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale del Duke University Medical Center.

Protocollo

1. Preparati conduttanza catetere e calibrazione della pressione

1. Collegare il catetere conduttanza al modulo del catetere emodinamica. Elettronico calibrare le misure di pressione e di volume registrando pressione preimpostata e il volume impostato sul modulo catetere. Registrare un tracciato pari a 0 mm Hg e 25 mm Hg (Figura 1A) e assegnare le tensioni su entrambi i tracciati di pressione (Figura 1B e 1C). Allo stesso modo, registrare un tracciato volume di 5 RVU e 25 RVU (Figura 1D) e assegnare le tensioni su entrambi i tracciati volume (1E e 1F).
2. Confermare la taratura di pressione elettronico con una taratura pressione manuale, utilizzando una colonna di mercurio sfigmomanometro. Montare il porto bracciale sfigmomanometro con un rubinetto a 3 vie. Riempire un sistema di valvola emostatica 3 vie, spesso utilizzato per angioplastica coronarica, con acqua RT utilizzando la porta laterale.
   1. Posizionare la punta di un catetere conduttanza nella valvola emostatica pieno di liquido e fissare delicatamente ingegnoHout attorcigliamento del catetere. Collegare la valvola emostatica alla sfigmomanometro e gonfiare a 200 mmHg e bloccare rubinetto a 3 vie. Verificare se la pressione misurata corrisponde alla pressione gonfiato sul sfigmomanometro.
3. Luogo catetere salina riscaldata a 37 ° C che è al livello della pressione campo operatorio e misura. Regolare il controllo della pressione fino a quando le pressioni registrate è pari a zero.

2. Anestesia / intubazione

1. Somministrare ketamina / xilazina (80-100 / 10 mg kg ^-1) come un'iniezione intraperitoneale.
   Nota: agenti anestetici alternativi possono essere utilizzati. Una lunga lista di anestetici sono forniti in recensioni precedenti di questa tecnica ^11,12. Anestesia corretta può essere confermata da dolce pizzico coda.
2. Una volta anestetizzato, radersi il collo e il petto con tosatrici e posto su un tappetino riscaldato. Mantenere la temperatura rettale mouse 36,5-37,5 ° C. Basse temperature del corposi tradurrà in tassi di cuore depressi. Applicare pomata per gli occhi per evitare secchezza
3. Eseguire un'incisione mediana del collo e sezionare i muscoli tracheali via per esporre la trachea. Inserire un tubo endotracheale attraverso la bocca, mentre si visualizza la trachea al fine di garantire l'intubazione, e connettersi al respiratore.
4. Mantenere mouse sul ventilatore durante la procedura. Impostazioni Impostare ventilatore in base al peso animale come descritto in precedenza ^11. Volume corrente (ml) = 6.2 x (peso animale in chilogrammi) ^1.01 e la frequenza respiratoria = 53.5 x (peso animale in chilogrammi) ^-0.26.

3. Posizionamento di conduttanza catetere nella camera LV

1. Approccio carotidea
   1. Per garantire la sterilità, due serie di strumenti chirurgici sterili sono uno Used- per incisione cutanea iniziale e quella di operare nel toracotomia. Gli strumenti devono essere decontaminati con uno sterilizzatore a secco tra gli animali nel corso di una singola sessione chirurgica unnd autoclave alla fine di ogni giornata chirurgica.
   2. Dopo che la pelle è stata decontaminata con tre cicli di una macchia della pelle clorexidina + alcool (soluzione alcolica / 70% clorexidina 0,5%), fare un'incisione sopra la carotide destra da mandibola a sterno. Sezionare il tessuto circostante per esporre la carotide destra, e tagliare il nervo vago che corre adiacente alla carotide.
   3. Posizionare un sterile sutura 6-0 seta intorno all'estremità distale (lontano dal petto) della carotide, cravatta e sicuro. Inserire due suture aggiuntivi sotto prossimale carotide (più vicino al petto) alla prima sutura liberamente legare la sutura centrale. Tirare delicatamente la sutura prossimale e sicuro fissando alla pelle. Assicurarsi che la carotide è stato bloccato sia prossimale e distale prima di procedere.
   4. Fai una piccola incisione nella carotide R., prossimale alla prima sutura, e si estendono longitudinalmente verso il petto.
   5. Inserire la punta del catetere conduttanza,precedentemente imbevuto in soluzione salina calda per 30 minuti, nel recipiente attraverso l'incisione e fissare il catetere con la sutura centrale.
   6. Avanzare delicatamente il catetere nel ventricolo sinistro attraverso la carotide, mentre si guarda il loop pressione-volume tracciamento per garantire il corretto posizionamento.
      Nota: il posizionamento ottimale del catetere dovrebbe produrre loop pressione-volume che appaiono rettangolare (vedi figura 2). Se si incontra resistenza al passaggio del catetere, delicatamente tirare indietro e avanzare di nuovo con una leggera pressione. Rotazione delicato del catetere può aiutare con il posizionamento nel ventricolo sinistro. Forzare il catetere conduttanza può portare a gravi complicanze cardiovascolari o danni al catetere.
   7. Registra basale pressione-volume loop ~ 10 minuti dopo il posizionamento del catetere e di raggiungere uno stato stabile (figura 2).
2. Approccio apicale
   1. In un mouse anestetizzato e ventilato, fare un fr un'incisioneom il processo xifoideo e tagliare attraverso la parete toracica laterale fino a quando il diaframma è visibile.
   2. Tagliare se il diaframma e visualizzare l'apice del cuore.
   3. Inserire il catetere nella conduttanza all'apice del ventricolo sinistro attraverso una ferita ago stab (usando un ago G 25-30), fino l'elettrodo prossimale è appena dentro il ventricolo.
   4. Record basale pressione-volume loop ~ 10 minuti dopo il posizionamento del catetere e raggiungere uno stato stazionario.

4. Variazione Postcarico Utilizzando Transient aortica Occlusione

1. Per eseguire transitoria occlusione aortica, fare una piccola incisione orizzontale nella parte superiore del torace e sezionare il tessuto circostante per esporre l'aorta trasversale.
2. Posizionare una legatura 6-0 di seta sotto l'aorta trasversale. Dopo loop pressione-volume sono tornati ai valori basali, stringere entrambe le estremità della sutura con un morsetto ago, delicatamente e sollevare lentamente la sutura sopra 1-2 sec, e rilasciare lentamente la tensione.
3. Ripetere questa procedura, fino a tre registrazioni ottimali separati sono realizzati dallo stesso animale.
   Nota: registrazioni ottimale dovrebbe avere almeno 5 cicli di loop di volume e pressione un aumento costante pressione sistolica terminali durante l'applicazione della tensione sulla sutura (Figura 3A e 3C).

5. Variazione precarico Utilizzando Transient Vena cava inferiore Occlusion (IVC)

1. Per eseguire transitoria occlusione della vena cava inferiore, fare una incisione orizzontale sotto il processo xifoideo, sotto il diaframma per esporre il IVC.
2. Posizionare una legatura 6-0 di seta sotto il IVC. Dopo loop pressione-volume sono tornati ai valori basali, stringere entrambe le estremità della sutura con un morsetto ago; delicatamente e lentamente aumentare la sutura sopra 1-2 sec, e rilasciare lentamente la tensione. IVC occlusione può essere effettuata anche mediante l'applicazione di pressione leggera con un batuffolo di cotone punta.
3. Ripetere questa procedura, fino a tre registrazioni ottimali separati sono made dallo stesso animale.
   Nota: registrazioni ottimale dovrebbe avere almeno 5 cicli di loop di volume e pressione un calo costante pressioni telediastolico ventricolare sinistra durante l'applicazione della tensione sulla sutura (Figura 4A e 4B).

6. Saline Calibrazione

1. Al termine dello studio, un (V _p) valore di conduttanza parallela può essere ottenere iniettando un bolo di 10 ml di soluzione salina ipertonica (15%) nel animale attraverso la vena giugulare (Figura 5A e 5B).
   Nota: Questo bolo causerà un apparente aumento di volume senza variazione della pressione. Questa apparente variazione di volume è il risultato di un cambiamento nella pozza di sangue conduttanza piuttosto che a causa di un effettivo aumento di volume. Un calo transitorio dP / dt _max può osservare, come soluzione salina ipertonica ha un effetto inotropo negativo ^13. Il V _p calcolata può essere inserito in un software di analisi del ciclo di volume di pressione lungocon i parametri di calibrazione cuvetta e convertire da RVUs in microlitri.

7. Cuvette di calibrazione

1. Per eseguire una calibrazione cuvetta, posizionare una vaschetta con pozzetti di diametro noto forniti dal produttore su una piastra elettrica o di un bagno d'acqua riscaldata a 37 ° C. Riempire i primi 4-5 fori con caldo sangue eparinato fresco da topi sottoposti a valutazioni emodinamiche.
   Nota: Una calibrazione cuvetta permette una valutazione precisa del ventricolo sinistro pozza di sangue con il sangue del mouse e permette la conversione dei dati di volume da RVUs a microlitri.
2. Inserire il catetere conduttanza nel primo pozzo, fino a quando tutti gli elettrodi sono sommersi. Spostare delicatamente il catetere nel pozzo, che genererà diversi RVU.
3. Registrare i cambiamenti di conduttanza del canale volume in RVU. Selezionare la massima RVU per la calibrazione.
   Nota: Il volume dei pozzetti può essere calcolata da 1) usando l'equazione per il volume di un cilindro, in cui il raggio è quella del pozzo cuvetta e la lunghezza è basata sulla lunghezza tra i due elettrodi di rilevamento interne o 2) controllando nelle istruzioni del produttore. L'uscita conduttanza può essere correlata con i volumi noti per sviluppare una equazione di taratura che converte il dato da RVUs in microlitri ^11.

8. Eutanasia

1. A conclusione del protocollo, i topi vengono sacrificati mediante dislocazione cervicale mentre sotto anestesia.
2. Al fine di assicurare la morte, i topi che sono stati sottoposti dislocazione cervicale devono essere sottoposti a un metodo secondario di eutanasia. Usiamo dissanguamento in anestesia, con la raccolta di tessuto cardiaco per la sperimentazione, o toracotomia bilaterale sotto anestesia.

9. Analisi dei dati utilizzando pressione, volume e Loop software di analisi

1. Calcola V _p da Saline di calibrazione
   1. Selezionare pressione e volumi Loops ottenuto durante l'espulsione di salina ipertonica (Figura 5A e 5B)
   2. Esporta loop al software di analisi del volume di pressione. Scegliere l'opzione per la calibrazione Saline (Figura 5C)
   3. Registrare il valore V _p calcolato (Figura 5D).
      Nota: Il _valore di p V è calcolata individuando l'intersezione del volume 1) Fine-diastolico vs. volume telesistolico dalla taratura salina e 2) linea del volume volume = telesistolico End-diastolica. L'intersezione di queste linee fornisce V _p, che viene calcolato dal software di analisi ciclo pressione volume.
2. Inserisci conduttanza a volume (RVU) relazione nelle opzioni del canale del volume (Figura 1F)
3. Misurare Baseline pressione Volume relazione ciclo
   1. Selezionare 8-10 cicli cardiaci di canali di pressione e di volume una volta che lo stato stazionario è stato raggiunto (Figura 2A) e l'esportazione in analisi morbidoware. Identificare 5-6 cicli di fine espirazione (Figura 2b)
   2. Utilizzare il valore _p V per correggere la conduttanza parallelo. Scegliere l'opzione "stato stazionario" e generare una tabella riassuntiva emodinamica (Figura 2C)
4. Misura di pressione Volume ciclo Relation durante aortica Costrizione
   1. Selezionare 8-10 cicli cardiaci di canali di pressione e di volume che corrispondono a costrizione aortica prima dell'aumento delle pressioni telediastolico (Figura 3A) e esportazione software di analisi. Identificare 5-6 cicli di fine espirazione (Figura 3C)
   2. Selezionare analisi "contrattilità" (Figura 3B), che calcola il volume di pressione Relation telesistolico (ESPVR)
5. Misura di pressione Volume ciclo Relation durante IVC Costrizione
   1. Selezionare 8-10 cicli cardiaci di canali di pressione e di volume che corrispondono a IVC costrizione (Figure 4A) e l'esportazione di software di analisi. Identificare 5-6 cicli di fine espirazione (Figura 4B)
   2. Selezionare analisi "contrattilità" (Figura 3B), che calcolerà precarico recruitable corsa di lavoro (PRSW) (Figura 4C), massimo dP / dt vs EDV (Figura 4D), così come la ESPVR e relazione del volume pressione telediastolica (Figura 4E)

Risultati

Analisi di circuiti di pressione-volume può essere utilizzato per misurare la funzione cardiaca in topi geneticamente modificati ^14,15 o topi sottoposti a studi di droga ^16. Cicli di volume pressione rappresentativi sono forniti dal lavoro precedentemente pubblicato ¹⁶ indagare l'effetto della beta-arrestina polarizzato AT1R ligando, TRV120023. Per verificare se TRV120023 colpisce la funzione cardiaca in vivo, l'analisi del ciclo di pressione-volume è stato eseguito su topi wild...

Discussione

Si descrive un metodo per l'analisi del ciclo perfoming pressione-volume utilizzando un catetere conduttanza nei topi, per ricavare analisi complete sia di contrattilità cardiaca e relax. Suga, Sagawa e colleghi utilizzati pressione-volume loop per definire le misure di contrattilità cardiaca, in particolare la pendenza della ESPVR, o l'elastanza telesistolico _(es E), e _E max. Elastance, definito dal rapporto di pressione a volume (P / V), varia in base alla durata della sistole. Durante og...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AnaSed (xilazina)	Lloyd Laboratories	NADA n. 139-236	Anestetico
Ketaset (ketamina)	Pfizer	440842	Anestetico
VIP3000	Matrx Medical Inc.		Macchina per anestesia
Ventilatore Apparecchio	Harvard Modello	683	Kit tubi per apparecchiature chirurgiche
	Apparecchio Harvard	72-1049	Attrezzatura chirurgica
Coperta omeotermica	Kaz Inc.	5628	Apparecchiature chirurgiche
Stereomicroscopio	Carl Zeiss Optical Inc.	Stemi 2000	Illuminatore per apparecchiature chirurgiche
	Cole– Parmer	41720	Attrezzatura chirurgica
Dumont n. 55 Pinze Dumostar	Fine Science Tools Inc	11295-51	Strumenti chirurgici
Pinze Graefe, curve	Strumenti chirurgici Fine Science Tools Inc	11052-10
Pinze Moria MC31	Fine Science Tools Inc	11370-31	Strumenti chirurgici
Forbici Mayo	Fine Science Tools Inc	14512-15	Strumenti chirurgici
Forbici dell'iride	Fine Science Tools Inc	14041-10	Strumenti chirurgici
Porta aghi Halsey	Fine Science Tools Inc	12501-13	Strumenti chirurgici
Olsen– Porta aghi Hegar	Fine Science Tools Inc	12002-12	Strumenti chirurgici
a molla	Fine Science Tools Inc	15610-08	Strumenti chirurgici
sottopolveri monouso	Kendall/Tyco Healthcare	1038	Forniture chirurgiche
Spugne di garza sterili, sterili	Dukal	62208	Forniture chirurgiche
Applicatori con punta in cotone, sterili	Solon	368	Forniture chirurgiche
Sutura chirurgica, seta, 6-0	DemeTECH	FT-639-1	Forniture chirurgiche
1 cc Siringhe da insulina	Becton Dickenson	329412	Forniture chirurgiche
Accesso 9 Valvola per emostasi	Merito medico	MAP111	Apparecchiature emodinamiche
Sfigmomanometro	Baumanometro	320	Apparecchiature emodinamiche
Sistema fotovoltaico Millar MPVS-300/400 o MPVS Ultra (include cuvetta di calibrazione)	ADInstruments Inc		Apparecchiature emodinamiche
Catetere a conduttanza da 1,4 F	ADInstruments Inc	SPR-839	Apparecchiature emodinamiche
PowerLab 4/30 con Chart Pro	ADInstruments Inc.	ML866/P	Software emodinamico
tosatrice per animali	Wahl	8787-450A	Varie
Tubi Indieremici PE-10	Becton Dickenson	427401
Varie Tubi Indieremici PE-50	Becton Dickenson	427411
Varie Assortimento di aghi (calibro 18, 25 e 30; Thomas Scientific)			Varie
Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9% (peso/volume), USP)	Hospira	NDC n. 0409-4888-50
Varie Nastro			Varie
Alconox (Alconox Inc.) per la pulizia del catetere	ADInstruments Inc.		misto