Questo protocollo descrive come eseguire saggi di quantificazione assoluta di proteine bersaglio all'interno di campioni biologici complessi utilizzando il monitoraggio di reazioni selezionate. È stato utilizzato per quantificare con precisione le proteine della via di segnalazione della chemiotassi dei macrofagi di topo. La selezione dei peptidi target, lo sviluppo del saggio e i saggi qualitativi e quantitativi sono descritti in dettaglio.
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Articolo metodologico
Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La quantificazione assoluta delle proteine bersaglio all'interno di campioni biologici complessi è fondamentale per un'ampia gamma di applicazioni cliniche e di ricerca. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per lo sviluppo e l'applicazione di saggi quantitativi utilizzando la spettrometria di massa (MS) con monitoraggio a reazione selezionata (SRM). In primo luogo, i probabili peptidi bersaglio quantotipici vengono identificati sulla base di numerosi criteri. Ciò include l'identificazione dei peptidi proteotipici, l'evitare i siti di modifica post-traduzionale e l'analisi dell'unicità del peptide bersaglio rispetto alla proteina bersaglio. Successivamente, gli standard di peptidi esterni grezzi vengono sintetizzati e utilizzati per sviluppare saggi SRM e i saggi risultanti vengono utilizzati per eseguire analisi qualitative dei campioni biologici. Infine, vengono preparati standard di peptidi interni purificati, quantificati e marcati con isotopi pesanti e utilizzati per eseguire saggi SRM in serie di diluizione isotopica. Viene presentata l'analisi di tutti i dati MS risultanti. Questo protocollo è stato utilizzato per analizzare con precisione l'abbondanza assoluta di proteine della via di segnalazione della chemiotassi all'interno di cellule RAW 264.7 (una linea cellulare di monociti/macrofagi di topo). La quantificazione di Gi2 (una α-subunità eterotrimerica della proteina G) è descritta in dettaglio.
Introduzione
Esperimenti di proteomica che utilizzano la spettrometria di massa (MS) possono essere progettati per utilizzare non mirati (shotgun) o metodi mirati. Proteomica Discovery genere si basa su fucile bottom-up MS, sia utilizzando una tradizionale modalità di acquisizione dati dipendente, oppure utilizzando una delle tecniche di dati indipendenti recentemente sviluppati (ad esempio, MS E, SWATH) 1,2. Proteomica Shotgun è un potente strumento per l'identificazione peptide high-throughput e relativa quantificazione, ma è generalmente adatto per la quantificazione assoluta o per il targeting piccoli insiemi definiti (~ decine) di proteine.....
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Protocollo
NOTA: Questo metodo è stato descritto in precedenza 56.
1. Peptide Target Selection
- Compilare un elenco delle proteine bersaglio, e comprendono un piccolo numero di proteine di pulizia per la normalizzazione di tutti i campioni biologici, e comprendono anche uno standard di proteine interna (ad esempio, la lucciola luciferasi). Digeriscono le proteine bersaglio in peptidi triptici in silico utilizzando uno strumento software come la digestione delle proteine Simulator 29,30.
- Richiedere che i peptidi sono completamente triptica e non contengono siti tripsina scissione m....
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Risultati
Lo sviluppo di modelli computazionali predittivi di trasduzione del segnale è uno degli obiettivi fondamentali della biologia dei sistemi 53. Purtroppo, anche per vie di segnalazione che sono stati studiati estesamente e hanno un alto significato clinico, non è ancora generalmente possibile predire quantitativamente il comportamento percorso in risposta a perturbazioni (ad esempio, questo è vero per la MAPK / ERK 54). Recentemente, una ricerca impiegato proteomica mirati, trascrittomica e .......
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Discussione
Proteina assoluta quantificazione è essenziale per una gamma molto diversificata di applicazioni biomediche, come la convalida biomarker e trasduzione del segnale modellazione via. Recentemente, la proteomica mirati utilizzando LC-SRM ha beneficiato di miglioramenti a numerose tecnologie, tra cui il peptide preparazione standard HPLC, QQQ-MS e LC-SRM analisi dei dati. Di conseguenza, è diventato un potente alternativa a immunodosaggi. Immunoassays possono essere estremamente sensibili e high-throughput, ma lo sviluppo d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata dal Programma di Ricerca Intramurale del NIH, Istituto Nazionale di Allergie e Malattie Infettive.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetonitrile (ACN), kit | A955-1 | ||
| BCA (acido bicinconninico) | LC-MS Fisher | 23235 | |
| Perline per la battitura delle perline, zirconia-silice, 0,1 mm | BioSpec Products | 11079101z | |
| Cloridrato di bestatina | Sigma | B8385-10MG | |
| Coltura cellulare DMEM (con glucosio, senza L-glutammina) | Lonza | 12-614F | |
| Coltura cellulare EDTA, 500 mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Coltura cellulare Siero fetale bovino (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Coltura cellulare L-glutammina | Sigma | G8540-25G | |
| Coltura cellulare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4 | Gibco | 10010-049 | |
| Coltura cellulare Trypan Blue viability color, 0,4% p/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometro Contatore di cellule T4 automatico | Nexcelom Bioscience | Cellometro T4 | |
| Cellometro Auto T4 camere di conteggio monouso | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Ditiotreitolo (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Acido formico, grado LC-MS, fiale Fisher | A117-10X1AMP | ||
| Emocitometro, Neubauer-migliorato, 0,1 mm di profondità | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1 M, pH 7,2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Acido cloridrico, 37% p/p | VWR | BDH3028-2,5LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| Estrattore per micropipette basato su laser | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC capillare in silice rivestito, 50 &; micro; Flacone | 1068150017 | Polymicro Technologies | |
| , autocampionatore, 12 mm x 32 mm | SUN SRI | 200-268 | |
| LC tappo a vite, autocampionatore, PTFE/silicone pre-fessurato | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferasi, da Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| Strisce pH colorpHast (pH 0,0-6,0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| Cocktail di inibitori della fosfatasi PhosStop | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1 ml cartuccia da 100 mg | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, collettore di estrazione, 20 posizioni | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, bulbo in gomma a superficie piatta | Fisher | 03-448-25 | |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Concentratore sottovuoto Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac | Acido | ||
| (TFA), grado LC-MS | Fisher | A116-50 | |
| Tripsina, grado di sequenziamento, | provetta Promega | V5113 | |
| decapsulatore per provette Micronic | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Prostanze, 2 ml microcentrifuga, o-ring tappo a vite, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Urea | Sigma | U0631-500g | |
| Acqua, grado LC-MS | Fisher | W6-1 |
Riferimenti
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
- Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. 3rd Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-....
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Ristampe e permessi
