Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare<em&gt; Salmonella</em&gt; In primarie macrofagi di Permeabilization differenziale

Sommario

Descriviamo la quantificazione di Salmonella typhimurium citosolica e vacuolare nei macrofagi derivati dal midollo osseo utilizzando la permeabilizzazione differenziale della digitonina.

Abstract

Batteri patogeni intracellulari possono replicarsi nel citosol o in vacuoli-patogeni contenenti specializzati (PCV). Per raggiungere il citosol, batteri come Shigella flexneri e Francisella novicida devono indurre la rottura del phagosome. Al contrario, Salmonella typhimurium replica in un vano vacuolare, conosciuto come Salmonella vacuole -contenenti (SCV). Tuttavia alcuni mutanti di Salmonella non riescono a mantenere l'integrità SCV e sono quindi rilasciate nel citoplasma. La percentuale di citosolico contro batteri vacuolare a livello di singoli batteri può essere misurata permeabilizzazione differenziale, noto anche come test fagosoma protezione. L'approccio fa uso della proprietà di detersivo digitonina di legarsi selettivamente colesterolo. Poiché la membrana plasmatica contiene più colesterolo che altre membrane cellulari, digitonina può essere utilizzato per permeabilize selettivamente la membrana plasmatica lasciando membrane intracellulariintatto. In breve, dopo l'infezione con l'agente patogeno che esprimono una proteina marcatore fluorescente (es mCherry tra gli altri), la membrana plasmatica delle cellule ospiti è permeabilizzate con una breve incubazione in digitonina contenente tampone. Le cellule vengono quindi lavate ed incubate con un anticorpo primario (accoppiato ad un fluoroforo di scelta) diretto contro il batterio di scelta (ad esempio anti-Salmonella -FITC) e nuovamente lavati. Se si utilizzano i batteri non marcati, un passaggio aggiuntivo può essere fatto, in cui tutte le membrane vengono permeabilizzate e tutti i batteri colorate con un anticorpo corrispondente. Dopo la colorazione, la percentuale di vacuolari e citosolici batteri può essere quantificata mediante FACS o microscopia contando eventi singoli o doppi-positive. Qui forniamo dettagli sperimentali per l'uso di questa tecnica con il batterio Salmonella typhimurium. Il vantaggio di questo saggio è che, a differenza di altre analisi, fornisce una quantificazione del livello di singola bacteria, e se analizzata al microscopio fornisce il numero esatto di citosolico e batteri vacuolari in una data cellula.

Introduzione

Batteri patogeni intracellulari replicano direttamente nel citoplasma della cellula ospite, o in scomparti vacuolari specializzati ^1. Durante la fase iniziale dell'infezione maggior patogeni vengono internalizzati mediante fagocitosi da cellule specializzate (come macrofagi) o promuovendo attivamente il proprio assorbimento nelle cellule non fagocitiche. Nelle cellule fagocitiche, phagosome normalmente fonde con lisosomi per formare un vano degradativa, dove vengono digeriti particelle fagocitati. Batteri citosolici specializzati, come ad esempio Francisella novicida o Shigella flexneri, fuga degrado phagosomal inducendo la rottura de....

Protocollo

1. Digitonin Assay con mCherry esprimono Salmonella (FACS-based Analysis)

1. Batteri Preparazione
   Nota: Salmonella wild-type SL1344 (streptomicina resistente) che esprime mCherry da un plasmide (pFPV codifica mCherry sotto il promotore RPSM) viene utilizzato in questo test. Fagocitosi batterica e la proliferazione in cui non alterata dalla espressione costitutiva di mCherry (dati non riportati) ^16.
   1. Inoculare il ceppo 1 giorno prima della infezione in 3 ml di terreno LB addizionato con streptomicina (90 mg / ml) e ampicillina (100 ug / ml, mCherry esprimendo vettore) in un agitatore a 37 ° CO / N.

Risultati

Figura 1 e Figura 2 mostra gli schemi del test digitonina descritti nel protocollo 1 e 2 del protocollo che illustrano le fasi critiche del protocollo e dei risultati ottenuti. La figura 3 mostra tipici FACS risultati. I controlli positivi e negativi vengono utilizzati per impostare le porte per mCherry + / batteri FITC (vacuolar Salmonella) e mCherry + / FITC + batteri (citosolico Salmonella). Sulla base di queste porte la percentuale di batteri citosolici e vacuolari può.......

Discussione

Permeabilizzazione differenziale è un metodo facile e robusto per analizzare e quantificare la distribuzione subcellulare di batteri patogeni tra compartimenti vacuolari e citoplasma. Lo stesso test è stato utilizzato con successo con batteri come Francisella novicida ^2,4 e Shigella flexneri ^12. Tuttavia, dal momento che molti patogeni intracellulari alterare o modificare le strutture endomembrane ospitanti, la robustezza della permeabilizzazione digitonina dovrà essere determinat.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Digitonin	Sigma	D5628	50 μ g/ml
	PFA mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
Acetato di potassio	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
BSA	Sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexin	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
Saponina	Sigma	47036
Mezzo di montaggio Vectashield	Vectorlabs	H-1200
Anticorpo Anti Coniglio-488	Molecolare Sonde	A-11070	1/500
Glycine	Sigma	G8898
Gentamicin	Life Technologies	15710-49	100 μ g/ml e 10 μ g/ml
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 Microscopio confocale Imaging	Zeiss		fatto a 63X
FACS Fortessa	BD tecnologie		rilevamento mCherry 610 nm
Tecnologie		FACS Fortessa	rilevamento FITC 530 nm

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