Adattamento del processo Electrospinning per fornire tre ambienti unici per un Tri-livello In Vitro Modello della parete delle vie aeree

Sommario

I progressi nelle tecnologie dei biomateriali consentono lo sviluppo di costrutti tridimensionali di tipo multicellulare. Abbiamo sviluppato protocolli di elettrofilatura per produrre tre scaffold individuali per coltivare le principali cellule strutturali delle vie aeree per fornire un modello 3D in vitro della parete dei bronchioli delle vie aeree.

Abstract

L'elettrofilatura è un metodo altamente adattabile che produce scaffold fibrosi porosi 3D che possono essere sfruttati in colture cellulari in vitro. Le alterazioni dei parametri intrinseci all'interno del processo consentono un elevato grado di controllo sulle caratteristiche dell'impalcatura, tra cui il diametro delle fibre, l'allineamento e la porosità. Sviluppando scaffold con dimensioni e topografie simili alle matrici extracellulari organo-specifiche o tissutali (ECM), è possibile creare microambienti rappresentativi di quelli a cui le cellule sono esposte in situ.

La parete dei bronchioli delle vie aeree, composta da tre microambienti principali, è stata selezionata come tessuto modello. Utilizzando l'ECM decellularizzata delle vie aeree come guida, abbiamo elettrofilato il polimero non degradabile, il polietilene tereftalato (PET), mediante tre diversi protocolli per produrre tre scaffold elettrofilati individuali ottimizzati per colture epiteliali, fibroblasti o cellule muscolari lisce. Utilizzando un sistema di bioreattori disponibile in commercio, abbiamo co-coltivato stabilmente i tre tipi di cellule per fornire un modello in vitro della parete delle vie aeree per un periodo di tempo prolungato.

Questo modello evidenzia il potenziale di tali metodi impiegati in studi diagnostici in vitro che indagano importanti meccanismi di cross-talk intercellulare o valutano nuovi bersagli farmaceutici, fornendo una piattaforma pertinente per consentire la coltura di cellule adulte completamente differenziate all'interno di ambienti 3D tessuto-specifici.

Introduzione

Il campo della medicina rigenerativa e dell'ingegneria tissutale sta avanzando rapidamente, con innovazioni nella tracheale e rene rigenerazione due successi recenti di rilievo. I biomateriali sviluppati in ingegneria dei tessuti sono sempre più accessibili, con la possibilità di trasferire tali protocolli per laboratori meno specializzate. Un campo innescato beneficiare attraverso crescente utilizzo di biomateriali è la diagnosi in vitro.

Studi in vitro sono una piattaforma importante per indagare vie di segnalazione intra-cellulari all'interno singoli tipi di cellule, e hanno contribuito a delineare meccanismi alla base numerosi pathophysiologies malattia. Questi studi in genere si basano su un singolo tipo cellulare in coltura come un monostrato su coltura tissutale di plastica (TCP); un (2D) superficie rigida bidimensionale molto meno elastica e porosa rispetto ai tridimensionali cellule (3D) di ambiente sono esposti a meno di un tessuto o organo. I modelli animali sono stati tradizionalmente employed confermare effetti riscontrati in vitro anche tradurre al tessuto intero, e può anche essere utilizzato come piattaforme pre-clinici per investigare malattie umane. Tuttavia, le differenze tra le specie minano questo affidamento su modelli animali nella nostra comprensione delle malattie umane ^-. Ad esempio, molta comprensione dell'asma malattia polmonare si basa su un modello di topo nonostante le differenze intrinseche tra la condizione umana e questo modello compreso poche prove di infiltrazione mastociti delle vie aeree fascio muscolare liscia, o la capacità di sviluppo della malattia spontanea all'interno dell'animale modellare ^3,4. Ci sono anche considerazioni etiche riguardanti l'uso di modelli animali, con lo standard "3R" di "sostituzione, affinamento e riduzione" in sperimentazione animale essere incoraggiati nel Regno Unito e in altri paesi.

Una valida alternativa potrebbe essere la ricapitolazione di tessuti umani nella struttura creazione vitros per indagare la natura cooperativa tra i tipi di cellule umane adulte in una singola unità. Esistono Cells in strutture pluricellulari 3D all'interno del tessuto, ciascuno all'interno di un micro-ambiente unico. La coltura di cellule su TCP consente solo la cultura di monostrati cellulari, in grado di replicare questo ambiente, o fornire la capacità per la cultura multi-cellule. Biomateriali avanzamento offre l'opportunità di sviluppare entrambe le piattaforme naturali e sintetici 3D per coltura cellulare. ECM decellularized può essere utilizzato per la coltura cellulare 3D quando recellularized con altri tipi di cellule, comprese le cellule staminali ^1, tuttavia tali protocolli possono essere complessa e richiede tempo, con la disponibilità limitata di tessuto e in gran parte di origine non umana. Altri protocolli consentono un maggiore controllo sulle ambienti cellulari creati come nanoimprinting, ECM deposizione, tecnologie foglio cellulare o electrospinning. Electrospinning crea tappeti non tessuto 3D porosi di fibre con diametri da nanometro a micrometri, replicating dimensioni ECM naturali. Ponteggi elettrofilate sono sempre più utilizzati come piattaforme di coltura cellulare 3D ^-. La manipolazione dei parametri elettrofilatura permette il controllo intricato su caratteristiche patibolo come dimensione dei pori, diametro delle fibre, la topografia e l'allineamento, e la chimica di superficie. Alterazioni di tali parametri hanno dimostrato di influenzare direttamente adesione e crescita cellulare, quando le cellule sono state coltivate in isolamento.

Questi vantaggi sono state sfruttate nel presente studio per permettere la coltura di tipi di cellule come un unico costrutto tessuto 3D, utilizzando bronchiolo vie aeree come struttura tissutale modello 3D. La parete bronchiole consiste di tre regioni principali (Figura 1). La mucosa è dove le cellule epiteliali delle vie aeree siedono all'interfaccia aria-liquido (ALI), fornendo una barriera importante per l'ambiente esterno. Essi risiedono sulla membrana reticolare seminterrato (RBM), un ECM strettamente compatto composto principalmente di collagen IV, perlecans e laminine. Lo strato sub-mucosa è situato direttamente al di sotto della mucosa, una regione più porosa costituita da più tipi di cellule inclusi i fibroblasti, miofibroblasti e leucociti infiltranti in condizioni di malattia. Infine fasci muscolari lisce avvolgono le vie aeree in modo elicoidale e sono composti da fogli allineate di muscolatura liscia bronchiale (ASM). E 'stato contrattile relativo liscio del muscolo che controlla il tono delle vie aeree. L'impiego di ponteggi elettrofilate all'interno del sistema polmonare era fino a poco stato limitato a scopi rigenerativi; con un ricambio tracheale elettrofilate essere trapiantato con successo. Mentre il successo, tali trattamenti sono limitate in numero, e si concentrano sulla trachea a causa della semplice natura relativa della funzione del tessuto. Esistono esempi limitato di modelli vie aeree utilizzate per la diagnostica in vitro, e si concentrano principalmente su misure contrazione della muscolatura ^liscia,. Il non-tossico e nonn-degradabili polietilene polimero tereftalato (PET) è stata precedentemente elettrofilate, ed è stato impiegato in questo studio per garantire scaffold prodotti possono essere conservati per lunghi periodi senza degradare (permettendo loro di essere utilizzati "off the shelf"), e anche essere adatto per colture cellulari stabili per periodi di tempo prolungati. Studi precedenti del nostro gruppo hanno dimostrato che l'impiego di tre varianti di un protocollo di base elettrospinning, tre singoli ponteggi elettrofilate PET possono essere prodotti per fornire topografie ottimali per la coltura epiteliale delle vie aeree, fibroblasti e cellule muscolari lisce in isolamento ^21,22 e il coculture di vie respiratorie cellule epiteliali e fibroblasti ^22. Diametro Fiber è stato trovato per influenzare notevolmente la funzionalità epiteliale ^22, e l'allineamento fibra ha permesso la generazione di fogli allineate di muscolatura liscia ^21. Questi studi sono stati effettuati indipendentemente l'uno dall'altro, in condizioni statiche. Nel presente studio, questi differeponteggi nt, contenenti cellule umane completamente differenziate adulti sono stati messi in coltura per una settimana al ALI in un bioreattore disponibile in commercio come sezione 3D della parete bronchiale, fornendo un fisiologicamente rilevanti modello in vitro per indagare vie aeree risposte intercellulari. Mentre questo protocollo utilizza bronchiolo vie aeree come sistema modello, potrebbe essere adattato come una piattaforma per la coculture 3D di unità mucose da altri organi.

Protocollo

Cellule ASM primarie provenienti da individui non-asmatici sono stati isolati da biopsie bronchiali presso l'Ospedale Glenfield (Leicester, UK), come descritto in precedenza. La ricerca è stato approvato dal Comitato Etico Leicestershire ei pazienti hanno dato il loro scritto, consenso informato.

1. Electrospinning PET Ponteggi (Figura 2)

1. Preparare una soluzione (10 ml) di grado bevanda bottiglia in PET in 1: 1 diclorometano (DCMro) - soluzione di acido trifluoroacetico (TFA). Le concentrazioni di PET 8%, 30% e 10% peso / volume (peso / volume) sono richiesti per nanofibre, microfibra e allineati rispettivamente ponteggi e poi mescolare la soluzione O / N a temperatura ambiente per il PET a sciogliere.
2. Trasferire la soluzione in PET in una siringa e attaccare un 23-G (per nanofibre) o di un 18-G (per microfibra e allineato) ago alla siringa e inserire la siringa in una pompa a siringa motorizzata. Assicurarsi che la punta dell'ago viene ruotato verso il basso.
3. Posizionare la madistanza dalla punta dell'ago ndrel 15 cm, assicurando che l'ago è puntato al centro del tamburo.
4. Fissare la fornitura di energia elettrica per la punta dell'ago con pinze e mettere a terra il mandrino (tramite presa banana) a terra. Inserire l'alimentazione del mandrino e la velocità impostata su 60 giri (pari a circa 13,2 m · min ^-1) per nanofibre e microfibra ponteggi. Impostare la velocità di 2.000 giri al minuto (pari a circa 440 m · min ^-1) ponteggi per allineate.
5. Impostare la pompa a siringa ad una portata di 0,5 ml · h ^-1 per nanofibre ponteggi casuali e allineate o 2.0 ml · h ^-1 per ponteggi in microfibra. Lasciare che la pompa di funzionare fino a quando la soluzione è estrusa dalla punta dell'ago per rimuovere l'aria nel ago. Poi fermare la pompa.
6. Nella pompa a siringa, impostare il volume totale di soluzione da espellere a 2 ml e avviare la pompa.
7. Set tensione a 14 kV, e accendere il supp poterely.
8. Electrospin fino a 2 ml di soluzione è stato elettrofilate (4 ore per nanofibre e ponteggi allineati, 1 ora per ponteggi microfibra).
9. Tagliare il ponteggio con una lama lungo la larghezza del mandrino. Questo produce un foglio 2D dell'impalcatura la dimensione della superficie del mandrino (in questo caso, un foglio rettangolare di 22 centimetri x 11 cm), che può essere attentamente staccata mandrino). Conservare il patibolo in un foglio di alluminio per ridurre la carica elettrostatica).
   Nota: impalcature bifasica sono prodotte da sequenziale elettrospinning un'impalcatura nanofibre direttamente su un ponteggio in microfibra.

2. Sterilizzazione dei ponteggi preliminari per l'utilizzo in coltura cellulare

1. Dal foglio patibolo, punch out dischi di ponteggi bifasica o allineati con una penna biopsia 0,8 millimetri di diametro e attenersi a guarnizione inclusa, con acquario colla non tossici.
2. Sterilizzare scaffold mediante irradiazione ultravioletta per 30 min su ciascun lato dei ponteggi prima di ammollo in 20% Vol / vol soluzione antibiotica / antimicotico (2x10 ⁵ unità ml ^-1 penicillina G, 2.000 mg ml ^-1 solfato di streptomicina e 500 mcg ml ^-1 amfotericina B) O / N a 4 ° C.
3. Lavare ponteggi con PBS 3 volte e quindi memorizzare ponteggi in piastre e TCP in PBS a 4 ° C fino al momento dell'uso.

3. cellulari Costituenti cultura dei media

1. Cellule epiteliali Cultura CALU3 nei media DMEM-F12 integrato con siero di 10% vol / vol fetale bovino (FCS), soluzione 2 Nm L-glutammina, 1% vol / vol antibiotico / antimicotico soluzione (10.000 unità ml ^-1 di penicillina G, 100 mg ml ^-1 solfato di streptomicina e 25 mcg ml ^-1 amfotericina B).
2. Cultura MRC5 fibroblasti e cellule ASM nei media DMEM supplementato con siero di 10% vol / vol fetale bovino (FCS), soluzione 2 Nm L-glutammina, 1% vol / vol antibiotico / antimicotico soluzione (10.000 unità ml ^-1 di penicillina G, 100 mg ml ^-1 solfato di streptomicina e 25 mcg ml ^-1 amfotericina B).
3. Cultura cellule epiteliali-fibroblasti-ASM co-culture in DMEM-F12 70:30: miscela dei media DMEM.

4. Semina di fibroblasti e cellule epiteliali sul bifasica Scaffold

1. In una piastra di coltura tissutale, immergere i ponteggi nei media DMEM-integrati e incubare a 37 ° C per 1 ora prima della semina delle cellule.
2. Rimuovere il supporto DMEM-integrati, posizionare la fase in microfibra di ponteggio in direzione apicale e seminare 1.5 x10 ⁴ MRC5 cellule di fibroblasti in 30 ml di media DMEM-integrati. Agitare piastra su un agitatore orbitale per 2 ore, prima di lasciare in un incubatore a 37 ° C 5% di CO ₂ in aria O / N.
3. Girare il ponteggio su cui la fase di nanofibre di impalcatura volti apicale, semi di 3,0 x10 ⁴ CALU3 cellule epiteliali in 30 ml di media-F12 integrato DMEM sulla fase di nanofibre del patibolo e incubare for 2 ore a 37 ° C, 5% CO ₂ in aria prima immergendo l'impalcatura in 70:30 DMEM-F12: DMEM supplementato supporto O / N prima di trasferire al bioreattore.

5. Semina delle cellule ASM sul Allineati impalcatura

1. In una piastra di coltura tissutale, immergere i ponteggi in mezzi DMEM supplementato e incubare per 1 ora a 37 ° C prima della semina 2,5 x10 ⁴ cellule in 30 ml di DMEM-supporti integrati e incubazione per 2 ore (37 ° C, 5% CO ₂ in aria). Immergere ponteggio in DMEM supplementato ritorno media per incubatore e lasciare O / N prima di impostare un tri-cultura nel bioreattore.

6. Costituzione il Tri-cultura utilizzando il sistema di bioreattore (Figura 7)

1. Posizionare la guarnizione scaffold bifasico nella scanalatura entro una camera con la fase epiteliale rivolto verso l'alto nella camera.
2. Posizionare il ponteggio allineato sotto il ponteggio bifasico (quindi è adiacente al microfiber fase del patibolo bifasica) e bloccare le due camere del bioreattore insieme.
3. Assemblare due circuiti di flusso perfusione collegati a due serbatoi medi (i media DMEM-F12-integrati nel serbatoio apicale, DMEM-F12 / media DMEM-integrati nel serbatoio basale) e supporti di pompaggio intorno ai due circuiti di circa 0,1 ml / min con una pompa peristaltica (40 ml supporto viene riciclato attraverso ogni circuito). Casa tutte le parti del sistema in un incubatore a 37 ° C, 5% CO ₂ in aria.
4. Dopo una settimana, rimuovere il supporto dalla camera apicale, e coltivare le cellule epiteliali del ALI per un'altra settimana prima dell'analisi.

Risultati

Immagini al microscopio elettronico a scansione di tessuto delle vie aeree decellularized o immagini immunoistologici da biopsie delle vie individuate le caratteristiche desiderabili del ECM vie respiratorie abbiamo voluto introdurre nella elettrofilate topografie scaffold: matrice nativa RBM è costituito da fibre di circa 153 nm ± 30.6 nm (media ± SD n = 50 misurazioni ) di diametro (Figura 3A e 5A), mentre la matrice circostante il meccanismo è stato più poroso in natura (Figura 3C). Sezioni immunoistologiche attraverso fasci muscolari lisce mostrano ASM presenti come fogli allineati di cellule ²¹ (Figura 3E). Queste informazioni sono state usate per guidare le caratteristiche introdotte nei ponteggi elettrofilate. Un mandrino rotante è in grado di ruotare in modo stabile a velocità elevate (> 2.000 giri / 440 m · min ^-1) per produrre scaffold con fibre allineate. Lenta rotazione mandrino (60 rpm 13,2 m · min ^-1) non ha influenzato l'orientamento delle fibre, Ma prodotto scaffold di spessore più uniforme rispetto a quando electrospinning su un piatto statica. Modificando i parametri electrospinning (concentrazione PET e portata di soluzione), è stato possibile creare fibre ponteggi con diametri diversi micrometri o centinaia di nanometri (parametri electrospinning sono indicati nella Tabella 1).

Fibre elettrofilate con diametri delle fibre equivalenti alle fibre naturali RBM (150 nm) sono state prodotte utilizzando una soluzione PET 6%, tuttavia a tali concentrazioni basse PET, bordatura delle fibre si è verificato (Figura 4A). Questo è stato eliminato aumentando la concentrazione della soluzione PET all'8% che produceva nanofibre uniformi possedere un diametro medio di 255 nm ± 2,4 nm (media ± SEM) e la dimensione media dei pori di 1,43 micron ± 0,02 micron (Figure 4B, 5A e B). Per electrospin nanofibre è stato necessario ridurre la dimensione degli aghi da 18 G a 23 G, che consente velocità di flusso più lento whilst mantenere una velocità di flusso maggiore e riducendo ago blocco, un problema ricorrente con l'ago più grande. Quando electrospinning microfibre, un aumento in soluzione PET> 30% di piombo PET ad una mancanza di uniformità nel diametro della fibra (Figura 4F) oltre a più blocchi alla punta dell'ago a causa della elevata viscosità della soluzione. Stuoie microfibra uniformi possiedono un diametro medio delle fibre di 2,50 micron ± 0,02 micron (media ± SEM) e la dimensione media dei pori di 10,45 micron ± 0.13 micron sono state prodotte quando electrospinning una soluzione PET peso / volume 30% ad un flusso di 2 ml / h ^-1 (Figure 4F, 5A e B). Electrospinning sequenziale del ponteggio nanofibre direttamente su un ponteggio microfibra (ancora attaccato al mandrino) ha creato un ponteggio bifasico (Figura 3D). I diametri medie in fibre erano 280 nm ± rispettivamente 20 nm e 2.30 micron ± 0,06 micron per le fasi nanofibre e microfibra,paragonabile alle dimensioni delle singole nanofibre e microfibra ponteggi. Inoltre, lo spessore dello scaffold bifasica era simile alla somma delle singole nanofibre e microfibra scaffold (Figura 5C). Attraverso aumentando la velocità del mandrino (2.000 giri / 440 m · min ^-1), sono stati prodotti altamente allineati nano o microfibra impalcature. La soluzione PET peso / volume dell'8% non era ottimale per la produzione di nanofibre allineate e fibre prodotte in possesso di una morfologia ondulata (Figura 3F). Un aumento del 10% PET annullato questo effetto, ma ancora determinato un diametro della fibra ridotta (216 nm ± 2,2 nm (media ± SEM)) rispetto ai ponteggi nanofibre allineate in modo casuale. Allineamento delle fibre è stata calcolata determinando la deviazione dell'angolo di ciascuna fibra dall'angolo fibra medio. In ponteggi nanofibre allineate 79% di fibre sono state allineate (± 10 ° angolo di fibra medio) rispetto al 10,2% di fibre in allineate in modo casuale Scaff nanofibreolds (Figura 5D).

Il nanofibre patibolo l'8% è stato utilizzato per ricapitolare la RBM in cui le cellule epiteliali risiedono, ed è stato utilizzato per sostenere la coltura di cellule CALU3 (una epiteliale delle cellule-line delle vie aeree). Il peso / volume microfibra patibolo il 30%, essendo più poroso in natura è stato utilizzato per simulare la regione sub-mucosa, e fu colta con MRC5 cellule (fibroblasti una cella della riga delle vie aeree). Il 10% peso / volume nanofibre allineate ponteggio fornite riferimento topologica per garantire l'allineamento delle cellule ASM quando coltivate sul patibolo. Tutti e tre i tipi di cellule hanno mostrato un aumento della redditività quando coltivate sulle impalcature individuali per un periodo di due settimane (figura 6A), e ha espresso delle cellule di tipo proteine ​​specifiche dopo il periodo di due settimane cultura (Figura 6B, 6C, e 6D). Un'ulteriore caratterizzazione delle singole interazioni cellula-patibolo sono stati riportati altrove ^21. La elettrofilatura sequenziale del patibolo nanofibresul patibolo in microfibra prodotto un ponteggio bifasico per la co-coltura delle cellule epiteliali CALU3 e cellule di fibroblasti MRC5 sulle fasi di nanofibre e microfibra, rispettivamente. La coltura delle due celle insieme in condizioni statiche stato segnalato altrove ^22. Ulteriori lavori tentativo di aggiungere altri strati di cellule o di estendere gli orari di coltura bifasica oltre due settimane in condizioni statiche non ha avuto successo (dati non riportati). Per la cultura di un modello a tre livelli per un periodo prolungato, abbiamo usato un bioreattore a flusso di perfusione. Il CALU3 e MRC5 cellule sono state seminate su scaffold bifasico, e cellule ASM seminate su un ponteggio allineati, ed entrambi sono stati coltivati ​​separatamente per 2 giorni. I due scaffold sono stati poi acquistati insieme per formare un modello a tre strati della parete delle vie aeree nel bioreattore (Figura 7). Entrambe le camere sono stati perfusi con i media per 7 giorni prima della camera di epiteliale apicale aveva i suoi mezzi rimossi e le cellule epiteliali sono state coltivate inALI per altri 7 giorni. Ponteggi erano fissi e uno sezionati e macchiati, o ponteggi interi stati immunostained per i marcatori specifici delle cellule. Sezioni attraverso la cultura tri-strato mostrato nuclei cellulari distribuiti attraverso i tre strati della co-coltura (Figura 8B). Quando le cellule sono state immunostained per marcatori specifici delle cellule, cellule epiteliali popolate fase nanofibre apicale come cella strato confluenti e colorate positive alla citocheratina (Figura 8C), sulla fase microfibra, fibroblasti colorate positivamente per S100A4 (Figura 8D), e i allineate 10% di cellule patibolo ASM colorate positivo per SM22α (Figura 8E), che indica bene la sopravvivenza di ogni tipo cellulare all'interno del modello 3D della parete delle vie aeree.

Figura 1. Il bronchioli vie respiratorie. Biopsia bronchiale da un gravevie aeree asmatico mostrando l'epitelio sulla membrana reticolare seminterrato (MLF), con la regione sottomucosa sottostante popolata con cellule mesenchimali, ed i fasci muscolari lisce circostanti popolati con le cellule muscolari lisce colorate per muscolo liscio alfa-actina (marrone). Bar Scala indica 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Un schematica dell'apparecchiatura elettrofilatura. Una siringa contenente la soluzione di polimero / solvente (con ago) è posto su una pompa a siringa fronte al mandrino. Un potenziale elettrico viene stabilito tra le fibre di aghi e mandrino causando di essere espulsi dalla punta dell'ago e depositati sul mandrino rotante. Come la fibra passa attraverso l'atmosfera,il solvente evapora causando deposizione di fibre polimeriche sul mandrino. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Confronto di ponteggi elettrofilate per nativo ECM vie respiratorie. Immagini al microscopio elettronico a scansione di membrana decellularized seminterrato (A), via aerea decellularized bronchiole sezione (C) e una sezione istologica di una via aerea fascio muscolare liscio (colorato con ematossilina eosina, scala bar 40 micron) (E) rispetto a nanofibre (B) bifasico (D) e allineate (F) impalcature PET. Clicca qui per vedereuna versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Parametri utilizzati per electrospinning microfibra, nanofibre e allineati ponteggi individualmente e per il patibolo bifasica.

Figura 4. Alterazione concentrazioni PET incide caratteristiche della fibra. Immagini al microscopio elettronico a scansione di ponteggi elettrofilate filate dal 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% e 35% (EG) (peso / volume) soluzioni PET . Anche mostrato sono ponteggi allineati prodotte dall'8% (D) e il 30% soluzioni PET (H) peso / volume. DC ripreso a 5,000X ingrandimento, EH ripreso a 1,000X ingrandimento. Clicca qui per vedere una più grandeversione di questa figura.

Figura 5. Proprietà dei ponteggi PET elettrofilate. Curve (A) di distribuzione che mostra la distribuzione diametro delle fibre dalla membrana reticolare seminterrato matrice extracellulare (RBM ECM), allineate in modo casuale nano e micro-fibra ponteggi, e il patibolo nanofibre allineate. (B) Istogramma che mostra la distribuzione delle dimensioni dei pori relativa in nano e micro-fibra impalcature. (C) Spessore medio delle nanofibre, microfibra, impalcature bifasico e allineate (media ± deviazione standard, n = 6). (D) Istogramma grafico che mostra la deviazione dalla media orientamento delle fibre in ponteggi casuali o allineati nanofibre analisi fibra impalcatura è stata effettuata utilizzando il software ImageJ. Pleasing clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. La cultura dei singoli tipi di cellule sulle singole impalcature. (A) i risultati del test di vitalità cellulare alamarBlue per celle ASM su ponteggi allineate, le cellule CALU3 sui ponteggi nanofibre e MRC5 celle scaffolds microfibra (media ± SEM, n = 3- 20). Immagini al microscopio elettronico a scansione di nanofibre, in microfibra e ponteggi fibre allineate (rispettivamente B, C e D) e le immagini di immunofluorescenza di cellule CALU3 colorate per E-caderina (rosso), MRC5 cellule colorate per vinculin (rosso) e le cellule ASM colorate per SM22α (rosso) tutta la loro impalcatura specializzata (E, F e G, rispettivamente). Hoechst è stata utilizzata per colorare i nuclei (blu), barra della scala indica 40 &# 181;. M Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7. Sistema di perfusione per tri-strato di modello a parete delle vie aeree. (A) Fotografia di nave bioreattore collegato alla pompa peristaltica e 2x serbatoi dei media. (B) Schema degli scaffold tri-strato. (C) Schema dei due circuiti bioreattore quando il modello delle vie aeree si tiene all'interfaccia aria-liquido. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8. Complete 3D modello da parete delle vie aeree. (A) biopsia bronchiale di parete delle vie aeree con lo strato mucoso evidenziato in rosso, la regione sottomucosa evidenziata in verde, e il fascio muscolare liscio evidenziato in oro. (B) Sezione di parete delle vie aeree a tre strati composto da impalcature bifasiche e allineati popolate con epiteliale, fibroblasti e cellule muscolari lisce fisse dopo 2 settimane di co-coltura. Nuclei delle cellule sono state colorate con DAPI (blu) con impalcatura riflettanza (grigio) contemporaneamente ripreso. Ponteggi sono stati fissati e immunostained per marcatori specifici delle cellule dopo 2 settimane, con le cellule CALU3 colorate per citocheratina (verde) (C), MRC5 cellule colorate per S100A4 (verde) (D), e le cellule muscolari lisce colorate per SM22α (red) ( E). Bar Scala indica 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1.

Discussione

La capacità di electrospin fibre polimeriche con proprietà strutturali paragonabili a ECM naturale è portato a numerosi polimeri naturali o sintetici, o miscugli di polimeri essendo elettrofilate ricreare questi ^ambienti,. La manipolazione dei parametri di processo (tra cui la scelta del polimero, concentrazione del polimero, solventi, la distanza punta dell'ago e temperatura) tutti possiamo caratteristiche influenza impalcature; tuttavia alcuni parametri possono avere un impatto maggiore sulle proprietà impalcatura di altri ^25,. Quando si modifica diametro della fibra PET, abbiamo trovato i parametri chiave per la concentrazione del polimero utilizzato, la velocità alla quale la soluzione polimerica era elettrofilate, e il diametro dell'ago. Quando electrospinning fibre allineate i parametri chiave sono il metodo di raccolta utilizzato (un mandrino rotante), e la velocità con cui ruota il mandrino. Attraverso la riduzione della velocità del mandrino a 60 giri al minuto, abbiamo trovato le impalcature allineate casualmente prodotte hanno mostrato maggiore uni ponteggioformità rispetto ad electrospinning su un piatto collettore piano.

Le caratteristiche dei tessuti delle vie aeree decellularized sono stati analizzati a fornire indicazioni per le varie topografie scaffold sviluppati per la cultura di ogni vie aeree tipo cellulare. Nanofibre elettrofilate sono un'impalcatura attraente per replicare strutture membrana basale a causa della piccola dimensione dei pori ma elevata porosità complessiva che permette di aumentare la diffusione metabolita pur limitando il movimento cellulare. ⁹ ottimizzando i parametri electrospinning, un intervallo di concentrazioni PET e portate sono stati testati. Le fibre più sottili sono stati ottenuti usando una soluzione peso / volume PET 6%, utilizzato in precedenza da altri gruppi. Tuttavia, gli alti livelli di bordatura, e una mancanza di uniformità erano problemi costanti. I primi tentativi per rimuovere la bordatura inclusa l'aggiunta di un tensioattivo cationico, cetiltrimetilammonio bromuro (CTAB), alla soluzione di abbassare la tensione superficiale, e testando varie fontidi PET. L'aggiunta del tensioattivo ridotto la quantità di bordatura, ma non completamente. Dopo aver provato un certo numero di fonti commerciali di pellet di PET, bevanda commestibile bottiglia in PET è stato utilizzato, tagliando bottiglie per bevande e sciogliere questi nella DCM: solvente TFA. Usando questo come sorgente PET ha comportato un aumento in fibra uniformità e una riduzione in fibra bordare. Aumentando la concentrazione della soluzione leggermente a 8% in peso / vol e riducendo il diametro dell'ago (18G a 23G) abbiamo costantemente prodotto nanofibre difetto liberi con un diametro di fibra di circa 250 nm. Ponteggi nanofibre elettrofilate possono essere altamente elettrostatiche al momento del ritiro dal mandrino facendo movimentazione manuale degli scaffold difficili. Questa è stata migliorata memorizzando i ponteggi in un foglio di alluminio dopo la filatura e immersi nel 70% IMS prima dell'uso. Questo sembrava contribuire a dissipare la carica elettrostatica residua sul patibolo dal processo electrospinning.

Per fornire topographies simile ai singoli microambienti incontrate dalle tre principali tipi di cellule delle vie aeree all'interno della parete delle vie aeree, un protocollo di base elettrospinning è stato adattato per la produzione di tre ponteggi unici per questi tipi di cellule: da elettrospinning una soluzione bassa concentrazione PET lentamente, sono stati generati nanofibre allineate in modo casuale, su cui le cellule epiteliali sono state seminate (mimando l'RBM). Con electrospinning una soluzione PET concentrazione superiore ad una velocità maggiore, sono stati generati microfibre allineate casualmente (producendo un'impalcatura più poroso), in cui fibroblasti sono stati seminati (mimando l'area sub-mucosa immediatamente sotto la RBM). Con electrospinning una soluzione a bassa concentrazione PET su una elevata velocità mandrino allineato nanofibre rotante sono stati prodotti, su cui le cellule muscolari lisce orientate nella direzione delle fibre, producendo fogli di cellule allineate.

Diametri delle fibre ad incrementare il vantaggio di una maggiore dimensione dei pori, permettendo una maggiore penetratio cellularen in impalcature e così contribuire a creare un vero ambiente ^3D,. Ponteggi microfibra sono stati impiegati per la coltura di fibroblasti in studio per garantire che le cellule risiedevano su più piani all'interno del ponteggio. Aumentando la concentrazione di PET al 30% peso / volume, sono state prodotte fibre di PET con un diametro medio di 2,5 micron. Fibre di diametro maggiore (≈ 4 micron) sono stati prodotti utilizzando una soluzione di PET peso / volume del 35%, ma uniformità di spessore patibolo è stato perso, e una maggiore variabilità tra le singole fibre era evidente. I pori della patibolo microfibra sono stati oltre 7 volte superiore rispetto a quelli misurati in scaffold nanofibre (10,45 micron vs 1.43 micron, rispettivamente), ma semina ancora statica delle cellule forniti penetrazione cellulare limitato. Questa è stata migliorata mediante inseminazione dinamicamente le cellule utilizzando un miscelatore orbitale, un metodo dimostrato di essere efficace in precedenza.

Impalcature nanofibre altamente allineati sono stati creati da elettrospinning 10%wt / vol soluzione PET sul mandrino rotante a 2.000 giri (≈ 440 m · min ^-1). La concentrazione di PET è stato aumentato da 8% per evitare una morfologia ondulata irregolare che fibre esposte a concentrazioni inferiori. Nonostante l'aumento della concentrazione, allineando le fibre ridotto il diametro medio delle fibre (216 nm contro 255 nm, allineato rispetto casuale). L'alta velocità del mandrino disegnare le fibre fuori prima che abbiano secca è probabile che a causare questo effetto. L'allineamento delle fibre influenzato l'allineamento delle cellule ASM, e ha anche altri effetti fisiologici sulle cellule ASM che sono stati caratterizzati altrove ^21.

Il principale limite di questo protocollo è l'incapacità di cellule vive di immagine sulla / nella scaffold rendendo cella attaccamento o differenziazione iniziale per un periodo di tempo prolungato impossibile determinare senza sacrificare campioni. Questo significa che la maggior parte di ottimizzazione si verifica dopo il periodo di coltura, cioè fissareing campioni e poi misurare se la coltura cellulare ha avuto successo dopo non durante coltura cellulare. Osservando un cambiamento di colore di ponteggi incubate a alamarBlue (blu al rosa) indica le cellule sono presenti e vitali, ma non è l'ideale. Elettrofilatura polimeri più trasparenti come la gelatina potrebbero aiutare a visualizzare le cellule sulle impalcature. La electrospinning di un ponteggio nanofibrous nel nostro modello ha permesso la replicazione del RBM vie aeree, analogamente composto da nanofibre densi in cui le cellule epiteliali risiedono. È stato precedentemente dimostrato che le cellule strutturali non possono migrare attraverso il nanofibre ponteggio ^22, anche se le cellule immunitarie sono in grado di (dati non mostrati). Pur vantaggiosa per coltura di specifici tipi di cellule su una superficie 3D (quali cellule epiteliali ed endoteliali), tale prevenzione della migrazione cellulare strutturale attraverso nanofibre possono essere dannosi per la coltura di altri tipi di cellule. Come muscolatura liscia è in grado di migrare attraverso the allineato nanofibre impalcatura abbiamo assemblato la co-coltura tri-strato con il muscolo liscio e strati di fibroblasti di fronte all'altro (opposizione al patibolo allineati che separa i due tipi di cellule). Mentre questo permette alle cellule di essere in stretta apposizione, questo studio non può concludere se un tipo cellulare (sia fibroblasto o muscolo liscio) avrebbe superato tutto lo strato per un periodo più prolungato coltura. Nonostante queste limitazioni, un modello tri-strato praticabile della parete bronchiale è stato sviluppato che fornisce una piattaforma alternativa per indagare le interazioni tra questi diversi tipi di cellule. Uno studio simile tri-strato è stato recentemente pubblicato in cui fibroblasti sono stati incorporati entro un collagene cilindrica I idrogel con muscolatura liscia seminati sulla superficie esterna e le cellule epiteliali all'interno della superficie luminale ^17. La stabilità meccanica degli scaffold elettrofilate sviluppati qui permetterebbe tubolare simile costruisce a formarsi, e rimane un resea correnterch scopo all'interno del nostro gruppo. Mentre lo studio è concentrata sulla vie aeree, diversi organi all'interno del corpo condividono questa unità strutturale mucosa base, e attraverso la modifica inquilini evidenziato in questo studio, piattaforme simili potrebbero essere sviluppati per tessuti contenenti un'unità membrana basale compreso vasi sanguigni, la vescica e la cornea, in cui sono stati impiegati modelli basati multistrato collagene.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Flaconi in polietilene tereftalato (PET)	Lucozade (GSK)	N/A	Fonte di PET per elettrofilatura. Tagliare in piccoli pezzi e pesare secondo necessità
Diclorometano (DCM)			Solvente per PET
: Acido trifluoroacetico (TFA)	Solvente Sigma		per PET
Mandrino rotante	Costruito in casa		Utilizzato per raccogliere le fibre elettrofilate. Ruotando a velocità diverse, le fibre possono essere allineate o orientate in modo casuale
Pompa a siringa	Apparecchio		utilizzato nel processo di elettrofilatura
DMEM-F12	Gibco		per cellule CALU3
GIBCO		DMEM	cellule HASM
GIBCO		MEM	cellule MRC5
Antibiotico/antimicotico soluzione	Integratore Gibco		Media
FCS	Integratore Gibco		Media
Miscelatore orbitale (Orbital shake 503)	Stuart Scientific		Per la semina dinamica di cellule su scaffold in microfibra
Pompa peristaltica	Watson Marlow		per il flusso dei terreni attraverso il bioreattore
3DKube	Kiyatec		Bioreattore per colture cellulari 3D