L&#39;osservazione del movimento ciliare delle cellule epiteliali del plesso coroide<em&gt; Ex Vivo</em

Sommario

In questo studio, una tecnica dettagliata di microscopia ottica è stata ottimizzata per l'osservazione e l'analisi in tempo reale del movimento delle ciglia CPEC ex vivo insieme a un metodo di microscopia elettronica per l'analisi ultrastrutturale.

Abstract

Il plesso coroideo si trova nella parete ventricolare del cervello, la cui funzione principale si ritiene sia la produzione di liquido cerebrospinale. Le cellule epiteliali del plesso coroideo (CPEC) che ricoprono la superficie del tessuto del plesso coroideo ospitano più ciglia uniche, ma la maggior parte delle funzioni di queste ciglia rimane da studiare. Per scoprire la funzione delle ciglia CPEC con particolare riferimento alla loro motilità, è stato sviluppato un sistema di osservazione ex vivo per monitorare la motilità ciliare durante i periodi embrionali, perinatali e postnatali. Il plesso coroideo è stato sezionato dal ventricolo cerebrale e osservato con un microscopio a contrasto potenziato da video dotato di ottiche a contrasto di interferenza differenziale. In questa condizione, è stato sviluppato un metodo semplice e quantitativo per analizzare i profili mobili delle ciglia CPEC per diverse ore ex vivo. Successivamente, i cambiamenti morfologici delle ciglia durante lo sviluppo sono stati osservati mediante microscopia elettronica a scansione per chiarire la relazione tra la maturità morfologica delle ciglia e la motilità. È interessante notare che questo metodo potrebbe delineare i cambiamenti nel numero e nella lunghezza delle ciglia, che hanno raggiunto il picco al giorno postnatale (P) 2, mentre la frequenza del battito ha raggiunto un massimo a P10, seguito da una brusca interruzione a P14. Queste tecniche consentiranno di chiarire le funzioni delle ciglia in vari tessuti. Mentre le tecniche correlate sono state pubblicate in un precedente rapporto¹, il presente studio si concentra su tecniche dettagliate per osservare la motilità e la morfologia delle ciglia CPEC ex vivo.

Introduzione

Le ciglia sono sporgenze simili a peli sulla superficie della maggior parte delle cellule dei vertebrati, che hanno attirato l'attenzione dei ricercatori medici a causa di una classe di malattie chiamate ciliopatie ^2-4. Nonostante l'espressione ubiquitaria dell'organello, è stata riportata un'ampia varietà di funzioni ciliari, tra cui la motilità e il biosensing. Ad esempio, le ciglia mobili sulla superficie mucoepiteliale trasportano il muco⁵ e i detriti epiteliali allo sbocco dei tratti, prevenendo così la malattia liberando la superficie dagli epiteli. Inoltre, durante i primi periodi di sviluppo e gli stadi embrionali, le ciglia regolano la proliferazione delle cellule staminali⁶ e sono coinvolte nella determinazione dell'asimmetria sinistra-destra del corpo dei vertebrati⁷.

Le cellule epiteliali del plesso coroideo (CPEC) sono derivati delle cellule neuroepiteliali che ricoprono la superficie del tessuto del plesso coroideo nel cervello, che svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi dell'ambiente intracranico attraverso la produzione di liquido cerebrospinale (CSF). È stato precedentemente dimostrato che le CPEC hanno più ciglia non mobili che regolano la produzione di CSF attraverso recettori accoppiati a proteine G che sono specificamente concentrati sulle ciglia⁸. Sebbene queste ciglia fossero state considerate come ciglia quiescenti non mobili, è stato scoperto che alcune ciglia CPEC mostrano una motilità transitoria durante il periodo neonatale¹. Questa scoperta è stata molto importante perché ha rivelato che le cosiddette ciglia non mobili non sono necessariamente immobili fin dall'inizio dello sviluppo e potrebbero mostrare una motilità transitoria durante specifiche finestre temporali, possibilmente in risposta a specifiche richieste e funzioni fisiologiche⁹. Per descrivere con precisione la natura mobile delle ciglia CPEC, è necessario sviluppare un sistema di osservazione ex vivo che comprenda l'analisi dei profili cinetici unici delle ciglia CPEC.

Per quanto riguarda la motilità, sebbene diversi rapporti tecnici abbiano descritto osservazioni delle ciglia mobili dell'epitelio tracheale^5,10, dei flagelli monocellulari mobili¹¹, delle cosiddette ciglia mobili convenzionali¹² e delle ciglia nodali¹³, i metodi analitici dettagliati applicabili a strutture relativamente ondulate come il plesso coroideo non sono stati finora ben documentati. Inoltre, è richiesta un'elevata risoluzione temporale per analizzare il movimento ciliare dei CPEC, in cui sono indispensabili costose telecamere ad alta velocità. Per aggirare questa necessità e semplificare il monitoraggio della motilità ciliare di vari tipi di cellule, è stata introdotta una telecamera a basso costo e ad alta velocità, ed è stato sviluppato un metodo facilmente accessibile e conveniente per registrare la motilità delle ciglia mobili, in particolare per descrivere la velocità e il modello di movimento di ciascun cilio¹. Inoltre, è stato utilizzato il software di analisi delle immagini originale "TI Workbench" per facilitare l'analisi dettagliata della motilità. Nel complesso, questo metodo fornisce una nuova strategia concisa per analizzare il movimento ciliare insieme alla microscopia elettronica a scansione correlativa (SEM), che può essere adottata in un'ampia gamma di ricerche sul ciglio.

Protocollo

I protocolli e l'uso di animali da esperimento sono stati approvati dalla cura degli animali e l'uso dei comitati istituzionali presso l'Università di Yamanashi e Waseda University. La cura degli animali è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzionali.

1. CPEC Preparazione

1. Preparare i seguenti apparati e materiali: un microscopio stereo, preferibilmente in grado di trasmettere illuminazione dal basso; un paio di pinze da orologiaio (Dumont # 3 o # 4), sterilizzata fiamma, forbici operativi diritte, sterilizzato fiamma; due sterili piatti 10 centimetri di plastica contenenti 20 ml ghiacciata Leibovitz L-15; 35 millimetri piatti con fondo di vetro, contenenti 2 ml di RT Leibovitz L-15; un becher da 100 ml contenente 70% di etanolo; cuccioli neonatali mouse.
2. Brevemente immergere un mouse neonatale in 70% di etanolo e eutanasia rapidamente decapitazione utilizzando le forbici operativi.
3. Mettere subito la testa in gelida Leibovitz L-15 di media sterile 10 centimetri dish.
4. Togliere la pelle dai calvaria utilizzando la coppia di pinze orologiaio, tagliare aprire il cranio per esporre il cervello, e quindi tagliare i nervi cranici per isolare tutto il cervello.
5. Trasferire il cervello per un nuovo piatto contenente ghiacciata Leibovitz L-15 a medio e osservare al microscopio stereo, facendo in modo che il cervello è completamente immerso nel mezzo.
6. Impostare la parte dorsale del cervello rivolto verso l'alto, e orientare il cervello in modo che i bulbi olfattivi risiedono nella posizione 03:00 (per le persone destri). Tenere il cervello leggermente con le pinzette nella mano sinistra.
7. Utilizzando le pinze dissezione fini (Dumont # 3 o 4 #) nella mano destra, tagliare il corpo calloso e sotto il parenchima che collega gli emisferi cerebrali, lungo la fessura longitudinale del cervello.
8. Spingere delicatamente gli emisferi cerebrali via ai fianchi laterali ed esporre la fessura cerebrale trasversale.
9. Separare gli emisferi pizzicando fuori the parenchima tra l'emisfero e talamo.
10. Estrarre delicatamente i laterali plesso coroideo ventricolari che è attaccato alla parte laterale dell'ippocampo dal Affixa lamina.
11. Trasferire i isolati plesso coroideo al piatto fondo di vetro 35 millimetri contenente fresco Leibovitz L-15 di media, e sovrapporre un peso (Materials List) delicatamente per tenere il tessuto in luogo.

2. Immagini dal vivo di CPEC Cilia

1. Verificare il corretto raggi ultravioletti (UV) e il filtro dedotto (IR) taglio (s) per bloccare luminosa inferiore a 400 nm e più di 700 nm, e che a densità neutra (ND) Filtri (25% e il 6%), sono inseriti nel percorso di luce del microscopio invertito.
2. Regolare la messa a fuoco della lente obiettivo rudemente per occhio, e quindi regolare il condensatore in modo che il centro ed il fuoco per conformarsi alla illuminazione Köhler. Inserire un contrasto interferenziale differenziale appropriata (DIC) prisma, un elemento DIC, nonché analizzatore e polarizzatore elementi in lipercorso ght di conformarsi alle ottiche DIC.
3. Regolare il contrasto di vista dalla posizione del prisma DIC modo che la struttura della superficie del tessuto è più riconoscibile. Se tutti cilia delle cellule bersaglio sono mobili, una chiara visione di ciglia motile non può essere ottenuta con occhio a causa del loro movimento.
4. Modificare il percorso della luce per la videocamera, e rimuovere i filtri ND per aumentare la potenza della luce.
5. Usare la fotocamera in modalità di messa a fuoco per regolare il campo visivo e messa a fuoco. Durante la messa a fuoco, in cui le immagini video vengono visualizzati in tempo reale sul monitor, una chiara visione di ciglia motilità non è disponibile.
6. Usare la fotocamera a 200 Hz con un tempo di esposizione di 0,1 ms per il periodo desiderato (secondi a minuti). Dopo l'acquisizione della pila di immagini, singoli fotogrammi visualizzeranno strutture ciliari chiare. Se i bordi ciliari sono sfocate, di aumentare la frequenza dei fotogrammi o utilizzare un tempo di esposizione più breve.
7. Registrare il movimento di CPEC ciglia entro 25-60 minuti dopo l'eutanasia in LeibovitzL-15.

3. Analisi del Movimento ciliare

1. Tenere traccia manualmente battendo i modelli di ogni ciglio sul monitor del computer. Segna posizioni punta ciliare in ogni fotogramma con il puntatore del mouse, che vengono assemblati per informazioni traiettoria di ogni ciglio. O analizzare le informazioni traiettoria con lo stesso software o esportare in altre applicazioni più generali per ulteriori analisi. L'efficienza di questa fase di analisi è descritto nella discussione.
2. Classificare le traiettorie in due modalità di movimento, avanti e indietro o di rotazione, a occhio.
3. Calcolare la frequenza battito ciliare (CBF) utilizzando la seguente formula: [CBF = (numero di fotogrammi al secondo) / (numero medio di frame per un singolo battito)] ^14, che può essere ottenuto da un diagramma di moto punta ciliare (Figura 3 ). Ripetere questo calcolo per più cicli battito ciliare, perché altra cilia sulla stessa cella può interferire con il movimento di ciascun cilium, con conseguente irregolarità.
4. Per analizzare l'uniformità angolare del battito ciliare assi all'interno di una singola cella, definire l'angolo θ battitura per ogni traiettoria (Figura 4). Per traiettorie indietro e indietro, misura le posizioni della punta cilia a una linea retta, e definire θ come l'angolo del segmento fa con asse x. Per traiettorie rotazionali, montare le posizioni ad un'ellisse, e definire θ come l'angolo l'asse maggiore dell'ellisse fa con asse x. I dettagli del montaggio sono descritti nella sezione risultati rappresentativi.
5. Per una descrizione quantitativa di ogni traiettoria, calcolare generalizzata proporzioni AR. Brevemente, ruotare la traiettoria - θ e definire AR come il rapporto tra le larghezze della distribuzione lungo x - e -axes y (Figura 4B). I dettagli sono indicati nella sezione risultati rappresentativi, e l'interpretazione, Significato, e la limitazione del parametro sono descritti nella discussione.

4. Preparazione del campione per SEM

Nota: SEM è un metodo importante per valutare lo stato delle ciglia su CPECs in modo globale. Per preparare campioni per SEM, una procedura standard riportato in precedenza ¹⁵ viene impiegato con lievi modifiche.

1. Prima sezionare il tessuto dal cervello, preparare il fissativo in una fiala di vetro da 5 ml con tappo in polietilene. Il fissativo contiene il 2% paraformaldeide, glutaraldeide al 2,5% (metà soluzione Karnovsky ¹⁶⁾ in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4.
2. Sezionare il tessuto dal cervello come descritto al punto 1.
3. Brevemente sciacquare il tessuto isolato con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) in un nuovo piatto e quindi fissare il tessuto nella fissante nella fiala di vetro per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzare pipette monouso e trattare i campioni gente. Dopo lavaggio in HBSS, il tessuto diventa appiccicoso.
   1. Per trasferire i campioni nella soluzione fissativo, lentamente espellere una piccola quantità di soluzione contenente il tessuto dalla pipetta di trasferimento come una gocciolina e aggiungere al fissativo.
4. Dopo la fissazione, scartare il fissativo e lavare il tessuto con tampone fosfato tre volte.
5. Immergere il tessuto in una soluzione di saccarosio al 10% per lavare i restanti aldeidi. Per assicurare l'eliminazione completa aldeidi, immergere i campioni nella soluzione per 10 minuti e quindi ripetere due volte con fresca 10% di saccarosio. Questo passaggio è importante per una buona post-fissazione in fasi successive.
6. Immergere il tessuto in una soluzione di 1% tetrossido di osmio in tampone fosfato per 30 min e poi posto su ghiaccio per post-fissazione. Giudicare il grado di osmification dal colore del campione: quando aldeidi vengono completamente rimossi, il campione è nero.
7. Lavare i campioni di tessuto post- fisso a lungo con doppio distilled acqua più volte.
8. Disidratare i campioni di immersione in concentrazioni graduati di etanolo, generalmente 65%, 75%, 85%, 95%, 99% e 100%, per 10 minuti ciascuno. Ottenere etanolo anidro inserendo setacci molecolari in 99,5% di etanolo da una bottiglia appena acquistato. Ripetere disidratazione con etanolo anidro tre volte.
9. Porre i campioni disidratati in acetato di isoamile, un reagente di sostituzione per punto essiccazione critico, per 10 min. Ripetere questa operazione due volte. Questo reagente evapora rapidamente e il campione può diventare secca, con conseguente distruzione dalla tensione superficiale. Pertanto, non asciugare completamente il campione.
10. Dopo l'ultimo scambio di acetato isoamile, rimuovere la maggior parte del solvente, immediatamente avvolgere la fiala di vetro aperto con un foglio di alluminio, e posizionare il flacone in ghiaccio secco. Utilizzando un ago o una pinza sottile, fare diversi fori nella pellicola che copre la bocca del flacone, in modo che l'anidride carbonica liquida scorre facilmente nel flaconcino nel punto dryer critica. Passare alla fase successivail più rapidamente possibile.
11. In questa fase, ridurre al minimo il riporto di acetato isoamile nella camera del phon, ma non lasciare che il campione asciughi completamente prima del punto di essiccazione critico. Inoltre, non lasciare il campione sul ghiaccio secco per un tempo inutilmente lungo per evitare la formazione di brina sulla fiala.
12. Trasferire le fiale di vetro imballati in pellicola contenenti i campioni di tessuto nel punto dryer critico che assicura la struttura superficiale del tessuto rimane intatto mentre l'acqua contenuta nella rimozione del tessuto. Informazioni dettagliate sul funzionamento del punto asciugatrice critica può essere ottenuto dalle istruzioni del produttore.
13. Maneggiare con cura i campioni con uno stuzzicadenti per ridurre al minimo i danni meccanici. I campioni di tessuto derivanti secche sono fragili. Montare i campioni sul stub metallo e cappotto d'oro-palladio utilizzando una polverizzazione ionica.

5. Osservazione al SEM

1. Osservare da SEM e registrare immagini con una fotocamera digitaleattrezzato per microscopio elettronico a scansione.
2. Trasferire i dati delle immagini digitali ad un PC per l'analisi.

Risultati

Una panoramica del flusso di lavoro è mostrata in Figura 1, comprese le immagini dei dispositivi.

Osservazioni dal vivo di movimento di CPECs

Film 1 mostra un film di CPECs isolati da un topo perinatale e film 2 mostra una vista espansa delle immagini in film 1. Va notato che i singoli suggerimenti ciliari sono meno chiari in immagini fisse rispetto a quelli in film. La Figura 2 ...

Discussione

Prospettive di questo metodo

Sebbene la tecnica qui descritta non fornisce un'analisi più dettagliata delle ciglia rispetto ai metodi precedentemente pubblicati, il significato di questa tecnica risiede nella semplicità del sistema ed economicità, che può essere facilmente applicato a qualsiasi tipo di screening di motilità ciliare ex vivo. In particolare, TI Workbench fornisce un'interfaccia semplice e user-friendly che consente ai ricercatori di osservare e analizzare la m...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti richiesti
per imaging di cellule vive
etanolo	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
per preparazione SEM
etanolo	Wako Chemicals	057-00456
salina bilanciata di Hank	Life Technologies	14170112
paraformaldeide	Merck	1040051000
glutaraldeide	Nacalai tesque	17003-05
acetato di isoamile	Nacalai tesque	02710-95
setacci molecolari 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	per la preparazione di soluzione salina tampone fosfato etanolo anidro
(PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
tampone fosfato, 0,1 M			Per fare 100 ml, mescolare 19,0 ml di 0,1  M NaH2PO4 e 81,0 ml di 0,1  M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
fosfato disodico (anidro)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
tetrossido di osmio	Nisshin EM	300
ghiaccio
[header]
Strumenti e materiali per la dissezione
per l'imaging dal vivo e la preparazione del SEM
stereomicroscopio	Tovagliolo
Piatto
Bicchiere
Forbici operative diritte	Sansyo	S-2B
Pinza per orologiaio	Dumont	No.DU-3 o -4, INOX
per imaging di cellule vive
piatto con fondo in vetro	Matsunami Glass	D110300
per preparazione SEM
alminum fiala
vetro da 5 ml con tappo in polietilene	Pipetta di trasferimento Nichiden Rika-Glass	PS-5A
	Samco Scientific	SM251-1S	per trasferimento di campioni
stuzzicadenti			per trasferimento di campioni
sputtering ionico con oro-palladio	Hitachi	Essiccatore per punti critici E-1030
	Hitachi	HCP-2
[header]
Attrezzature e materiali microscopici
per imaging di cellule vive
reverse microscopio	Olympus	IX81
100 W alloggiamento e alimentatore per grumi di mercurio	Olympus	U-ULH e BH2-RFL-T3
100 W	Ushio	USH103D
condensatore DIC, n.a. 0,55	Olympus	IX-LWUCD
otturatore elettrico	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 e VMM-D1	manuale possono essere utilizzati.
filtro passa-banda (400-700  nm, Φ 45  mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
Filtro ND (Φ 45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combinazione di filtri ND 25% e 6% sono utilizzati
obiettivo lente (immersione in acqua) con elemento DIC	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 con videocamera ad alta velocità IX-DPAO40
	Allied Vision Technologies	GE680	≥ 200 Hz di frame rate e 1 msec di tempo di esposizione
software di acquisizione/analisi delle immagini	software TI	Workbench,	in grado di acquisire a frame rate elevati.
PC per il controllo / analisi della telecamera	Tavolo	Mac Pro
	Meiritsu Seiki	AD0806
peso per tessuti	Warner Instruments	kit di ancoraggio a fette	Può essere realizzato con rete di nylon incollata a forma di U schiacciata e Phi; 0,5  mm filo di platino.
vetro di copertura (peso alternativo per il tessuto)	Matsunami	su ordinazione	Un vetro di copertura può essere utilizzato come peso del tessuto.
for SEM
reverse microscopio	a scansione Olympus	IX81
	JEOL	JSM-6510

Soluzione secco di carta piatto Olympus SZX7Φdi plastica da 10 cmda 100 ml di lampada al mercurio otturatore , , di isolamento dalle vibrazioni Apple elettronico