Indagine di Synaptic Tagging / Cattura e Cross-cattura utilizzando acuta fettine di ippocampo da Roditore

La codifica e l'archiviazione delle informazioni nel cervello rimane ancora la sfida più significativa e fortemente perseguita nelle neuroscienze. Nel corso degli anni, il potenziamento a lungo termine (LTP) e la depressione a lungo termine (LTD) sono emersi come i principali correlati cellulari della memoria^1,2. Questi cambiamenti dipendenti dall'attività, che mostrano specificità di input e associatività, provocano la stabilizzazione delle tracce di memoria nelle reti neuronali ^1,3,4. Il mantenimento delle due forme di plasticità sinaptica richiede la sintesi di prodotti correlati alla plasticità (PRP)^5-10. La specificità delle sinapsi, che coinvolge l'interazione di proteine di nuova sintesi solo con specifiche sinapsi attivate che esprimono LTP o LTD, è fondamentale per la memoria. Questa specificità è spiegata dal concetto di 'Synaptic Tagging and Capture' (STC), in cui i PRP interagiscono con sinapsi 'marcate' recentemente attive^11,12. Il processo STC offre un quadro per le proprietà associative delle memorie a livello cellulare. Ci fornisce una base concettuale di come le forme di plasticità a breve termine si trasformino in forme di plasticità a lungo termine in modo associativo e dipendente dal tempo¹³.

Durante il processo di STC, una forte tetanizzazione in un input che porta alla sintesi proteica dipendente da LTP tardiva, provoca il rinforzo di un LTP precoce indipendente dalla sintesi proteica indotto in un altro input indipendente sulla stessa popolazione di neuroni in uno persistente¹³. L'impostazione di un tag sinaptico locale da parte di un'attività neurale transitoria e la sintesi dei PRP diffusibili da parte della forte attività neurale sono i due eventi chiave durante STC^13,14. La cattura dei PRP da parte delle sinapsi "marcate" recentemente potenziate è fondamentale per il mantenimento del potenziamento a lungo termine. Sono stati condotti molti studi per confermare l'esistenza del fenomeno STC^15-17 e identificare i candidati "tag"¹⁸ e "^PRPs"19. proteina chinasi II calcio/calmodulina-dipendente (CaMKII) e chinasi 1/2 regolata dal segnale extracellulare (ERK1/2); CaMKIV, proteina chinasi M (PKM) e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) sono alcune delle molecole candidate per 'tag' e 'PRP' rispettivamente^19-21. Il modello di marcatura sinaptica è stato ulteriormente ampliato per includere le interazioni associative positive tra LTP e LTD - il "cross-tagging sinaptico"²². Nel cross-tagging sinaptico, un LTP/LTD tardivo in un input sinaptico trasforma l'LTD/LTP precoce indipendente dalla sintesi proteica opposta in un input indipendente nella sua forma di lunga durata o viceversa²².

La preparazione della fetta ippocampale è il modello più utilizzato negli studi sulla plasticità sinaptica a lungo termine^23,24. Gran parte della comprensione dei concetti di marcatura sinaptica e cross-tagging deriva dagli studi condotti nella regione CA1 dell'ippocampo e, a causa della complessità tecnica, molti dei laboratori non sono ancora in grado di studiare questi processi. Le condizioni sperimentali per la preparazione di fette di ippocampo di ratto e la registrazione di tardivi/LTD stabili per ore prolungate sono estremamente importanti per studiare il tagging/cross-tagging sinaptico^23,25,26. Questo articolo descrive le procedure sperimentali dettagliate per lo studio dei processi di plasticità a lungo termine come STC e cross-tagging nei neuroni piramidali CA1 utilizzando registrazioni stabili e a lungo termine del potenziale di campo da fette acute di ippocampo di ratti.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC) dell'Università Nazionale di Singapore.

1. Preparazione di artificiale liquido cerebrospinale (ACSF)

1. Preparare la ACSF costituito da (in mM) 124 NaCl, KCl 3,7, 1,0 _MgSO4 7H ₂ O, 2,5 CaCl ₂ .2H ₂ O, 1,2 KH ₂ PO _4, 24,6 _NaHCO3 e 10 D-glucosio. Assicurarsi che il pH della ACSF è compreso tra 7,2-7,4 quando gorgogliare alla saturazione con 95% O ₂ e 5% CO ₂ miscela (carbogeno). ²¹ Usare questo ACSF sia per la dissezione, la preparazione fetta e per perfusione durante le registrazioni elettrofisiologiche.
   NOTA: Utilizzare un apparecchio pulito per la misurazione e tenendo premuto il ACSF. Usando apparecchi impuro può portare a soluzioni torbide o formazione di precipitati. Usare acqua deionizzata per tutte le preparazioni.
2. Preparare un 2 L 10x ACSF magazzino escluso _NaHCO 3 MgSO4 7H ₂ 0 (4.92g), CaCl ₂ .2H ₂ 0 (7,56 g), KH ₂ PO ₄ (3.28 g) e superiore fino al volume di 2 L. mescolare continuamente per almeno 30 minuti con un agitatore magnetico per garantire che tutti i reagenti sono dissolti. Conservare il magazzino in 4 ^{° C} e utilizzare entro 2 settimane.
3. Prima della dissezione e gli esperimenti, diluire il ACSF magazzino in un pallone tarato con l'aggiunta di quantità necessaria di _NaHCO3 e D-glucosio. Per 1 soluzione L, diluire 100 ml di brodo di 1 L dopo l'aggiunta di 2,07 g _NaHCO3 e 1.802 g di D-glucosio. Il ACSF dovrebbe essere una soluzione trasparente, priva di qualsiasi precipitato o di particelle non disciolte.
4. Raffreddare circa 200-300 ml di ACSF sul ghiaccio, da utilizzare durante la dissezione. Assicurarsi che il ACSF utilizzata per la dissezione è compresa tra 2-4 ° C. Utilizzare il ACSF rimanente per electropEsperimenti hysiological. Bubble tutte le soluzioni aCSF alla saturazione con CarboGen (5% di CO _2, il 95% _O 2) continuamente. In attesa del ACSF si raffreddi, preparare l'area dissezione e la camera di fetta.

2. Preparazione della Camera di interfaccia

NOTA: Una camera fetta cervello interfaccia, utilizzato per l'incubazione le fette e mantenerle durante registrazioni elettrofisiologiche (Figura 2B), si compone di due compartimenti. La camera inferiore contiene acqua mantenuta a 32 ° C distillato da una termocoppia e continuamente gorgogliare con CarboGen.

1. Accendere il regolatore di temperatura e preimpostarla a 32 ° C. Lavare la camera alta per 10 a 15 minuti con acqua corrente distillata attraverso il tubo di afflusso. Assicurarsi che la camera superiore è pulito prima di mettere in rete. Controllare che il livello dell'acqua nella camera inferiore è circa il 70% riempita con acqua distillata.
2. Posiziona ilnet nella camera superiore per fornire un piano di appoggio per le porzioni (Figura 2C). Regolare il tubo di efflusso per assicurare che il livello della soluzione è sufficientemente bagnare l'intera area della rete. Posizionare il coperchio sopra la rete per mantenere un'atmosfera umidificata carbogeno nella camera superiore.
3. Regolare il flusso di 1 ml / min. Mantenere questa portata per tutto il periodo di incubazione fetta e l'esperimento. Avviare carbogenating il ACSF 1x appena preparato e immergere il tubo di afflusso nel ACSF. Lasciare 20 min per il ACSF saturo con CarboGen e per la camera superiore per essere riempito con esso.

3. Preparazione di acuta fettine di ippocampo

NOTA: Il protocollo dissezione è composto da (1) rimozione del cervello dall'animale in ACSF e fredda (2) Isolamento e tranciatura dell'ippocampo. Affinché i neuroni di rimanere vitali, isolano e mettono il cervello in ACSF freddo rapidamente e completare l'interoprocesso affettare in 3-5 minuti compresi.

1. La rimozione del cervello in ACSF freddo
   1. Disporre gli strumenti di dissezione nel modo illustrato nella Figura 1A. Disporre gli strumenti secondo l'ordine di utilizzo per facilitare il processo di dissezione. Prima di iniziare, assicurarsi che tutti gli strumenti di dissezione sono pronti.
   2. Montare una lama di rasoio, pulito con acetato di etile, etanolo assoluto e acqua distillata, sul chopper tessuto manuale (Figura 1B), fissarlo saldamente e in modo che la punta di diamante è perfettamente allineato. Test di tagliare un pezzo di carta da filtro per assicurarsi che la lama è fissata saldamente. Impostare lo scorrimento Vernier micrometro nella posizione di partenza.
   3. Eutanasia l'animale con anidride carbonica (CO ₂₎ in una camera di induzione e decapitare con le forbici benda o ghigliottina. Utilizzo di un forbici Iris, togliere la pelle e pelliccia sopra il cranio. Fare un taglio attraverso posteriore per rimuovere il brainstem.Make una piccola incisione lungo thall'e lato destro del cranio e un'incisione più a sinistra.
      ATTENZIONE! Effettuare solo una piccola incisione sul lato che viene utilizzato per gli esperimenti per evitare di danneggiarlo. Quando si inseriscono le forbici, assicurarsi che la forza applicata è verso l'alto per evitare danni al cervello.
   4. Rimuovere delicatamente il cranio con un osso rongeur partendo dalla sinistra alla destra del cranio per rivelare la corteccia. Un sottile strato di dura può anche essere visto. Rimuovere con attenzione le piastre frontali con il rongeur. Eliminare la maggior parte dura con le piastre frontali.
      ATTENZIONE! Fate attenzione che la dura non tagliare attraverso il tessuto cerebrale.
   5. Rimuovere la dura eventuale residuo, in particolare nella giunzione tra la corteccia e il cervelletto con la parte piatta di una spatola. Per la procedura 3.1.5 e 3.1.6, mantenere la pressione verso l'alto cioè lontano dal cervello per evitare di danneggiarlo. Utilizzando la spatola, scoop delicatamente il cervello in una capsula di Petri piena di freddo e ACSF carbogenated (2-4 ° C), placed su un blocco di raffreddamento in alluminio.
2. Isolamento dell'ippocampo
   1. Usando un bisturi, effettuare un taglio dritto per rimuovere il cervelletto e un altro taglio per rimuovere la parte anteriore del cervello (circa un quarto). Fare un taglio superficiale lungo la linea mediana.
   2. Rimuovere con attenzione la corteccia con uno scaler falce, partendo dalla linea mediana per rivelare le ippocampo dorsale. Rimuovere lo strato di corteccia sopra dell'ippocampo. Usare le dita o pinze ad angolo per sostenere il cervello. Fare un piccolo taglio al commessura ippocampale. Rimuovere delicatamente l'ippocampo con la modalità falce a partire dalle ippocampo dorsale con movimenti di rotolamento.
      ATTENZIONE! Sii gentile per evitare stretching e strappare l'ippocampo.
   3. Rimuovere qualsiasi corteccia e dei tessuti connettivi intorno l'ippocampo isolato con lo scaler falce.
3. Tagliando il tessuto dell'ippocampo e trasferire le fette sulla camera di interfaccia
   1. Posizionare un pezzo di ACSF-carta da filtro imbevuta (Grade 1, 30 mm) sul palco affettare affettatrice manuale. Scoop e posizionare il tessuto dell'ippocampo sulla carta da filtro. Spostare la carta da filtro per allineare l'ippocampo a debita orientamento rispetto alla lama dell'affettatrice modo che l'ippocampo è tagliato ad un angolo di circa 70 ^o al fimbria.
   2. Asciugare la soluzione in eccesso che circonda il tessuto dell'ippocampo con un filtro di carta piegato (Grade 1, 85 mm) lasciando l'ippocampo leggermente umida. Affettare l'ippocampo trasversalmente Avvia. Slice e scartare tessuto dalla fine estremo dell'ippocampo dove la morfologia fetta non è chiaro.
   3. Tagliate il tessuto rimanente in 400 fette micron di spessore. Pick up fettine di ippocampo delicatamente dalla lama con una spazzola con setole morbide con movimenti delicati e strisciando disporre le fette in un piccolo bicchiere pieno di freddo ACSF carbogenated. Eseguire le fasi 3.3.1-3.3.3 più rapidamente possibile poiché il tessuto dell'ippocampo è esposto all'aria.
      NOTA: In genere i due terzi dell'ippocampo è affettato, e 4-6 fette con chiaro morfologia possono essere preparati.
   4. Trasferire le fette delicatamente sulla rete nella camera fetta con un pulito di plastica pipetta Pasteur con una punta larga (fatta tagliando via 2-3 cm della punta). Regolare accuratamente la posizione delle fette sulla rete utilizzando una piccola siringa con un estremità ricurva. Posizionare le fette in modo tale da facilitare posizione degli elettrodi e la registrazione. Verificare che le fette sono sufficientemente circondati da ACSF ma non sono immerse o galleggiante (Figura 2C-D). Coprire la camera e incubare le fette per 2-3 ore.
      NOTA: lo strato di cellule piramidali nelle fette sani dovrebbe mostrare una certa trasparenza.

4. Registrazione di CA3-CA1 Synaptic Risposte

NOTA: Il elettrofisiologia set-up utilizzato per la registrazione potenziale campo viene mostrato nella Figura 2A. A Faragabbia giorno è fortemente consigliato se l'interferenza elettrica è al di là del controllo dopo la corretta messa a terra delle impostazioni elettrici. Molti diversi tipi di camere sommerse e di interfaccia sono disponibili in commercio. Tuttavia, le camere di interfaccia sono preferiti come fette mostrano risposte sinaptiche più robuste in loro.

1. Posizionamento degli elettrodi
   1. Accendere l'apparecchio elettrico (stimolatori e amplificatori) da utilizzare. Montare e fissare gli elettrodi stimolanti e registrazione nella titolari plexiglass dei micromanipolatori.
      NOTA: Usiamo monopolare,, elettrodi in acciaio inox laccato rivestito di resistenza 5 MW sia per scopi di stimolanti e di registrazione.
   2. Prima dell'uso, inserire questi elettrodi all'interno dei capillari di vetro tirato e fissarlo con colla epossidica esporre solo piccola parte della punta dell'elettrodo (Figura 2E). Questo dà forza agli elettrodi altrimenti sottili e aiuta a garantire saldamente nel eletitolari ctrode.
   3. Guidata al microscopio, posizionare l'elettrodo stimolante (s) in strato radiatum della regione CA1 di stimolare le fibre collaterali Schaffer e l'elettrodo di registrazione nella regione dendritico apicale CA1 per registrare (fEPSP) risposte di campo-EPSP.
      NOTA: Avvicinandosi la superficie del liquido sopra la fetta con gli elettrodi dà un suono che consente di individuare rapidamente la superficie della fetta (fornito, l'amplificatore è collegato ad un altoparlante).
   4. In esperimenti di tagging e catturare sinaptiche, secondo la necessità dell'esperimento, posizione due o tre elettrodi stimolatori (S1, S2 o S3) su entrambi i lati dell'elettrodo di registrazione per stimolare due o più indipendenti ma sovrapposti ingressi. Posizionare le stimolanti e registrazione elettrodi circa 200 micron a parte.
   5. Se necessario, individuare un altro elettrodo di registrazione nello strato corneo pyramidale per la registrazione spike popolazione (Figura 3A) .Quando sia laelettrodi hanno toccato la fetta, utilizzando il software di acquisizione, dare una stimolazione di prova per garantire un adeguato segnale di fEPSP.
      NOTA: Usiamo bifasico, impulsi di corrente costante (durata impulso 0,1 msec / semi-onda) per la stimolazione di prova.
   6. Una volta ottenuto un vero e proprio segnale di fEPSP, abbassare con attenzione gli elettrodi circa 200 micron profondo utilizzando micrometrica movimento dei manipolatori. Lasciare 20 minuti per le fette di recuperare. Testare l'indipendenza percorso con un protocollo di facilitazione paired-pulse ^27,28.
2. Relazione ingresso-uscita
   1. Determinare la relazione ingresso-uscita (stimolazione afferente vs fEPSP slope) per ciascun ingresso misurando il valore di pendenza in una gamma di intensità di corrente. Eseguire questo tra 20 μA a 100 mA. Quindi impostare l'intensità di stimolazione per ciascun ingresso per ottenere il 40% della massima pendenza fEPSP. Conservare il costante durante l'esperimento.
   2. Dopo 15-20 minuti, iniziare a registrare la linea di base. Monitorare il fEPSP versante strettamente in questo periodo e ripristinare la intensità dello stimolo se la pendenza oscilla oltre il 10% rispetto al valore impostato e avviare una nuova linea di base. Record almeno 30 minuti o 1 ora linea di base stabile prima di procedere.
      NOTA: Per la prova o la stimolazione basale, usiamo quattro spazza di 0,2 Hz bifasico, costanti impulsi di corrente (0,1 msec per polarità) dati ogni 5 minuti. Una pendenza media di questi quattro risposte viene quindi considerata come una ripetizione. I segnali sono filtrati e amplificati da un amplificatore differenziale, digitalizzato mediante un convertitore analogico-digitale e monitorati online con software su misura.
3. Induzione di LTP / LTD utilizzando protocolli di stimolazione
   NOTA: Sia la LTP e LTD sono stati classificati come inizio e fine-LTP / LTD in base ai requisiti della sintesi proteica; quest'ultimo di traduzione che richiede e / o di trascrizione per la sua manutenzione in ritardo [per la revisione vedere ^4]. Una varietà di paradigmi di stimolazione elettrica può specifically indurre le diverse forme di LTP e LTD.
   1. WTET: 100 Hz, 21 bifasico impulsi di corrente costante (0,2 msec per fase).
   2. STET: Tre sequenze di 100 impulsi per un secondo (100 Hz) ogni 10 min (Pulse Width 0,2 msec per fase).
   3. 900 burst oltre una durata di 15 min. 1 scoppio si compone di 3 impulsi (0,2 larghezza msec) con un intervallo dell'impulso di 50 msec (20 Hz). L'intervallo tra l'esplosione è di 1 sec (numero totale di impulsi 2.700).

5. Pulizia di Slice Camera e sistema di perfusione

1. Dopo la registrazione è finita, raccogliere i fettine di ippocampo per ulteriori analisi biochimiche oppure eliminare in modo appropriato. Chiudere il rubinetto CarboGen e regolatore di temperatura. Lavare il gorgogliatore CarboGen in acqua distillata.
2. Pulire accuratamente la rete con una spazzola e acqua distillata. Lavare l'impianto per 15-20 minuti con acqua distillata a una portata maggiore. Una volta in 3-4 giorni, cambiare l'acqua distillata nelvano inferiore della camera e anche pulito la camera regolarmente con il 3% di perossido di idrogeno soluzione per evitare la crescita fungina.

La metodologia descritta è stata utilizzata per studiare forme di lunga durata di LTP / LTD e le sue interazioni associativi, come il tagging sinaptica e cross-cattura da fettine di ippocampo acuti di ratti adulti. 23 Questa tecnica si è dimostrata efficace per esperimenti con entrambi i ratti (Wistar) e una varietà di topo ceppi 30,31. La metodologia è stata utilizzata con successo per le registrazioni stabili LTP fino a 8-12 ore. 32

Il 'tag' fissato dalla tetanizzazione debole un ingresso (S1) cattura l'indotto dalla forte tetanizzazione di un altro ingresso indipendente, ma si sovrappongono 'PRP "(S2, figura 3B, cerchi pieni) trasformando così la forma altrimenti in decomposizione di LTP (precoce -LTP) in S1 in una lunga durata di un (figura 3B, cerchi aperti) (Per il confronto di early-LTP indotta da WTET vedi 20,33). I PRP catturati dai debolitag set tetanizzazione non deve necessariamente venire dalla STET-indotta tardo-LTP, ma può anche essere fornita dal RIFOS indotta tardo-LTD. Questo tipo di interazione associativa positiva tra LTP e LTD è indicato come 'cross-codifica / capture'. Il WTET indotta precoce LTP in S1 viene rinforzato al tardo-LTP (Figura 3C, cerchi aperti) per catturare le PRP forniti dalla RIFOS indotta tardo-LTD in S2 (Figura 3C, cerchi pieni). Statisticamente significativo potenziamento o depressione è stato mantenuto in S1 e S2 in entrambi i casi rispetto al proprio basale (test di Wilcoxon, p <0,05).

Per l'interazione tag-PRP si verifichi, l'ordine temporale dei due eventi (debole-prima-strong / strong-prima-debole) non è cruciale finché la finestra di tempo tra i due eventi rimane entro la gamma di 30-60 minuti. Sarebbe saggio per includere una terza, indipendente, ma si sovrappongono sinaptica inmettere e usarlo come controllo basale per monitorare la stabilità di registrazioni. I protocolli di stimolazione elettrica utilizzati per indurre forme inizio e fine di LTP / LTD devono essere convalidati in esperimenti a singolo ingresso per la coerenza e l'affidabilità prima di utilizzarli in esperimenti STC. Vorremmo anche sottolineare l'importanza della metodologia di preparazione fetta descritta nel protocollo dopo il successo di questi esperimenti si basa molto sulla qualità delle fette.

Figura 1. (A) Strumenti utilizzati per la dissezione dell'ippocampo: (a) Bandage Scissors (b) Iris forbici (c) Bone rongeur (d) spatola sottile, (e) il numero Scalpel 11 (f), scaler Sickle (g) Morbido pennello -bristle (h) di plastica pipetta Pasteur (i) carta da filtro (85 millimetri) (j), carta da filtro (30mm) (k), bicchieri di vetro (l) i blocchi di raffreddamento in alluminio per adattarsi capsula di Petri e bicchieripiatto (m) Petri. (B) chopper tessuto manuale. (a) Platform (b) Braccio con lama-porta (c) Vernier micrometro, risoluzione a 10 micron di taglio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. elettrofisiologia set-up per le registrazioni sul campo potenziale costituito da: (A) stimolatori (b) un amplificatore differenziale (c) un convertitore analogico-digitale (d) Oscilloscopio (e) computer con software di acquisizione (f) vibrazioni resistente da tavolo (g) Microscopio con> ingrandimento 4x (h) Interfaccia camera cervello-slice (i) un sistema di perfusione per ACSF e CarboGen fornitura (j) regolatore di temperatura (k) una fonte di illuminazione (l) manipolatori con i titolari degli elettrodi. (B) Interfaccia cervello-slicecamera. (C) e (D) fettine di ippocampo nella camera di interfaccia. elettrodo in acciaio (E) in acciaio sigillato in un capillare di vetro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. (A) Rappresentazione schematica di una fetta ed elettrodo posizione trasversale hippocampal per la registrazione campo potenziale: In questa rappresentazione, due elettrodi stimolanti (S1 e S2) sono posizionati nella radiatum strato della regione CA1 di stimolare due indipendenti ma sovrapposizione ingressi sinaptici sui neuroni CA1 piramidali. Due elettrodi di registrazione extracellulari, uno per registrare campo EPSP (potenziale eccitatorio post-sinaptico) dal vano dendritiche apicale e un altro per registrare somatica popolazione picco dalla cellula piramidalei corpi, si trovano nella radiatum strato e strato pyramidale rispettivamente. CA1- cornu Ammonis regione 1, CA3- cornu Ammonis regione 3, dentate DG- giro, fibre collaterali Silvia Cattori Schaffer, S1- stimolante elettrodi 1, elettrodo S2-stimolante 2. (B) debole prima forte paradigma per lo studio STC: tetanization debole (WTET) viene applicata a S1 (cerchi aperti) per indurre precoce LTP seguito da una forte tetanizzazione (STET) di S2 (cerchi pieni) a 30 min per indurre tardo-LTP. I primi-LTP in S1 viene rinforzato a tarda LTP mostrando tagging e catturare l'interazione (n = 6) (C) debole prima forte paradigma per lo studio cross-codifica:. Early-LTP è indotta da WTET in S1 (cerchi aperti) seguito per l'induzione di tardo-LTD a S2 (cerchi pieni) con RIFOS dopo 30 minuti. Nella S1, il precoce LTP è trasformato in tarda LTP durata 6 ore mostrando cross-tagging e cattura (n = 6). Freccia singola rappresenta tetanizzazione debole domanda per indurre precoce LTP. Tripletta di frecce rappresentaforte tetanizzazione per indurre tardo-LTP. La freccia tratteggiata rappresenta il punto di tempo in cui è stato RIFOS applicata all'ingresso sinaptica rappresentante per indurre ritardo-LTD. Le barre di errore indicano SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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