Molecular Probe Optimization per determinare mortalità delle cellule in un organismo fotosintetico (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) In citometria a flusso

Sommario

Popolazioni microbiche contengono eterogeneità delle cellule sostanziale, che può dettare il comportamento generale. Analisi della sonda molecolare attraverso citometria a flusso in grado di determinare stati fisiologici di cellule, ma la sua applicazione varia tra le specie. Questo studio fornisce un protocollo per determinare con precisione la mortalità delle cellule all'interno di una popolazione cianobatterio, senza sottovalutare o la registrazione di risultati falsi positivi.

Abstract

Sottopopolazioni microbiche in studi sul campo e di laboratorio hanno dimostrato di visualizzare elevata eterogeneità nei parametri morfologici e fisiologici. Determinare il reale stato tempo da una cella microbica va oltre le categorie, vivi o morti, come possono esistere microbi in uno stato inattivo, per cui la divisione cellulare e attività metaboliche sono ridotti. Data la necessità di individuazione e la quantificazione dei microbi, citometria a flusso (FCM) con sonde molecolari fornisce un metodo rapido e accurato per determinare la redditività complessiva della popolazione. Utilizzando Sytox verde e Sytox arancione nel modello cianobatteri Microcystis aeruginosa per rilevare l'integrità della membrana, sviluppiamo un metodo trasferibile per una rapida indicazione di mortalità singola cellula. Le sonde molecolari utilizzati all'interno di questa rivista si farà riferimento alle sonde di acidi nucleici come verde o arancione rispettivamente (anche se ci sono altri prodotti con simili eccitazione e di emissione che hanno una modalità comparabili di action, abbiamo espressamente riferimento alla ribalta menzionato sonde). Protocolli che utilizzano sonde molecolari variano tra le specie, che differiscono principalmente in tempi di concentrazione e di incubazione. Seguendo questo protocollo intraprendere M.aeruginosa sonda verde acido nucleico è stato ottimizzato a concentrazioni di 0,5 mM dopo 30 min di incubazione e la sonda di acido nucleico a 1 pM arancione dopo 10 min. In entrambe le concentrazioni sonde in meno rispetto alla ottimale indicata portato ad un sotto segnalazione di cellule con danni membrana. Al contrario, 5 mM concentrazioni e superiore in entrambe le sonde hanno mostrato un tipo di colorazione aspecifica, per cui le cellule 'dal vivo' hanno prodotto una fluorescenza bersaglio, portando ad una rappresentazione su di numero di cellule 'non vitali. I controlli positivi (calore ucciso), a condizione biomassa morto verificabile, anche se l'opportunità di generazione di controllo rimane oggetto di dibattito. Dimostrando una sequenza logica di passi per ottimizzare le sonde di acido nucleico verde e arancione noi demonstrate come creare un protocollo che può essere utilizzato per analizzare efficacemente stato fisiologico cianobatteri.

Introduzione

La cella è un sistema complesso, che risponde costantemente all'ambiente modificando parametri fisiologici e alterarne la funzione. Dinamica delle popolazioni di popolazioni microbiche isogeni sia in natura e di laboratorio sono danneggiati dallo sviluppo di sottopopolazioni, che si verificano anche in condizioni ambientali relativamente costanti ^{1 - 3.} La variabilità delle comunità microbiche naturali nasce a causa della natura altamente variabile delle condizioni ambientali. Questi processi talvolta stocastici successivamente producono sottopopolazioni che sono molto diversa da quella media della popolazione. Recenti evidenze ha....

Protocollo

1. Preparazione della sonda molecolare e citofluorimetro

1. Diluire le soluzioni madre delle sonde di acido nucleico, che vengono forniti come soluzione 5 mM in dimetilsolfossido (DMSO) per aliquote di concentrazioni richieste in ultrapura filtrato H ₂ O.
2. Conservare le sonde di acido nucleico in condizioni di oscurità tra -5 ^{° C e} - ²⁵ ° C fino al momento dell'uso.
3. Accendere il citofluorimetro e pacchetto software di carico (vedi tabella dei materiali / Attrezzature per le specifiche FCM).
4. Inserire un tubo vuoto emolisi (12 x 75 mm) sulla sonda di iniezione del campione (SIP), fare clic su sbl....

Risultati

Forward scatter luce (FSC) e uscite luce laterale scatter (SSC) da una cultura lotto M.aeruginosa in fase esponenziale fornisce informazioni sulla dimensione della cella (diametro) e granularità interno rispettivamente (Figura 1A). FSC può discriminare le cellule che sono troppo grandi e / o piccolo per essere M.aeruginosa. Questa discriminazione o di gating può essere fatto da dati di raffinazione tra alcuni punti di una uscita FSC (Figura 1C)........

Discussione

Le aumento del numero di pubblicazioni utilizzando sonde molecolari indica che i dati affidabili e informativi possono essere ottenuti ^{5,6,8 - 15,19,22,23.} Come ancora non c'è nessuna macchia perfetta per la vitalità cellulare che può essere efficace in tutte le specie con la stessa concentrazione e l'incubazione tempo ^6,10. Anche lo stesso tipo di sonda con emissioni di fluorescenza alterati mostra la necessità di stabilire la concentrazione e l'incubazione ora co.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Soluzione concentrata di acqua dolce (diluizione x50)
Fluido di decontaminazione	BD Biosciences	653155	Eseguire per 2 minuti quando i risultati sono superiori a 12 eventi al secondo in modalità veloce o una velocità di flusso di 66 &; l/min.  Seguito da 2 min di guaina H2O.
Citometro a flusso	BD Biosciences	su richiesta	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Colorazione dell'acido nucleico - 5 mM di soluzione in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Colorazione di acido nucleico - 5 mM di soluzione in DMSO