Articolo metodologico

Molecular Probe Optimization per determinare mortalità delle cellule in un organismo fotosintetico ( Microcystis aeruginosa) In citometria a flusso

DOI:

10.3791/53036

⸱

29 gennaio 2016

 ,  , 
1Department of Life and Environmental Sciences, Faculty of Science and Technology, Bournemouth University

In questo articolo

Sommario

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Popolazioni microbiche contengono eterogeneità delle cellule sostanziale, che può dettare il comportamento generale. Analisi della sonda molecolare attraverso citometria a flusso in grado di determinare stati fisiologici di cellule, ma la sua applicazione varia tra le specie. Questo studio fornisce un protocollo per determinare con precisione la mortalità delle cellule all'interno di una popolazione cianobatterio, senza sottovalutare o la registrazione di risultati falsi positivi.

Abstract

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Sottopopolazioni microbiche in studi sul campo e di laboratorio hanno dimostrato di visualizzare elevata eterogeneità nei parametri morfologici e fisiologici. Determinare il reale stato tempo da una cella microbica va oltre le categorie, vivi o morti, come possono esistere microbi in uno stato inattivo, per cui la divisione cellulare e attività metaboliche sono ridotti. Data la necessità di individuazione e la quantificazione dei microbi, citometria a flusso (FCM) con sonde molecolari fornisce un metodo rapido e accurato per determinare la redditività complessiva della popolazione. Utilizzando Sytox verde e Sytox arancione nel modello cianobatteri Microcystis aeruginosa per rilevare l'integrità della membrana, sviluppiamo un metodo trasferibile per una rapida indicazione di mortalità singola cellula. Le sonde molecolari utilizzati all'interno di questa rivista si farà riferimento alle sonde di acidi nucleici come verde o arancione rispettivamente (anche se ci sono altri prodotti con simili eccitazione e di emissione che hanno una modalità comparabili di action, abbiamo espressamente riferimento alla ribalta menzionato sonde). Protocolli che utilizzano sonde molecolari variano tra le specie, che differiscono principalmente in tempi di concentrazione e di incubazione. Seguendo questo protocollo intraprendere M.aeruginosa sonda verde acido nucleico è stato ottimizzato a concentrazioni di 0,5 mM dopo 30 min di incubazione e la sonda di acido nucleico a 1 pM arancione dopo 10 min. In entrambe le concentrazioni sonde in meno rispetto alla ottimale indicata portato ad un sotto segnalazione di cellule con danni membrana. Al contrario, 5 mM concentrazioni e superiore in entrambe le sonde hanno mostrato un tipo di colorazione aspecifica, per cui le cellule 'dal vivo' hanno prodotto una fluorescenza bersaglio, portando ad una rappresentazione su di numero di cellule 'non vitali. I controlli positivi (calore ucciso), a condizione biomassa morto verificabile, anche se l'opportunità di generazione di controllo rimane oggetto di dibattito. Dimostrando una sequenza logica di passi per ottimizzare le sonde di acido nucleico verde e arancione noi demonstrate come creare un protocollo che può essere utilizzato per analizzare efficacemente stato fisiologico cianobatteri.

Introduzione

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La cella è un sistema complesso, che risponde costantemente all'ambiente modificando parametri fisiologici e alterarne la funzione. Dinamica delle popolazioni di popolazioni microbiche isogeni sia in natura e di laboratorio sono danneggiati dallo sviluppo di sottopopolazioni, che si verificano anche in condizioni ambientali relativamente costanti 1 - 3. La variabilità delle comunità microbiche naturali nasce a causa della natura altamente variabile delle condizioni ambientali. Questi processi talvolta stocastici successivamente producono sottopopolazioni che sono molto diversa da quella media della popolazione. Recenti evidenze hanno rivelato che queste sottopopolazioni fisiologiche reazioni diverse condizioni ambientali e possono produrre composti di segnale o inibitori che colpiscono drammaticamente e influenzano il 3,4 popolazione complessiva.

Stabilire un metodo per definire l'eterogeneità all'interno di una popolazione è la chiave per unprensione l'ecologia dei microbi in vari ambienti ed è essenziale per la costruzione di conoscenza di cianobatteri fastidio, come il Microcystis tossici, che incide pesantemente sulla sicurezza dell'acqua umana. Specie, come Anabaena visualizzare l'eterogeneità morfologica in risposta alle fluttuazioni ambientali, lo sviluppo di cellule specializzate come eterocisti e akinetes 2. Al contrario, le cellule Microcystis non visualizzano evidente eterogeneità morfologica durante una risposta allo stress. La discriminazione tra cellule vitali e non vitali è l'aspetto più importante di differenziazione fisiologica e consente una migliore comprensione della dinamica delle popolazioni microbiche. Tuttavia, il problema concettuale di vitalità batterica stessa rimane difficile e poco caratterizzati 1,5,6.

Citometria a flusso (FCM) è un metodo affidabile e veloce di analizzare singole cellule. Per aumentare la comprensione della fisio singola cellulalogia attraverso FCM, sonde molecolari sono stati utilizzati per distinguere una serie di processi metabolici e biochimici 7. Ciò ha portato ad una maggiore conoscenza delle specie a livello cellulare e la popolazione ea sua volta aiutato gestione delle risorse idriche 8,9. Tuttavia, gli organismi differiscono in termini di assorbimento di sonda molecolare e efflusso a causa dei pori e pompe in pareti e membrane cellulari, che hanno portato ad una serie di progettazione della sonda molecolare e implementazione del protocollo 6,10,11. Sonde molecolari disponibili a fini commerciali e di ricerca sono spesso forniti con un protocollo generico che può essere applicabile a un tipo di cellule molto diverso. Si deve fare molta attenzione nel trasferire protocolli sviluppati per un tipo cellulare all'altro 6, è quindi un compito essenziale per ottimizzare sonde molecolari efficacemente prima dell'uso.

Le sonde di acidi nucleici verde e arancione si legano a due acidi nucleici doppie e singole flessibili con base minimale selezionareivity e sono utilizzati per valutare l'integrità della membrana plasmatica delle cellule. La sonda verde acido nucleico ha un netto miglioramento segnale di fluorescenza marcatura delle cellule rispetto ad altre sonde molecolari, come i composti a base di ioduro di propidio-12, che può anche agire come un indicatore della vitalità cellulare. Il termine 'vitalità cellulare' qui si presuppone che la degradazione del DNA si verifica dopo la perdita di integrità della membrana plasmatica. Le sonde di acido nucleico sono coloranti cianinici asimmetrici con tre cariche positive e non possono entrare nelle cellule con membrane intatte sotto concentrazioni caratterizzati, sia eucariotiche e procariotiche 14,15 11,13 organismi. Il legame di una sonda di acido nucleico ad acidi nucleici può portare fino a un aumento di emissioni di fluorescenza da segnali endogeni> 500 in cellule che hanno la loro integrità della membrana compromessa. Sebbene sonde molecolari quali sonda verde acido nucleico può essere un buon indicatore della fisiologia singola cella, è necessario to ottimizzare ogni sonda con il previsto obiettivo di organismo, come i tempi di incubazione hanno variato dal 7 min - 30 min e concentrazione varia da 0,1 micron - 0,5 micron di esperimenti Microcystis solo 15-19.

Qui vi presentiamo un protocollo per ottimizzare le analisi di citometria di verde e relativamente nuove sonde di acidi nucleici arancione (che fino ad oggi non sono stati testati sulla specie di cianobatteri M.aeruginosa). Il seguente metodologia sviluppata può essere trasferita ad altre specie e usato come piattaforma per ottimizzare protocolli in altre sonde molecolari, aumentando così la comprensione di microbi e il loro comportamento ecologico.

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Protocollo

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1. Preparazione della sonda molecolare e citofluorimetro

  1. Diluire le soluzioni madre delle sonde di acido nucleico, che vengono forniti come soluzione 5 mM in dimetilsolfossido (DMSO) per aliquote di concentrazioni richieste in ultrapura filtrato H 2 O.
  2. Conservare le sonde di acido nucleico in condizioni di oscurità tra -5 ° C e - 25 ° C fino al momento dell'uso.
  3. Accendere il citofluorimetro e pacchetto software di carico (vedi tabella dei materiali / Attrezzature per le specifiche FCM).
  4. Inserire un tubo vuoto emolisi (12 x 75 mm) sulla sonda di iniezione del campione (SIP), fare clic su sbloccare e poi di nuovo a filo per avviare il processo di pulizia FCM.
    NOTA: alcune fasi di esempio per il SIP in grado di ospitare diversi tipi di tubi compresi i tubi microcentrifuga. La sonda del diluente e liquido guaina molecolare impiegato nell'apparecchiatura FCM è da un grado analitico "tipo 1" 0,22 micron membrana fonte filtrata.
  5. Luogoun tubo emolisi fresco con 2 ml di filtrato ultrapura H 2 O sul SIP, impostare un limite di tempo per 10 - 15 min e una velocità di digiunare fluidico (o un flusso di> 66 ml / min).
  6. Selezionare una nuova cella di dati, mettere su soglie rilevanti per fluorescenza e canali dispersione di luce per ridurre il rumore di fondo e fare clic su 'run'.
  7. Se gli eventi totali al secondo non sono al di sotto raccomandazione dei costruttori, quindi eseguire un campione 2 ml di soluzione di decontaminazione per 2 minuti sul veloce e quindi ripetere i passaggi 1.4 e 1.5.
    NOTA: Si prega di verificare le raccomandazioni del fabbricante per FCM start-up dei protocolli di pulizia, in quanto possono variare tra i modelli. Test per soglie specifiche deve anche essere in linea con il modello di FCM come alcune attrezzature permette all'utente di applicare tensioni guadagni per i tubi fotomoltiplicatori (PMT) migliorando o diminuendo il segnale elettrico registrato dai rivelatori ottici. Il modello usato in questo FCM esperimentimento ha fissato PMT tensione e utilizzato una soglia di 80.000 forward scatter di luce (FSC-H) di escludere le particelle inferiori a 2,0 micron e di rumore elettronico.

2. Preparazione delle Culture e Conti cellula iniziale

  1. Autoclave 98 ml di H 2 ultrapure filtrato O e 2 ml di media algali (concentrazione x50) in un becher da 250 ml per 20 minuti a 120 ° C.
  2. Da un monocolture iniziale di M.aeruginosa (PCC 7806) in un alto stato stazionario luogo densità 2 ml di campione in un tubo sotto il SIP. Disaggregare qualsiasi formazione di colonie nel vortex o sonicazione 20 e confermare le cellule disperse in modo uniforme attraverso la microscopia ottica.
    NOTA: L'eccessiva esposizione a onde ultrasoniche può portare alla lisi cellulare e deve essere usato con cautela. Dal momento che sonicazione può crollare vescicole di gas (come si trova in specie come M.aeruginosa) Uscite come la luce laterale scatter (SSC-H) intensità può diventare più sensitive.
  3. All'interno del software FCM, selezionare un grafico a istogramma per registrare i dati di diffusione della luce in avanti (FSC-H) e configurare le specifiche di scena facendo clic su "log" per visualizzare in una scala logaritmica sull'asse.
  4. In un'uscita separata, selezionare un altro istogramma (log asse) per registrare la fluorescenza naturale come il pigmento fotosintetico ficocianina accessorio (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), trovato in M.aeruginosa.
  5. Utilizzare una fonte di luce che può eccitare ficocianina e un rilevatore in grado di filtrare le emissioni di fluorescenza risultante.
    NOTA: pigmenti fotosintetici come la clorofilla può essere eccitato con comunemente utilizzati laser blu 488 nm, mentre phycocyanin è eccitato sopra 600 nm e verrà rilevato solo con una sorgente di luce rossa 21. Verificare con il produttore citofluorimetri per sorgenti luminose di eccitazione e gli spettri di rivelatori di emissione, qui sia un 488 nm e un laser 640 nm sono stati utilizzati insieme aun filtro ottico nm 675 ± 12,5.
  6. Per la registrazione delle selezionare le impostazioni massime risoluzioni più vicine alla dimensione nucleo dell'organismo bersaglio (10 micron) e un flusso relativamente lento (14 ml / min).
    NOTA: Per ottenere i migliori campioni di risoluzione deve essere eseguito secondo produce raccomandazione di eventi al secondo.
  7. Prima che i dati di acquisizione utilizzano una soglia per escludere diffondono la luce e / o segnali di fluorescenza che sono causati dal rumore di fondo elettronico o detriti campione di cellule.
  8. Selezionare una nuova cella di dati, creare una trama densità con parametri SSC-H FSC-H e su una scala logaritmica e scegliere Esegui.
  9. Se la densità del campione porta ad un tasso di eventi eccessivo, diluizioni possono essere adottate per aumentare l'accuratezza e la precisione.
  10. Sul terreno densità di applicare cancelli software dal istogramma precedente per escludere segnali di basso livello di dispersione, dovute al rumore di fondo o detriti (FSC <320.000). Viceversa porta maggiore di fluorescenza relativoSegnali ficocianina dalle cellule e solo comprendono questi eventi (fl4, 56.000 - 1.950.000).
  11. Utilizzare il numero di cellule registrate nelle aree gated e dividerlo per il volume totale del campione che è passato attraverso il FCM, capire come molte cellule per ml.
    NOTA: Il modello FCM usato qui ha un sistema di pompa peristaltica controllato da un microprocessore che consente volume del campione da determinare. Altre apparecchiature FCM può richiedere una sospensione di sferette calibrato o un calcolo di H 2 differenze di peso O / volume per verificare il volume totale del campione.
  12. Aggiungere il volume richiesto di cellule ai media appena preparate per avviare un ciclo di crescita batch (250.000 cellule / ml) di M.aeruginosa.
    NOTA: Specie differiranno nei tassi di crescita a seconda delle loro parametri in situ ambientali e disponibilità di nutrienti, per cui un ciclo di lotto dovrebbe essere pre-registrate per determinare le fasi del ciclo di vita.

3. Optimzazione di sonda molecolare assorbimento cellulare

  1. Vendemmia a metà della cultura M.aeruginosa preparato in fase 2 da una fase esponenziale e utilizzare come controllo 'dal vivo'.
    NOTA: I campioni diluiti da una coltura ad alta densità direttamente a una fase esponenziale possono influenzare i risultati di ottimizzazione attraverso turnover di cellule morte, rispetto a quello di colture inoculate da una fase iniziale lag / induzione.
  2. Preparare l'altra metà come controllo 'morto', utilizzando metodi quali il 70% di etanolo, i campioni di riscaldamento a 60 ° C per 1 ora, paraformaldeide o 4% di formaldeide per 30 minuti 6,11,22. Controllare variazioni del microambiente campioni (ad es., PH).
    NOTA: Il, ucciso al calore, controllo positivo 'morto' in M.aeruginosa si distingue da un campione di 'live' attraverso la sua diminuzione di segnali ficocianina. Indurre la mortalità con altri metodi non può causare la stessa uscita e verrà VARy in specie.
  3. Impostare campioni miscelati con diversi rapporti di 'live' e campioni 'morti' (ad esempio, 0%, 25%, 50%, 100%).
  4. Disaggregare la formazione di colonie con vortex o sonicazione e controllare il pH.
  5. Selezionare un laser a 488 nm a fianco di rilevatori che possono registrare la fluorescenza del verde (FL1, 530 ± 15 nm) e arancione (FL2, 585 ± 20 nm) sonde di acidi nucleici e il laser 640 nm a registrare segnali ficocianina attraverso il suo rispettivo rivelatore.
    NOTA: Quando è legato al DNA, la sonda verde acido nucleico ha un approssimativo di fluorescenza di eccitazione lunghezza d'onda di 504 nm ed emissione massimi di 523 nm, mentre la sonda arancione acido nucleico ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 547 nm ed emissione massimi di 570 nm. Un laser a stato solido a ioni argon 488 nm può essere utilizzata per eccitare entrambe le sonde molecolari, tuttavia, un laser verde (fino a 547 nm) produrrà una maggiore fluorescenza arancione.
  6. Come punto di partenza, introdurre laSonda molecolare con i produttori raccomanda concentrazione alla cultura 'morto' 50% 'live' e il 50% e incubare al buio.
  7. Selezionare una nuova cella di dati, mettere il campione sotto il SIP con soglie e trigger in grado di ridurre il rumore di fondo (FSC-H 80.000).
  8. Creare una trama densità con parametri SSC-H FSC-H e, e tre istogrammi. Un istogramma utilizzando il rispettivo tastatore molecolare canale rilevatore ottico (FL1 o 2), uno per rilevare emissioni phycocyanin (FL4-H) e l'altra FSC-H, tutti su scala logaritmica.
  9. Incubare i campioni di M.aeruginosa con sonde di acido nucleico nel buio fino a 60 min, la registrazione in celle di dati separati, in un numero di punti di tempo (1, 5, 10, 15, 30 e 60 min).
    NOTA: Quando la regolazione dei parametri quali l'assegno di pH con produce per potenziali reazioni di taluni prodotti chimici (per l'acido nucleico testato sonde un buffer non può contenere fosfati o alti livelli di monovalenti o divacationi prestato, come il legame con il DNA sarà ridotto).
  10. Applicare un cancello software per includere solo l'istogramma FSC-H (320.000 - 1.500.000) per la destinazione di organismi dimensione della cella, nel rispettivo canale istogramma sonda a fluorescenza.
    NOTA: Le concentrazioni usate in questo protocollo erano 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 micron, che possono essere modificati per aumentare o diminuire il volume del campione M.aeruginosa o soluzione madre iniziale di sonde nucleici.
  11. Nel canale della sonda a fluorescenza, applicare un altro cancello software incluso per la vetta più alta l'istogramma (verde FL1-H, 240.000 - 1.650.000, arancio FL2-H, 30.000 - 165.000) e, successivamente, cancello che la sonda positivo fluorescenza nella trama densità.
  12. Eseguire i passaggi 3,1-3,11 con il 100% "dal vivo", 100% 'morti' e tutti i campioni di cultura mista, regolando le concentrazioni delle sonde molecolari (ad esempio x 0,1 x 10) e / o la temperatura e livelli di pH, se necessario.
  13. Confrontare il numero di segnali molecolari sonda fluorescenza positivi alla densità cellula originaria della cellule "morti" (tratto da metà totale FSC-H o di una cultura al 100% 'morto') per trovare la percentuale totale di cellule colorate con l'acido nucleico sonde.
  14. Fate questo per ogni periodo di tempo all'interno di ciascuna concentrazione per trovare il protocollo ottimale per la più alta percentuale di nucleico cella sonda assorbimento senza produrre non specifica colorazione (usare i mezzi in-Way One ANOVA o Test di Kruskal-Wallis, se i dati sono non parametrica).

4. Molecular Probe fluorescenza Discriminazione

  1. Per il test di fluorescenza interferenza / sovrapposizione di colorazione della cellula intrinseca o non specifico selezionare i dati coltura mista "morti" il 50% 'dal vivo' e il 50% e togliere tutte le porte.
  2. Applicare un gate software per includere solo l'istogramma FSC-H (320.000 - 1.500.000) per il target Organismi dimensione della cella, nel ficocianinaistogramma del canale.
  3. Porta la cima più alta ficocianina ed etichetta come 'live', con l'aggiunta del picco più basso etichettato come 'morto'.
  4. Eseguire un ulteriore passo cancello nel rispettivo canale istogramma sonda di fluorescenza molecolare, utilizzando uno alla volta, il 'live' e poi ficocianina 'morto' (FL4) segnali, registrando entrambe le lunghezze d'onda media.
    NOTA: La modalità per indurre la mortalità in questo esperimento è stato fatto da un trattamento termico, che in virtù del presente protocollo si riduce chiaramente segnali ficocianina. Altri metodi di popolazioni di cellule che producono "morti" possono produrre risultati differenti nelle corse acquisite.
  5. Rapporto le lunghezze d'onda medi della fluorescenza positiva molecolare sonda ('morto') e il segnale / non specifico intrinseco ('live') per determinare la sensibilità protocollo.
    NOTA: per migliorare la fluorescenza discriminazione di 'live' e Vuh 'morto'zioni, aumentano la fonte di carbonio per l'assorbimento macchia attiva nelle cellule di nutrienti impoverito o acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per migliorare la permeabilità della parete cellulare e conseguenti segnali di fluorescenza 6. Compensazione limitata in alcuni modelli FCM per sovrapposizione spettrale può essere effettuata dall'utente manipolata correzione coppie durante l'acquisizione dei campioni (variazioni di tensione PMT) o da post-analitica software specializzato.
  6. Selezionare il protocollo ottimizzato dove la più alta quantità di cellule "morti" è stato macchiato, senza il verificarsi non specifica colorazione. Se un numero di prova di avere risultati simili accettare il protocollo con la concentrazione e l'incubazione di tempo più basso, insieme a una buona discriminazione segnale di fluorescenza. Seguire produce le istruzioni per la procedura di spegnimento citometro.

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Risultati

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Forward scatter luce (FSC) e uscite luce laterale scatter (SSC) da una cultura lotto M.aeruginosa in fase esponenziale fornisce informazioni sulla dimensione della cella (diametro) e granularità interno rispettivamente (Figura 1A). FSC può discriminare le cellule che sono troppo grandi e / o piccolo per essere M.aeruginosa. Questa discriminazione o di gating può essere fatto da dati di raffinazione tra alcuni punti di una uscita FSC (Figura 1C)....

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Discussione

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Le aumento del numero di pubblicazioni utilizzando sonde molecolari indica che i dati affidabili e informativi possono essere ottenuti 5,6,8 - 15,19,22,23. Come ancora non c'è nessuna macchia perfetta per la vitalità cellulare che può essere efficace in tutte le specie con la stessa concentrazione e l'incubazione tempo 6,10. Anche lo stesso tipo di sonda con emissioni di fluorescenza alterati mostra la necessità di stabilire la concentrazione e l'incubazione ora co...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Gli autori vorrebbero riconoscere dottorando Dave Hartnell e Università di Bournemouth per il sostegno e il finanziamento per la ricerca e le strutture.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cyanobacteria MediaSigma-AldrichC3061-500MLBG-11 Soluzione concentrata di acqua dolce (diluizione x50)
Fluido di decontaminazioneBD Biosciences653155Eseguire per 2 minuti quando i risultati sono superiori a 12 eventi al secondo in modalità veloce o una velocità di flusso di 66 &; l/min.  Seguito da 2 min di guaina H2O.
Citometro a flussoBD Biosciencessu richiestaBD Accuri C6
SYTOX GreenLife TechnologiesS7020Colorazione dell'acido nucleico - 5 mM di soluzione in DMSO
SYTOX OrangeLife TechnologiesS11368Colorazione di acido nucleico - 5 mM di soluzione in DMSO

Riferimenti

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