Studiando la funzione delle proteine ​​e il ruolo di Altered espressione della proteina da anticorpo interferenza e ricostruzioni tridimensionali

Sommario

Il controllo dell'espressione proteica non è solo essenziale per ogni organismo vivente, ma anche un'importante strategia per studiare le funzioni proteiche nei modelli cellulari. Il protocollo presentato mostra l'applicazione dell'interferenza anticorpale nelle cellule di mammifero, compresi i neuroni primari dell'ippocampo, e dimostra l'uso di ricostruzioni tridimensionali nello studio della funzione delle proteine.

Abstract

Una gestione rigorosa di espressione della proteina è essenziale non solo per ogni organismo vivo, ma anche una strategia importante per indagare le funzioni delle proteine ​​in modelli cellulari. Pertanto, una recente ricerca ha inventato diversi strumenti per indirizzare l'espressione della proteina in linee cellulari di mammifero o anche modelli animali, tra cui l'RNA e l'interferenza degli anticorpi. Mentre la prima strategia ha raccolto molta attenzione nel corso degli ultimi due decenni, i peptidi che mediano una traslocazione dei carichi di anticorpi attraverso le membrane cellulari e nelle cellule, ottenute molto meno interesse. In questa pubblicazione, fornendo un protocollo dettagliato come utilizzare un vettore peptide chiamato Chariot in cellule renali embrionali umane come in neuroni ippocampali primari eseguire esperimenti di interferenza anticorpale e illustrano ulteriormente l'applicazione di ricostruzioni tridimensionali per analizzare la funzione delle proteine. I nostri risultati suggeriscono che Chariot è, probabilmente a causa del suo segnale di localizzazione nucleare, particularly ben adatto a bersaglio le proteine ​​che risiedono nel soma e il nucleo. Sorprendentemente, quando si applica Chariot alle culture ippocampali primarie, il reagente si rivelò essere sorprendentemente ben accettato dai neuroni dissociati.

Introduzione

Una stretto controllo dell'espressione della proteina è essenziale per ogni organismo vivente per comandare il proprio sviluppo e di reagire a segnali ambientali. Pertanto, un gran numero di meccanismi è stato inventato durante l'evoluzione di regolare con precisione il livello di espressione di ogni proteina codificata dal app. 20.000 geni esistenti in qualsiasi cellula eucariotica in un dato momento della sua vita. Che si svolgono in diverse fasi della produzione di proteine, meccanismi regolatori spaziano dalla gestione della struttura della cromatina, trascrizione e RNA movimentazione alla direzione di modificazioni post-traduzionali di proteine, trasporto e degradazione.

Non è quindi sorprendente che i disturbi del macchinari molecolari e livelli di espressione della proteina alterata sottostante sono stati associati con malattie diverse come il cancro o disabilità intellettiva. In effetti, guardando l'eccezionale complessità dello sviluppo neuronale e la funzione del cervello dei mammiferi, la Sensitività di questi sistemi sofisticati ad alterazioni nel espressione della proteina si manifesta in diversi deficit intellettuali ben noti, tra cui Alzheimer e morbo di Parkinson (AD e PD), così come disturbi dello spettro autistico (ASD) come la sindrome dell'X fragile (FXS). Quest'ultima malattia è caratterizzata da una vasta misexpression di una varietà di proteine, che è dovuto alla perdita di una singola definizione regolazione proteine, FMRP (fragile X ritardo mentale Protein) ^1-4. Inoltre, riarrangiamenti cromosomici che interessano la carica variabile legata all'X proteina A (VCXA), una proteina, che gestisce la stabilità mRNA e la traduzione modificando mRNA tappatura ^5, sono state recentemente associate a deficit intellettivi, mentre mutazioni puntiformi non sono state identificate nei pazienti con disabilità cognitive fin d'ora ^{6, 7,} il che suggerisce che i disturbi mentali osservati provengono da espressione VCXA alterata e l'espressione disregolazione della sua prote bersaglioins. In linea con questi risultati, uno studio che ha valutato se de novo copia variazioni del numero di geni sono associati con ASD stabilito che duplicazioni di geni nuovi e delezioni sono un fattore di rischio significativo per ASD ^8, sostenendo in tal modo l'idea che i livelli di espressione della proteina elevati o diminuiti possono causare deficit intellettuali.

Sorprendentemente, recenti ricerche hanno fornito ulteriore prova che il livello di espressione di una data proteina è regolata con precisione per prevenire l'aggregazione in conseguenza di elevate quantità della proteina con quasi senza margini di sicurezza ^9. È stato quindi proposto che anche piccoli incrementi sono sufficienti ad indurre malattie come AD e PD ^9. Sebbene la varietà di macchinari molecolari che contribuiscono al controllo espressione della proteina suggerisce uno schema regolazione complessa alla luce di questi risultati, uno studio che ha il livello di espressione di oltre 5.000 geni di mammifero ¹⁰ dimostrato chela natura ha preferito uno schema più parsimoniosa: L'abbondanza cellulare di proteine ​​ha dimostrato di essere in prevalenza regolato a livello della traduzione ^10, illustrando in tal modo che la gestione della disponibilità di RNA serve soprattutto per mettere a punto l'espressione della proteina.

Studiando la dose di proteine ​​di interesse (POI) è quindi importante non solo per la comprensione delle funzioni endogene di una proteina, ma anche alla ricerca di molte malattie e lo sviluppo di terapie. Così, negli ultimi decenni hanno visto l'avanzata delle diverse strategie utilizzando RNA interferenza di manipolare dosaggio POI. Anche se l'interferenza dell'RNA è ampiamente usato per studiare la funzione delle proteine ​​e viene anche applicata in studi clinici per il trattamento di cancro o di malattie oculari, nonché a perseguire terapie antivirali nei pazienti ^11-13, alcune difficoltà possono sorgere che potrebbero rendere la strategia di impossibile. Ad esempio, la sequenza seme, che spinge il colpo per omologia è comparabilitàeffetti a breve, quindi la promozione fuori bersaglio bile. Dal momento che le sequenze altamente efficienti sono rari e hanno bisogno di essere trovato tra migliaia di opzioni (rivisto nel ^14), identificando la sequenza giusta può richiedere molto tempo e costoso, ma i risultati possono ancora essere deludente.

Una strategia alternativa è quello di colpire direttamente il POI da anticorpi. Qui, illustriamo l'uso del Carro proteina carrier (prodotto da Active Motif) per ridurre la disponibilità proteina cellulare, e l'impiego di ricostruzioni tridimensionali per studiare la funzione della proteina seguente knock-down.

Il motivo attivo di carro, per sé un 2,8 kDa peptide, viene utilizzato per peptidi navetta, proteine ​​e anticorpi attraverso le membrane delle cellule di mammifero ^15. I soci peptide con POI formando non covalente accoppiato complessi macromolecolari che utilizzano interazioni idrofobiche, dopo complessi Chariot-POI vengono internalizzati nelle cellule in un endosome-indmaniera ependent. Importante, Chariot stato indicato per non pregiudicare la localizzazione intracellulare delle proteine ​​spola, né di esercitare effetti citotossici o di influenzare l'attività biologica del suo carico ^15.

Protocollo

1. Le soluzioni madre

1. Risospendere la polvere motivo attiva liofilizzata in H ₂ O sterile ad una concentrazione finale di 2 mg / mL. Toccare con attenzione per la miscelazione.
2. Preparare piccole aliquote (ad esempio, 12 ml ciascuno, 2 ml sono necessari per reazione) e conservarli a -20 ° C.

2. Preparazione di cellule

1. Seed cellule di mammiferi come le cellule HEK293 o neuroni primari su un terreno di coltura 24 pozzetti in 500 microlitri tra cui antibiotici.
   NOTA: quando si utilizza i neuroni, seminare le cellule a bassa densità e utilizzare solo le due file centro del piatto ben 24. Ogni pozzetto avrà quindi una controparte vuoto al porto del mezzo durante l'incubazione (passo 4.2). Quando si maneggiano i neuroni, assicurarsi sempre che le cellule non sono tenuti al di fuori dell'incubatore per più di qualche minuto.
2. Coltivare le cellule in condizioni adeguate (umidificati, 5% di CO ₂ e 37 ° C) fino a quando le cellule sono app. 50%confluente.
   NOTA: quando si utilizza i neuroni, la cultura delle cellule fino alla fase di sviluppo desiderata viene raggiunta e cambiare app. 25-50% del mezzo due volte a settimana. Media: media Neurobasal (contenente 1x B27, 5 mM L-glutammina e 1x penicillina e la streptomicina, confrontare con rif 16).

3. Carro formazione del complesso

1. Per reazione, diluire 0,1-2 ug del POI o il corrispondente anticorpo, nonche la proteina di controllo, o anticorpo di controllo, rispettivamente, in 50 ml di PBS.
   NOTA: La tecnica funziona anche con complessi macromolecolari costituito da anticorpi primari e secondari pre-bound (cp 'Rappresentante Risultati', figura 1.). Mescolare ed effetti.
2. Per ogni campione, diluire 2 ml soluzione madre Carro in 50 ml di PBS utilizzando tubi separati al fine di evitare l'auto-associazione di Carro. Mescolare ed effetti.
3. Trasferire il POI o anticorpi (passo 3.1) diluito per la diluizione Chariot per pipettaTing. Mescolare ed effetti.
4. Incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente (complessi Chariot-POI formeranno).

4. Trasfezione delle cellule

1. Diluire i complessi Chariot (punto 3.4) in 100 ml terreno di crescita pre-riscaldato (37 ° C, senza additivi). Rimuovere il supporto e lavare le cellule una volta con pre-riscaldato 1x PBS.
   NOTA: quando si utilizza neuroni, non gettare il medium, che sarà riutilizzato. Tenerlo a 37 ° C. Per il lavaggio, utilizzare PBS contenente 0,5 mM MgCl ₂ e CaCl _2.
   Suggerimento: tenere il mezzo in pozzi vuoti, mentre incubando la piastra (passo 4.5).
2. Applicare la soluzione complessa carro (passo 4.1) alle cellule e oscillare delicatamente le cellule per assicurare una distribuzione uniforme della soluzione. Far crescere le cellule in condizioni standard (passo 2,2) per 1 ora. Aggiungere siero a una concentrazione finale del 10%. Quando si utilizzano i neuroni, aggiungere il supporto dal punto 4.1. Crescere le cellule per 1 o 2 ore in più.
   NOTA: Iltempo di incubazione ottimale dipende dalle dimensioni e le proprietà del carico e può essere necessario regolare empiricamente. I seguenti suggerimenti possono servire come linea guida: Per peptidi, 1 ora di solito è sufficiente, per le proteine ​​sono raccomandati 1-2 ore, per gli anticorpi 2 ore, e per la trasfezione di neuroni con anticorpi 4 ore.
3. celle di processo per l'analisi, come al solito. Si prega di notare: la tecnica è compatibile con gli esperimenti che utilizzano i protocolli di fissaggio così come l'imaging dal vivo.

5. Imaging

1. Utilizzando un microscopio a scansione laser, prendere z-pile di cellule e / o compartimenti cellulari di interesse utilizzando circa 0,25-0,5 micron distanza. La distanza strato precisa dipende dalle dimensioni della struttura da ricostruire e deve essere determinato singolarmente.

6. ricostruzione

1. Nei passaggi seguenti, utilizzare il fondo Esc per passare da selezionare e spostarsi, Cntr per selezionare più oggetti facendo clic su on loro e tasto shift per tagliare gli oggetti (cfr. punto 6.10).
2. Aprire il LSM-file in Imaris.
3. Utilizzando la regolazione di visualizzazione per ogni canale, contrastare l'immagine fino a quando le strutture più brillanti raggiungono la saturazione. Si prega di notare che questa regolazione non influenzerà la costruzione superficie, serve solo ad aiutare lo sperimentatore in thresholding l'immagine.
4. Fare clic sull'icona Aggiungi nuove superfici. Si aprirà una procedura guidata.
5. Selezionare: Segmento solo una regione di interesse. Procedere alla fase successiva.
6. Regolare i margini della casella di selezione per misura il vostro oggetto di interesse. Si prega di tenere presente che l'immagine ha 3 dimensioni e che la selezione deve essere adeguato al piano z pure. Se la forma rettangolare della casella di selezione non deve corrispondere l'oggetto di interesse correttamente, girare l'oggetto e / o ingrandire la casella fino a quando tutte le strutture necessarie sono incorporati. oggetti indesiderati possono essere rimossi in seguito (cfr. punto 6.10). Procedere.
7. Selezionare il ch appropriataAnnel. La superficie livello di dettaglio o diametro della sfera devono essere impostati in abbinamento alle strutture di essere ricostruito. A seconda delle caratteristiche del segnale, sia assoluta intensità o Contrasto locale possono essere utilizzati. In generale, il contrasto locale funziona meglio per i segnali diffusi. In ogni caso, le impostazioni devono essere regolate separatamente per ciascun segnale o struttura di interesse, rispettivamente.
8. Utilizzando lo strumento Soglia, ricostruire la struttura di interesse.
9. Completa la ricostruzione facendo clic sulla freccia verde in basso.
10. Regolare l'oggetto ulteriormente utilizzando lo strumento matita per tagliare e rimuovere le superfici, come richiesto. È possibile solo tagliare in direzione nord-sud, quindi inclinare l'immagine per tagliare l'oggetto desiderato.
11. Ottenere misurazioni di volume, area e intensità per ogni superficie da Statistics selezione, statistiche dettagliate, e valori medi.
12. (Passo opzionale) Per osservare le statistiche color-coded (cfr. Figura 2E e F), selezionare la scheda colore della superficie corrispondente e Mark 'Statistica Coded' invece di 'base'. verranno visualizzate diverse opzioni.

Risultati

Nei paragrafi che seguono, i risultati esemplari che illustrano un atterramento funzionale di un POI (Simiate, per ulteriori dettagli si rimanda ^{16, 17)} utilizzando Chariot reagente e l'interferenza degli anticorpi sono presentati. I risultati dimostrano che l'espressione diminuita Simiate compromette l'attività trascrizionale, e, in un modo dipendente dosaggio, induce apoptosi, che si conclude con i tassi di mortalità di oltre il 99% se vengono applicati quantità di anticorpi più alti (...

Discussione

Qui, presentiamo un protocollo per studiare il significato dei livelli di espressione della proteina nel controllo funzioni cellulari in modo dose guidato. Il protocollo descritto consente una manipolazione perfezionato dell'espressione proteica in vari tipi di cellule di mammifero, inclusi neuroni dell'ippocampo, facilitando così studi dettagliati di funzione proteica a livello cellulare.

Anche se l'interferenza dell'RNA rappresenta una strategia ben noto a down-regolare POI...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Chariot	Active Motif	30025	negozio a -20 C
Medium neurobasale	Life technologies	21103-049	riscalda fino a 37 gradi C prima di utilizzare
1x B27	Life technologies	17504044	conservare a -20 gradi C
L-glutammina	Life technologies	25030-149	conservare a -20 °
C Penicillina e Streptomicina	Life technologies	15140-122	negozio a -20 ° C
Software Imaris	Bitplane	n.a.costoso	, ma ineguagliabile
Microscopio a scansione laser	Zeiss	n.a.