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Articolo metodologico

Approccio genetico in avanti per scoprire la resistenza allo stress geni nei topi - Uno Schermo high-throughput in cellule ES

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DOI:

10.3791/53062

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11 novembre 2015

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado Denver

In questo articolo

Sommario

Resistenza allo stress è uno dei tratti distintivi per la longevità ed è conosciuto per essere geneticamente governati. Qui, abbiamo sviluppato un metodo high-throughput imparziale per lo screening di mutazioni che conferiscono resistenza allo stress in cellule ES con cui sviluppare modelli murini per gli studi di longevità.

Abstract

Gli screening genetici guidati dal fenotipo nei topi sono una tecnica potente per scoprire le funzioni geniche, ma sono spesso ostacolati da costi estremamente elevati, che ne limitano fortemente il potenziale. Descriviamo qui l'uso di cellule staminali embrionali di topo (ES) come cellule surrogate per lo screening di un fenotipo di interesse e successivamente introduciamo queste cellule in un embrione ospite per svilupparsi in un topo vivente portatore del fenotipo. Questo metodo fornisce (1) una piattaforma economica e ad alto rendimento per lo screening genetico nelle cellule di mammifero; (2) un modo rapido per identificare i geni mutati e verificarne la causalità; e (3) una scorciatoia per sviluppare mutanti di topo direttamente da queste cellule ES selezionate per studi su animali interi. Abbiamo dimostrato l'uso del paraquat (PQ) per selezionare mutanti resistenti e identificare le mutazioni che conferiscono resistenza allo stress ossidativo. Altri fattori di stress o composti citotossici possono anche essere utilizzati per lo screening di mutanti resistenti per scoprire nuovi determinanti genetici di una varietà di resistenza allo stress cellulare.

Introduzione

La longevità è un rapporto intimo con la resistenza allo stress. In generale, specie longeve spesso dimostrano una maggiore resistenza verso molteplici fattori di stress, come il perossido di idrogeno, il paraquat (PQ), UV, al calore, e metalli pesanti 1,2. Al contrario, l'aumento della sensibilità allo stress tende a prevedere vita ridotta e / o una maggiore fenotipo malattia soggetta. Il lavaggio via anti-ossidante è stato a lungo speculato a svolgere un ruolo importante nel conferire resistenza allo stress per l'animale. Tuttavia, con poche eccezioni, studi da una varietà di animali transgenici con manipolazioni in vari enzimi antiossidanti (ad esempio, SOD) indicano che l'aumento del livello di ossidanti enzimi scavenging non aumenta durata o durata di salute 3. Questi dati suggeriscono che la resistenza caratteristica sollecitazioni costantemente osservati in animali lunga durata è mediato da altre vie cellulari ancora essere scoperti.

Abbiamo preso un avanti imparzialeapproccio genetico per identificare i geni che su mutato, potrebbe conferire una resistenza allo stress fenotipo in staminali embrionali in coltura (ES) cellule. Cellule staminali offrono due grandi vantaggi in questo studio: (1) sofisticate manipolazioni genetiche sono a disposizione per modificare il genoma delle cellule ES; e (2) qualsiasi resistenti cellule ES di stress recuperate dallo schermo può essere utilizzato direttamente per la produzione di mouse, permettendo una rapida traduzione in studi su animali interi per misurare vita e durata della salute.

In questa relazione, abbiamo descritto l'uso della linea di cellule ES C9, in cui gli alleli BLM erano sotto controllo da un elemento sensibile alla tetraciclina. Trattamento di doxiciclina (DOX) transitoriamente spento l'espressione di Blm conseguente aumento incidente di scambio di cromatidi fratelli. Questo breve termine Blm knock-out permesso la generazione di mutazioni omozigoti all'interno della popolazione eterozigote in modo che le mutazioni recessive per la resistenza allo stress possono essere catturate nel processo di screening. Noianche descritto l'uso di piggyBac (PB) transposon come mutageno di inserire a caso un poli-Una cassetta trappola (PB-UPA) di mutare i geni nel genoma. Le cellule con rottura di un gene da parte del poli-Una trappola divennero G418 resistenti e potrebbero essere recuperati in modo che un insieme di mutanti del gene-trap (biblioteca gene-trap) potrebbe essere fatto, e, successivamente, proiettato per i cloni mutanti che erano resistenti stress.

Cloni resistenti stress recuperati dalla selezione potrebbero essere caratterizzati piuttosto rapidamente mediante tecniche molecolari in relazione al numero di inserimenti (qPCR), il sito di inserzione (splinkerette PCR), l'identità del gene interrotto (BLAST), e il suo livello di espressione ( RT-qPCR). L'inserimento PB potrebbe essere remobilized per espressione transiente di MPB transposase nel clone per ripristinare la sequenza di DNA wild-type e testare per la perdita di resistenza alle sollecitazioni in tal modo. Questi sono modi potenti per confermare la causalità della mutazione, che dovrebbe essere fatto primaalla produzione costoso mouse. Precedenti studi hanno dimostrato che le cellule esposte a fattori di stress hanno perso il loro 4,5 pluripotenza. Così, in questo protocollo, la conservazione di un set di repliche di cellule mutanti, che non sarebbe trattata con fattori di stress è un fattore critico per la produzione di successo del mouse.

Il nostro laboratorio ha realizzato la linea di cellule ES C9 e il vettore PB-UPA, entrambi sono a disposizione di altri ricercatori su richiesta. Il protocollo qui riportato inizierà dalla generazione di de novo biblioteca di cellule ES geni intrappolati con PB-UPA (Figura 1A), seguita dalla placcatura di replica e selezione sforzo per isolare cloni resistenti allo stress (Figura 1B). Abbiamo dimostrato la selezione con il paraquat, un generatore di radicali liberi potente all'interno delle cellule. Virtualmente, qualsiasi composto citotossico o tossina, per esempio, ER stress (ad esempio, tapsigargina e tunicamicina), ossidante neuronale (ad esempio, MPP +, dopamina 6-idrossi, e rotenone), calore, e pesantemetalli (ad esempio, Cd, Se), potrebbero essere adattati al metodo di selezionare per rispettivi mutanti resistenti.

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Protocollo

1. Gene-trapped ES Libreria di celle Edilizia Uso piggyBac Transposon

  1. Preparare fibroblasti embrionali di topo primaria (PMEF) come alimentatori per colture cellulari ES
    1. Scongelare una fiala di mitomicina C-inattivato PMEF (5,0 x 10 6) in un bagno d'acqua a 37 ° C. Trasferire le cellule in 5 ml di terreno delle cellule ES (DMEM contenente 15% FBS, 1.000 unità / ml di fattori inibitori leucemia, 100 micron aminoacidi essenziali, glutammina mm 2, 55 mM 2-mercaptoetanolo, e 25 unità / ml di penicillina / streptomicina ), e centrifugare a 100 xg per 5 min.
    2. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 30 ml di terreno cellule ES seguite da distribuire in due fiasche T25 (5 ml ciascuno) e due piastre da 100 mm (10 ml ciascuna). Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore.
  2. Cultura ed espandere cellule C9 ES
    1. Scongelare una fiala di cellule ES C9 ​​(2,5 x 10 6 cellule in 0,5 ml) in un bagno d'acqua a 37 ° e trasferire lacellule in 5 ml di terreno delle cellule ES. Centrifugare a 100 xg per 5 min.
    2. Aspirare il surnatante e risospendere cellule ES in 5 ml di mezzo delle cellule ES seguita dalla placcatura nel pallone alimentatore T25. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2. Sostituire medio delle cellule ES quotidiano.
    3. Dopo 2 giorni di coltura, le cellule ES dovrebbero diventare ~ 80% confluenti, e sono pronti per essere diversi passaggi. Lavare le cellule con 5 ml di PBS (senza Ca2 + e Mg2 +) e poi aggiungere 2,5 ml preriscaldata 0,25% tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 10 min. Aggiungere 2,5 ml di mezzo di cellule ES per fermare tripsina; pipetta su e giù per 15 volte per rompere grumi di cellule. Centrifugare a 100 xg per 5 min.
    4. Aspirare le cellule surnatante e risospendere in 4 ml di terreno delle cellule ES. Trasferimento 1 ml di cellule per piastra da 100 mm contenente 9 ml ES medio delle cellule; preparare due piastre da 100 mm. Si tratta di un 1: passaggio 8. Nutrire le cellule al giorno con 10 ml di ES medio delle cellule.
  3. Preparare 96-pozzetti di alimentazione per la biblioteca
    1. Come indicato al punto 1.1.1, scongelare tre fiale di mitomicina-C inattivati ​​PMEF (ciascuno contenente 5 x 10 6 celle) e risospendere le cellule da ciascun flaconcino con 33,3 ml ES medio delle cellule. Combinare cellule per produrre una sospensione di cellule 100-ml.
    2. Piatto 100 cellule microlitri per pozzetto su dieci piastre da 96 pozzetti. Queste piastre di alimentazione a 96 pozzetti deve essere preparato almeno un giorno prima transfettando cellule ES C9 ​​con PB trasposoni.
  4. Elettroporazione di cellule ES C9 con il vettore PB-UPA
    1. Trypsinize e contare le cellule ES C9 espanso utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Lavare ogni piatto 100 mm di celle C9 ES con 10 ml di PBS. Aggiungere 8 ml preriscaldata 0,25% tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C per 10 min.
    2. Smettere di tripsina con l'aggiunta di 2 ml ES medio delle cellule. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e pipetta su e giù per 15 volte a dissolversi grumi di cellule. Subito centrifugare a 100 xg per 5 min seguita da aspirare il surnatante.
    3. Cell Risospenderes in 10 ml di media ES cellule e contare le cellule ES con un emocitometro. Preparare sei tubi da 15 ml di sospensione cellulare ognuno contenente 5 x 10 6 cellule ES. Centrifugare a 100 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere ogni pellet di cellule in 0,8 ml di PBS.
    4. Preparare sei cuvette elettroporazione (4 millimetri gap) per cui le cellule 0,8 ml vengono trasferiti. Per ogni provetta, aggiungere 1 mg PB-UPA e 20 mg MPB trasposasi (mPBase); mescolare delicatamente pipettando su e giù. Mettere le provette su ghiaccio. Eseguire elettroporazione con un elettroporatore utilizzando l'impostazione esponenziale a 250 V, 500 uF, e l'infinito ohm.
      NOTA: in genere, la costante di tempo è di circa 10 a 12 msec per una elettroporazione di successo, che producono circa 1.500 a 2.000 G418 trasformanti resistenti per 5 x 10 6 cellule.
    5. Recuperare e in comune le cellule trasfettate in un pallone T75 contenente 98 ml di ES medio delle cellule. Mescolare le cellule pipettando dolce e poi trasferire le cellule ad un serbatoio (50 ml). Noiing una pipetta a 12 canali, trasferire 100 ul di cellule per pozzetto di piastre di alimentazione precedentemente preparata da 96 pozzetti (10 in totale). Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2.
    6. Dopo 24 ore, nutrire le cellule quotidianamente con fresco medio cella contenente G418 ES (150 mg / ml) per selezionare per i cloni gene-trappola.
      NOTA: in genere ogni pozzetto conterrà una decina di G418 colonie resistenti. Quando queste colonie crescono di dimensione sufficiente (in genere 5-7 giorni), le piastre a 96 pozzetti (la biblioteca) saranno replicati in 2 set per la conservazione e la selezione, rispettivamente. Ogni piastra nella libreria è designato come 'sub-library', quindi in questo caso, ci sono 10 sotto-librerie.

2. Biblioteca replica

  1. Replicare le piastre master
    1. 24-48 ore prima che le colonie resistenti G418 che raggiungono il 50-60% di confluenza, scongelare altri tre fiale di mitomicina C-inattivato PMEF su dieci piastre a 96 pozzetti come alimentatori (fare riferimento alla sezione 1.3). Gelatinaizzare dieci piastre a 96 pozzetti incubando 0,1% di gelatina (100 ml / pozzetto) a 37 ° C per almeno 15 - 30 min; O / N incubazione è accettabile.
    2. Preparare sospensioni singola cella nelle piastre a 96 pozzetti per tripsinizzazione. Aspirare media da piastre da 96 pozzetti e lavare una volta a parità di volume di PBS (senza Ca 2+, Mg 2+). Aggiungere 50 ml di pre-riscaldato 0,25% tripsina-EDTA, incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 10 min. Smettere di tripsina con 50 ml di media delle cellule ES. Spezzare i grumi di cellule pipettando su e giù 15 volte con la pipetta multicanale.
    3. Trasferimento 50 ml di sospensione cellulare tripsinizzati alla riga corrispondente della piastra di alimentazione (Master) che già contiene 150 microlitri medio delle cellule ES e le restanti 50 ml alla riga corrispondente della piastra di gelatinizzato (replica) già contenente 150 ml di media delle cellule ES. Elaborare ogni riga di celle ad una piastra master e replica. Incubare le piastre (ora contenente 200 ml cVolume ulture) a 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
      NOTA: Ora ci sono una ventina di piastre a 96 pozzetti.
    4. Il giorno successivo nutrire le cellule con 100 pl fresco medio delle cellule ES contenente 150 mg / ml G418. Sostituire il mezzo di tutti i giorni fino i pozzi sono 80-90% confluenti.
  2. Congelare le piastre master
    1. Quando le piastre master sono circa l'80% confluenti, trypsinize le cellule, come descritto (vedere la sezione 2.1.2).
    2. Rimuovere le piastre e fermare la reazione tripsina con 50 ml di 2x congelamento media (60% medio delle cellule ES, 20% FBS, 20% DMSO). Pipetta su e giù per 10 volte con una pipetta multicanale per garantire la corretta miscelazione del mezzo di congelamento.
    3. Mettere le piastre a 96 pozzetti in una scatola di polistirolo ben sigillato e metterlo in freezer -80 ° C per un massimo di quattro mesi di stoccaggio. Quattro mesi permetteranno tempo sufficiente per completare la selezione stress e per identificare quali pozzi dalla piastra master contengono i cloni di interesse.
      NOTA: Conservare a -80 & #176; C più di 4 mesi si tradurrà in declino della vitalità cellulare. Uno può utilizzare crio-tubi nel formato a 96 pozzetti che possono essere immagazzinate nella fase vapore di azoto liquido per il periodo di stoccaggio prolungato.
  3. Preparare piatti DNA e piscine sub-biblioteca da lastre di replica
    1. 24-48 ore prima di replicare ulteriormente alle piastre del DNA e piscine sub-biblioteca, preparare dieci piatti da 100 mm con mitomicina C-inattivato PMEF per la piscina sub-biblioteca, e dieci gelatinizzato piastre a 96 pozzetti per la piastra di DNA si replica. Consultare la sezione 1.3 per la procedura generale.
    2. Trypsinize le cellule in piastre da 96 pozzetti di replica (vedere la sezione 2.1.2). Durante la fase di tripsinizzazione 10 min, aspirare gelatina dalle piastre DNA e sostituire con 150 microlitri di cellule ES mezzo contenente G418 (150 mcg / ml). Inoltre, preparare un serbatoio contenente 5 ml di terreno delle cellule ES per messa in comune dei "sotto-biblioteche nel piatto alimentatore da 100 mm.
    3. A seguito di tripsinizzazione, arresto provarePSIN con 50 ml di cellule ES media una riga alla volta utilizzando una pipetta a 12 canali. Pipetta su e giù per 10 volte per spezzare grumi di cellule.
    4. Trasferimento 50 microlitri della sospensione cellulare alla riga corrispondente della piastra di DNA e trasferire i restanti 50 microlitri al serbatoio contenente 5 ml ES mezzo cellulare. Dopo aver completato una piastra completa a 96 pozzetti, aspirare il mezzo di una piastra di alimentazione da 100 mm a cui le cellule aggregati vengono trasferiti. Queste cellule mutagenizzate pool sono designati come un 'sub-library'.
    5. Ripetere l'operazione per i restanti nove piastre a 96 pozzetti. Feed the piastre DNA a 96 pozzetti e piastre da 100 mm pool 'sub-biblioteca "quotidiano con terreno contenente cellule ES G418 (150 mg / ml).
      NOTA: Ora ci sono dieci piastre a 96 pozzetti 'DNA', e 'sub-biblioteca "piastre dieci da 100 mm.
  4. Congelare le piastre del DNA. Quando le cellule nella piastra DNA sono 80-90% confluenti, aspirare il terreno, lavare le cellule due volte con 100l di PBS e conservare a -20 ° C per l'isolamento dopo DNA genomico 6. Queste piastre di DNA saranno proiettati mediante PCR per identificare quali corrispondente bene nel piatto 'Master' contiene il clone di interesse.

3. Doxiciclina indotta mutanti omozigoti

  1. Congelare le piscine sub-biblioteca e le cellule di passaggio per il trattamento doxiciclina
    1. 24 ore prima che le piastre da 100 mm "sub-libreria» aventi colonie abbastanza grandi per produrre 70-80% di confluenza, preparare una serie di dieci gelatinizzato piastre da 100 mm per il trattamento doxiciclina.
    2. Preparare sospensioni singola cella di ogni sub-biblioteca (fare riferimento alle sezioni 1.4.1 e 1.4.2 per maggiori dettagli). Trasferimento 5 x 10 6 cellule per piastra da 100 mm gelatinizzato con doxiciclina (1 mg / ml); incubare a 37 ° C, 5% CO 2. Congelare le piscine sub-biblioteca rimanenti non doxiciclina trattati con 5 x 10 6 cellule per fiala.
  2. Passage cellule in presenzadi doxiciclina a mettere fuori Blm
    1. Passaggio sotto-librerie a 1: 8 ogni 2-3 giorni in presenza di doxiciclina (1 mg / ml) per un massimo di due settimane, durante le quali dox-indotta Knock-out di Blm promuoverà perdita di eterozigosi nella cella popolazione, consentendo la generazione di mutanti omozigoti.

4. Selezione Stress e isolamento di cloni resistenti

  1. Le cellule trattate con doxiciclina soggetto per la selezione dello stress
    1. 24 ore prima di passaging cellule trattate doxiciclina per la selezione dello stress, preparare dieci gelatinizzato piastre da 150 mm, posto a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore umidificato.
    2. Preparare una sospensione di cellule singole di ogni sotto-libreria tripsinizzazione (fare riferimento alla sezione 1.4.1 e 1.4.2 per i dettagli). Seed 6.6 x 10 6 cellule su ciascuna piastra 150 mm in 30 ml di volume totale coltura, distribuire uniformemente le cellule. Incubare le cellule con fattore di stress (10 micron paraquat o omissione di β-mercaptoetanolo,in mezzo delle cellule ES contenente 7,5% inattivato al calore FBS) per 7 giorni, dopo di che sostituiscono con normale medio delle cellule ES per consentire cellule sopravvissute di crescere in colonie per la raccolta.
    3. Opzionale: Congelare sinistra sulle celle doxiciclina-trattato a 5.0 x 10 6 cellule per fiala.
  2. Scegli colonie resistenti allo stress
    1. Dopo ripristinare i media normale per una settimana, osservare quanti lo stress sono presenti colonie resistenti. A seconda del numero di colonie da prelevare, preparare abbastanza pozzi con mitomicina C-inattivato PMEF su piastre a 96 pozzetti uno giorno prima conseguenza (vedere la sezione 1.1 per i dettagli).
    2. Il giorno della raccolta, aspirare e sostituire medie piastra alimentatore 96 pozzetti con 100 microlitri fresca medie cellule ES, posizionare nuovamente dentro 37 ° C, 5% CO 2 incubatore umidificato. A questo punto, preparare una piastra a 96 pozzetti con fondo a U 50 microlitri 0,25% tripsina-EDTA per pozzetto. Aspirare il terreno dalla piastra selezione di stress da 150 mm e aggiungere eil volume qual di PBS.
    3. Impostare la micropipetta a 2 microlitri, e 'raccogliere' sopravvivere colonie nella tripsina U-bottom contenenti pozzi, raccogliendo una colonia per pozzetto. È accettabile lasciare piastra sedersi a RT finché è stato scelto il numero desiderato di colonie. Poi, incubare la piastra inferiore U a 37 ° C, 5% CO 2 per 10 min.
      Nota: in genere, si prende 1 ora a prendere 96 colonie.
    4. Smettere di reazione tripsina una riga alla volta con 50 microlitri medio cellule ES con una pipetta multicanale. Pipettare su e giù 15 volte per ottenere una sospensione di cellule singole e trasferire 100 microlitri di cellule alla riga corrispondente della piastra di alimentazione già contenente 100 ml di mezzo di cellule ES. Completare il trasferimento per l'intero piatto. Cellule di coltura O / N in 200 ml. La prossima mattina, medio aspirare e sostituirlo con 100 microlitri di media delle cellule ES.
  3. Replicare le piastre a 96 pozzetti
    1. Quando i pozzi delle colonie raccolti sono 80-90% confluent, replicare in due piastre corrispondenti, una per l'isolamento del DNA e l'altro per le celle di back-up. Queste piastre sono gelatinizzato e non contengono mitomicina C-inattivato PMEF.
    2. Aspirare il terreno e lavare con 100 l di PBS. Aggiungere 50 ml di 0,25% tripsina-EDTA a ciascun pozzetto, incubare a 37 ° C per 10 min. Fermare la tripsina con 150 microlitri medio delle cellule ES, mescolare pipettando, e trasferire 100 l di sospensione cellulare al corrispondente fila di due piastre da 96 pozzetti. Cambiare medio giornaliero.
    3. Quando le piastre sono 80-90% confluenti, congelare una serie di piatti come un 'back-up' (fare riferimento alla sezione 2.2 per i dettagli). L'altra serie di piastre vengono ulteriormente ampliata come descritto di seguito.
  4. Cellule in espansione per l'isolamento del DNA genomico
    1. Preparare una sospensione di cellule singole nella piastra DNA a 96 pozzetti (vedere 2.1.2 per i dettagli).
    2. Trasferire la sospensione cellulare da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti per il pozzo di un 24-pozzetti (4 totale) utilizzando un micropipette. Assicurarsi che vi sia alcuna contaminazione incrociata di tutte le cellule, come le colonie "raccolti" sono 'clonale' origine. Cellule di coltura in 0,5 ml ES medio cellula, cambiando media tutti i giorni fino pozzi sono 80-90% confluenti.
      NOTA: Il 24-pozzetti permetterà rendimento sufficiente di DNA genomico per l'analisi PCR.

5. Individuazione dei siti di inserzione PB e Geni Trapped

  1. Isolamento DNA genomico da 24 pozzetti: Lisare le cellule nella piastra di 24 pozzetti e isolare privo di RNA DNA genomico.
  2. Eseguire Splinkerette PCR (SpPCR) per generare frammenti di sequenze che fiancheggiano il sito di integrazione transposon PB come descritto 7,8.
    NOTA: SpPCR è un processo di cinque giorni, anche se hands-on di tempo ogni giorno è minima.

6. Analisi genetica dei cloni mutanti

  1. Individuare maestro bene e purificare clone di interessi.
    1. Quando il sito di integrazione PB è statamappato, la progettazione di un primer forward monte del sito di integrazione da utilizzare con un primer reverse PB (ad esempio, PB3'-1) 8 e schermare la piastra di DNA corrispondente alla stessa 'sub-library' da cui il clone resistente sollecitazioni stato scelto. Aspettatevi di trovare un solo bene positivo su tutta la piastra di DNA da 96 pozzetti. Scongelare questo esatto bene dalla piastra di 'Master' per un 24-pozzetti su linee e far crescere cellule fino al 80-90% di confluenza.
      NOTA: A questo punto, questo pozzo contiene una miscela di cloni geni intrappolati.
    2. Quando la piastra 24 pozzetti è 80-90% confluenti, trypsinize cellule e piastra 1.000 ES cellule in una piastra di alimentazione da 100 mm (garantire sospensione singola cella). Passaggio celle rimanenti in un pallone T25 su alimentatori di espansione. Congelare le cellule dal pallone T25 quando le colonie sono 80-90% confluenti. Congelare 4 fiale al pallone T25 come back-up.
    3. Lasciare le colonie di crescere per 7 giorni e poi prendere 96 colonie in 96 pozzi feeder piatto. Consultare la sezione 4.2 per la raccolta di procedura. Replicare la piastra quando è pronto in un piatto di 'DNA' e bloccare gli altri come '2 ° -master' piatto (fare riferimento alla sezione 2.2 per congelamento).
    4. Lasciare colonie per raggiungere 80-90% di confluenza. Schermo piatto DNA per trovare pozzetti contenenti il ​​clone purificato di interesse. Expand cellule dal 96 pozzetti 2 nd -master a 24 pozzetti e successivamente in un pallone T25 (tutta alimentatori). Congelare 4 flaconcini per pallone T25.
      NOTA: A questo punto, la linea cellulare gene-intrappolata è clonale, non è stata esposta al fattore di stress, ed è adatto per la produzione di mouse.
  2. Determinare il numero di inserimento PB: Scongelare una fiala della linea cellulare resistente sollecitazioni ed espandere le cellule in un pallone T25 gelatinizzato. Isolare DNA genomico e controllare il numero copia del trasposone PB. Ciò può essere ottenuto mediante qPCR mira il gene neomicina.
  3. Misurare il livello di espressione genica: dopo confirming vi è un singolo evento di integrazione PB nella linea cellulare di interesse, misurare il livello di espressione del gene intrappolato mediante RT-qPCR utilizzando sonde specifiche Taqman per ciascun gene.
  4. Sequenziare il mutante mRNA: Generare un amplicone cDNA mediante PCR utilizzando un primer ricottura a monte per un esone e un primer ricottura a valle alla sequenza splice accettore della cassetta trappola gene. Sequence il frammento di cDNA per confermare che la giunzione previsto si verifica nel gene intrappolato.
  5. Rimobilitare il trasposone piggyBac per verificare la relazione causale tra il gene intrappolati e la resistenza allo stress.
    1. 24-48 ore prima di scongelamento cellule per PB rimobilizzazione, disgelo e piatto DR4 alimentatori sul pallone un T25 e due piastre da 100 mm. Almeno un giorno dopo gli alimentatori DR4 sono placcati su beuta T25, scongelare un flaconcino di linea cellulare contenente l'inserimento PB e piastra le cellule nel pallone T25 contenente alimentatori DR4. Crescere le cellule in terreno di cellule ESper 48 ore, cambiando medio giornaliero.
    2. Preparare una sospensione di cellule singole delle cellule ES. Contare le cellule con un contaglobuli automatizzato, e trasferire 5.0 x 10 6 cellule ES ad un tubo 15 ml. Centrifugare a 100 xg, e risospendere le cellule in 800 l di PBS. Trasferire la sospensione in una cuvetta 4 mm.
    3. Aggiungere 20 mg mPBase Puro alla cuvetta, mescolare pipettando, e le cellule elettroporazione (fare riferimento alla sezione 1.4 per i dettagli). Distribuire le cellule transfettate su due piastre di alimentazione DR4 100 mm. Cellule di coltura O / N in media di cellule ES.
    4. La mattina dopo, nutrire le cellule con ES media con / ml puromicina e cultura cellule 1 mcg per 48 ore. Estrarre selezione puromicina e continuare a coltivare le cellule per 5 giorni. Quando le colonie sono abbastanza grandi per la raccolta, scegliere in una piastra di alimentazione a 96 pozzetti (vedere paragrafo 4.2).
    5. Quando le cellule raccolte hanno raggiunto 80-90% di confluenza, raggruppati 1/6 th della piastra in una piastra di DNA e 1/6 del plmangiato in un piatto di G418, lasciando 2/3 rds delle cellule nella piastra originale da congelare (vedi sezione 2.2 per congelamento).
    6. Cultura la piastra di DNA in cellule ES medio per l'isolamento del DNA più tardi, e la piastra G418 a 150 mg / ml di G418 per testare per la perdita di resistenza alla neomicina. Wells senza cellule vitali dopo 72-96 h in coltura contenente G418 indicano successo rimobilizzazione del PB trasposoni-gene trapping.
    7. Le corrispondenti pozzetti della piastra 'DNA' saranno proiettati mediante PCR per confermare il trasposone PB è stato rimosso. Quando la piastra DNA è 90% confluenti, isolare il DNA genomico in formato piastra da 96 pozzetti 4 per lo screening PCR per il ripristino della sequenza wild-type e l'assenza di neo-IRES come mezzo per confermare reversione.
    8. Scongelare i pozzetti corrispondenti della piastra di Master a 24 pozzetti ed espandere in un pallone T25 (tutti con alimentatori). Congelare quattro fiale al pallone T25 come back-up.

7. Generazione di mouse Mutanti

  1. Recuperare le cellule ES resistenti dalle piastre master ed utilizzare per l'iniezione embrione per generare chimera. Circa 15-20 cellule ES vengono iniettate in un individuo C57BL / 6 blastocisti. Trasferimento 15 blastocisti per topo alla nell'utero di una femmina pseudopregnant (ceppo ICR). Mate la chimera maschile (indicato dal ES cellule specifico colore del mantello agouti) recuperati dalla cucciolata con diversi giovani vergini C57BL / 6J femmine di prova per la trasmissione germinale, e per costruire una colonia di topi mutanti.
  2. Isolare e fibroblasti cutanei prova coda di topi mutanti F1 e wild-type littermate per le specie reattive dell'ossigeno (ROS) il livello e la resistenza al paraquat 9.

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Risultati

In un tipico esperimento mutagenesi, la trasfezione è costituito da un totale di 3 x 10 7 cellule ES con PB-UPA e Mpb trasposasi. Il numero di cellule ES geni intrappolati generati in due esperimenti indipendenti sono riassunti in Tabella 1. L'efficienza del gene-intrappolamento è di circa 0,04%. Le librerie gene-trap combinate contengono 22.400 mutanti indipendenti, di una copertura completa del genoma del topo (23.000 geni codificanti). Riempimento eccessivo potrebbe essere raggiunto ge...

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Discussione

L'analisi genetica diretta consente un'interrogazione imparziale del genoma alla ricerca di geni responsabili di un fenotipo specifico. Questo metodo è molto potente per scoprire nuove funzioni geniche. È stato ampiamente utilizzato negli organismi inferiori ma non nei mammiferi, come il topo, principalmente a causa del costo estremamente elevato associato alle infrastrutture e alla logistica che comporterebbe. Qui, abbiamo spostato il processo di screening genetico sulla piattaforma di coltura cellulare ES, aumentand...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il Wellcome Trust Sanger Institute per i doni del trasposone piggyBac e della trasposone piggyBac. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione Butcher del Colorado e dal NIH R01 AG041801 (WSC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vector
PB-UPA
mPBase
mPBasePuro
Coltura tissutale
>500-ml Filtri StericupEMD Millipore
250-ml Filtri StericupEMD MilliporeSCGPU02RE
50 ml Filtri Steriflip-GVEMD MilliporeSE1M179M6
KO DMEMLife Technologies10829-018
DMEMSigma-AldrichD6429
FBSColtura tissutale Biologicals104
FBS inattivato a caldoSigma-AldrichF4135-500
LIFEMD MilliporeESG1107
Aminoacidi non essenziali Life Technologies11140-050
GlutaMAXLife Technologies35050-061
Pen/StrepLife Technologies15140148
β-MercaptoethanolLife Technologies21985-023
Metil viologeno dicloruro ( Sigma-Aldrich856177
Dimetil solfossido Hybri-MAXSigma-AldrichD2650
EmbryoMAX 0,1% gelatinaEMD MilliporeES006B
DPBS/HyCloneSH30028,02
0,25% Trypsin-EDTALife Technologies25200-056
T25 FlaskCorning353108
Pallone T75Piastra Corning353135
100 mmPiastra Corning353003
150 mmPiastra Corning430599
96 pozzettiCorning3585
Piastra con fondo a U a 96 pozzettiCorning3799
Piastra a 24 pozzettiCorning3526
Serbatoio da 50 ml Corning4870
Provette da 15 mlVWR International, LLC82050-276
Fibroblasti embrionali primari di topoEMD MilliporePMEF-NL
DR4 Fibroblasti embrionali di topoCellule staminali applicateASF-1001
Mitomicina CFisher BioReagents 
Geneticin (G418)Life Technologies11811-023
DoxiciclinaFisher BioReagents 
CryotubesThermo Scientific377267
Centrifuga EppendorfCentrifuge 5702
TC10 contatore di celluleBio-Rad
Counting Slides (per TC10)Bio-Rad1450011
Electroporation
Gene Pulser XcellBio-Rad1652611
Gene Pulser Cuvette (4  mm gap)Bio-Rad1652088
Molecular Biology
Thermal CyclerEppendorfMastercylcer ep Gradient  S
Puregene Kit di base BQiagen158745
Kit di clonazione Topo-TALife Technologies 450030
Kit di sintesi di cDNA ad alta capacitàApplied Biosystems4368814
NaClFisher BioReagents BP358-212
100% etanoloDecon Laboratories, Inc.2716
Acqua di coltura tissutale a doppio trattamentoSigma-AldrichW3500
Sau3A1New England BioLabsR0169L
T4 DNA LigasiNew England BioLabsM0202T
EcoRVNew England BioLabsR3195S
96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992)
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Acido cloridrico FisherBioReagents A144-212
EDTASigma-AldrichE5134
N-Lauroilsarcosina sale sodicoSigma-AldrichL5777
Proteinasi-KFisher BioReagents BP1700
Elettroforesi
Mini-Sub Cell GTBio-Rad170-4469EDU
LE Agarose GeneMateE3120500
Bromuro di etidio Fisher BioReagenti BP1302
Scala DNA 100 BPNew England BioLabsN3231S
Scala DNA da 1 KbEngland BioLabsN3232S
Scala DNA a 2 logNew England BioLabsN3200L
SCGPU05RE modificato BP25312BP26531 New

Riferimenti

  1. Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
  2. Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
  3. Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
  4. Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
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  6. Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
  7. Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
  8. Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
  9. Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310(2014).
  10. Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
  11. Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
  12. Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
  13. Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20(2004).
  14. Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).

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