Microelettrodo guidata impianto di elettrodi nel subtalamico Nucleo di Ratti per lungo termine stimolazione cerebrale profonda

Sommario

Viene descritto un metodo per impiantare elettrodi nel nucleo subtalamico (STN) dei ratti. Una migliore localizzazione dell'STN è stata ottenuta utilizzando un sistema di microregistrazione. Inoltre, viene presentato un set-up di stimolazione caratterizzato da connessioni di lunga durata tra la testa dell'animale e lo stimolatore.

Abstract

La stimolazione cerebrale profonda (DBS) è una terapia ampiamente utilizzato ed efficace per diversi disturbi neurologici, come la malattia di Parkinson idiopatica, distonia o tremori. DBS si basa sulla fornitura di stimoli elettrici specifici profonde strutture anatomiche del sistema nervoso centrale. Tuttavia, i meccanismi alla base l'effetto di DBS rimangono enigmatici. Ciò ha portato ad un interesse per investigare l'impatto di DBS in modelli animali, specialmente nei ratti. Come DBS è una terapia a lungo termine, la ricerca deve essere incentrata sui cambiamenti molecolari, genetiche di circuiti neurali che si verificano diverse settimane dopo DBS. A lungo termine DBS nei ratti è impegnativo, perché i ratti muovono nella loro gabbia, che causa problemi a mantenere in posizione il filo conduttore dalla testa dell'animale allo stimolatore. Inoltre, strutture bersaglio per stimolazione nel cervello di ratto sono piccole e quindi elettrodi non possono essere facilmente inseriti nella posizione desiderata. Così, un set-up di lunga durata stimolizione di ratti con elettrodi di platino / iridio con un'impedenza di circa 1 MW è stato sviluppato per questo studio. Un elettrodo con queste specifiche permette non solo la stimolazione adeguata, ma anche la registrazione delle strutture cerebrali profonde per identificare l'area di destinazione per DBS. Nel nostro set-up, un elettrodo con una presa per il cavo è stato incorporato in cemento dentale con quattro viti di ancoraggio fissati sul cranio. Il filo dalla spina allo stimolatore era protetta da una molla in acciaio inox. Un girevole è collegato al circuito di impedire il filo di aggrovigliarsi. In generale, questa stimolazione set-up offre un elevato grado di mobilità libera per ratto e permette la spina testa, così come il collegamento del filo tra la spina e lo stimolatore, di mantenere la forza di lunga durata.

Introduzione

La stimolazione cerebrale profonda (DBS) è un trattamento basato sulla fornitura di impulsi elettrici tramite elettrodi impiantati a specifiche strutture cerebrali, come il globo pallido interno ^1, nucleo subtalamico (STN) ^{2 - 4} o ventrale talamo ^intermedia 5. Negli ultimi due decenni, questo trattamento è stato stabilito come un potente strumento terapeutico per la malattia di Parkinson, ^1-4, distonia ⁶ e tremori ^7, e viene usato anche per modulare il dolore cronico ^7, disturbi psichiatrici (ad esempio, disturbo ossessivo-compulsivo ^8, depressione maggiore ⁹⁾ o epilessia intrattabile ^10,11. Inoltre, DBS potrebbe, in futuro, diventare una opzione di trattamento per l'ipertensione arteriosa refrattaria ^{12 o} ipotensione ortostatica ^13.

I meccanismi fisiologici alla base degli effettidi DBS rimanere poco conosciuta. Studi in roditori anestetizzati hanno fornito spaccato risposte neurali alla stimolazione ad alta frequenza che riproducono clinicamente applicato DBS ^14. Tuttavia, questi studi non solo non hanno conferme comportamentale dell'effetto DBS ma anche provocare una notevole variabilità a seconda dei parametri di stimolazione applicata ^14.

Per studiare in modo più conciso gli effetti comportamentali e dei meccanismi alla base della DBS nei roditori cosciente, è necessaria una stimolazione di set-up che soddisfa i requisiti specifici. DBS è principalmente usato come una terapia a lungo termine (ad esempio, il morbo di Parkinson, il dolore cronico). Così, la stimolazione set-up in roditori dovrebbe essere progettato in modo che il gruppo è costituito da un elettrodo con un tappo, così come un filo dalla spina di uno stimolatore esterno; e questa unità deve essere leggero ma infrangibile quando fissato sul cranio. Inoltre, la libertà di movimento è indispensabile per i ratti durante stimolizione per un periodo prolungato. Le strutture di destinazione della DBS sono piccole; per esempio, il STN in ratti ha una lunghezza di 1,2 mm ed un volume di 0,8 mm ^3,15. Pertanto, gli elettrodi devono essere progettati in modo tale che il nucleo non è lesionato durante l'inserimento e il targeting esigenze per essere precisi. Come la maggior parte degli studi condotti in roditori DBS hanno usato punto di riferimento basato inserimento stereotassica dell'elettrodo alla struttura di destinazione, il tasso di errore può essere relativamente alto, anche quando si utilizza le coordinate secondo Paxinos e Watson ^16. Ciò si traduce in un maggior numero di animali necessari per raggiungere un risultato statisticamente significativo.

Nel presente studio una tecnica di impianto dell'elettrodo viene introdotta, che rivolge la STN con elevata precisione utilizzando un sistema microrecording mentre avanza l'elettrodo. Inoltre, un sistema di stimolazione viene presentato che non solo consente un elevato grado di mobilità per l'animale stimolata ma garantisce anche stimulati continuain via fissaggio sicuro del filo stimolazione (che è protetto da una molla in acciaio inossidabile) sulla testa del ratto.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Università di Würzburg e le autorità statali legali (Bassa Franconia, numero di omologazione: 54-2531.01-102 / 13) ed eseguita secondo le raccomandazioni per la ricerca in corsa sperimentale studia ¹⁷ e la corrente di Test sugli animali: Segnalazione di In Vivo Linee guida Esperimenti (http://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Anestesia

1. Controllare il sistema anestetico per assicurare un'adeguata quantità di gas di alimentazione (ossigeno) e isoflurano per la durata della procedura. Collegare il musetto con la barra incisivo dello strumento stereotassico e posizionare la barra incisivo su -3.3 mm.
2. Accendere il gas di alimentazione (2 L / min). Posizionare il ratto in una scatola e sigillare la parte superiore. Accendere il vaporizzatore isoflurano al 3,5%.
3. Quando il ratto è reclinata, commutare il sistema in modo che il gas anestetico fluisce al nosecone che è fissato alla barra degli incisivi.
4. Rimuovere rat dalla camera scatola e radere l'area tra le orecchie e gli occhi; utilizzando un batuffolo di cotone imbevuto di Jodosept PVP, tamponare la zona rasata per rimuovere tutti i capelli sciolti.
5. Posizionare il topo nel nosecone (Figura 1) e continuare l'anestesia con isoflurano 2,5% in O ₂ (1 L / min). Controllare il livello di anestesia pizzicando l'area interdigitale. Se il ratto è anestetizzato in modo adeguato, i riflessi difensivi sono aboliti (cioè il ritiro del piede).
6. Monitorare la respirazione e risposta alla stimolazione durante la procedura e regolare il vaporizzatore secondo necessità.
7. Applicare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Monitorare e mantenere la temperatura corporea a 37 ± 0,5 ° C da un sistema di riscaldamento di feedback controllato.

2. Chirurgia

1. Mantenere il campo chirurgico sterile durante tutta la chirurgia. Una volta che le mani surgeon's sono sterili e il campo operatorio è sterile, solo spostare carefully e ricordarsi di non rompere la sterilità. Questo implica anche un campo sterile (ad esempio, tende impermeabili sterili) su cui si può posare strumenti.
2. Iniettare 0,2 ml mepivacaina sottocutanea nel centro dell'area rasata. Mepivacaine è un anestetico locale che ha una durata di azione di fino a 3 ore. Sarà anestetizzare ulteriormente la zona chirurgica.
3. Usando un bisturi, fare una incisione mediana di partenza tra le orecchie e si estende verso 2 cm. Assicurarsi che il periostio (membrana lucida sotto la pelle) è anche inciso. Esporre il cranio con quattro pinze (Figura 2).
4. Usando un batuffolo di cotone, rimuovere delicatamente il periostio fino a quando le suture coronali e sagittali sono esposti; da allora in poi, fermare il sangue con un batuffolo di cotone.
5. Determinare le coordinate del bregma utilizzando un ago fissato ad un supporto sonda, e segnare la punta dell'ago con un pennarello nero. Utilizzando l'anteriore / posteriore (AP), linea mediana / laterali(ML) e le viti dorsoventrale (DV) di unità, posizionare la punta dell'ago direttamente sopra il bregma.
6. Prendere la AP e ML letture nonio: sottrarre 3,6 millimetri dalla lettura di AP e 2,5 mm dalla lettura ML per impianto di elettrodi nel STN destra, o aggiungere 2,5 millimetri per impianto di elettrodi nel STN sinistra. Questa posizione sarà caratterizzata dal colorante del pennarello dopo abbassando la punta dell'ago alla superficie del cranio.
7. Fissare il trapano dentistico sul grande porta sonda dello strumento stereotassico. Spostare il trapano dentale all'area calcolata - cioè, il punto marcato sul cranio. Guardando attraverso il microscopio, un foro (diametro circa 1 mm) attraverso il cranio finché la dura è visibile (cranio è spesso circa 1 mm). Ritrarre la dura con pinze micro-dissezione o un ago sterile. La dura è abbastanza resistente per distruggere la punta dell'elettrodo.
8. Praticare un foro con il trapano dentale in ogni squama frontale e nella interparietal squama fronte al foro dell'elettrodo. Scollegare il supporto della sonda dallo strumento stereotassico. Non trapanare su una sutura cranio vasi venosi seguono le suture sotto il cranio.
9. Avvitare una vite ossea in ciascuno dei cinque fori. Evitare di infilare le viti troppo in profondità. Per viti di acciaio inossidabile (M1.6), 2-3 giri della vite un'adeguata tenere la vite senza mettere pressione sul cervello. Il numero di giri dipende dal passo della vite. Bloccare il supporto sonda con l'elettrodo nel micromanipolatore (Figura 3).
10. Utilizzando le viti dell'unità AP, ML e DV, spostare il supporto della sonda con l'elettrodo fino a quando la punta è quasi a toccare il bregma. Nota le letture nonio AP, ML e DV al bregma. Quando le letture sono fatte, sollevare l'elettrodo di pochi millimetri per impedire l'elettrodo dal raschiare cranio durante il movimento. Per determinare le coordinate della posizione in cui l'elettrodo deve essere inserita inal foro, aggiungere 3,6 mm alla lettura AP e aggiungere (o sottrarre) 2,5 mm alla lettura ML.
11. Utilizzando le viti AP e azionamento ML, spostare l'elettrodo in posizione calcolata. A questo punto, la punta dell'elettrodo dovrebbe essere situato direttamente sopra il foro trapanato dell'elettrodo. Poi, guardando attraverso il microscopio, abbassare l'elettrodo al livello della dura (Figura 4). Questo livello serve come livello zero nella direzione DV. Successivamente, inserire delicatamente la punta dell'elettrodo nel cervello, cercando attraverso il microscopio.
12. Collegare il perno dell'elettrodo al connettore del sistema di registrazione. Mettere una gabbia di Faraday (o sostituirlo con un foglio di alluminio) su ratto nello strumento stereotassico (Figura 5). A terra lo strumento stereotassico con il contrappeso della stanza che si sta lavorando in.
13. Avviare il sistema di registrazione. Se disponibile, utilizzare anche un altoparlante per ottenere un segnale acustico di scarichi / pomate di singole unità durante advancing dell'elettrodo.
14. Lentamente inserire l'elettrodo nel cervello registrando l'attività elettrica durante l'avanzamento dell'elettrodo. Ad una profondità compresa tra 7,5 e 8,1 mm dalla dura madre, l'attività elettrica specifica del STN è generalmente rilevabili (Figura 6). L'attività tipica dei neuroni nel STN è caratterizzata da un schema di accensione irregolare e un alto tasso di fuoco (frequenza media: 40.9 ± 12.9 Hz) ^18.
15. Durante la registrazione, ridurre anestesia per quanto possibile (ad esempio, a 0.8-1.0%); animali anestetizzati basso mostrano attività cerebrale elettrica chiara.
16. Tampone distanza sangue o liquido cerebrospinale che è stato spostato alla superficie del cranio quando si abbassa l'elettrodo.
17. Mescolare una piccola quantità di cemento dentale e applicarlo intorno all'elettrodo ed intorno quattro dei cinque viti utilizzando una piccola spatola (Figura 7). Il quinto vite sarà utilizzato per fissare il cavo di terra della spina.
18. Staccare la spina elettrodo dal portaelettrodo e il connettore del sistema di registrazione all'atto della fissazione del cemento dentale.
19. Svitare la vite che non è stato fissato dal cemento dentale. Mettere il tappo sul perno dell'elettrodo. Fissare il cavo di terra della spina con la quinta vite (Figura 8).
20. Mescolare cemento dentale e applicarlo intorno al tappo. Come il cemento si ispessisce, plasmarlo intorno al tappo per formare un tappo. Evitare bordi taglienti del cemento dentale che possono danneggiare l'animale e rimuoverli durante l'indurimento (Figura 9A e B).
21. Sbrigliare bordi della ferita e chiudere con una sutura sul davanti e dietro il tappo. Disinfettare i bordi della ferita.
22. Collegare la spina testa per il filo che è fissato su un supporto girevole. Rimuovere il ratto dallo strumento stereotassico.
23. Applicare tramadolo (12,5 mg / kg, per via intraperitoneale) alla fine dell'intervento e poi una volta al giorno per 2-3 giorni. Mettere il topo in una gabbia pulita con thermasupporto l, fissare la girella su questa gabbia (Figura 10) e controllare con attenzione per 1 ora.
24. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.

3. Stimolazione

1. Determinare la resistenza nell'animale prima della stimolazione mediante un misuratore di impedenza.
2. Collegare la spina del girevole con un filo e le spine all'altra estremità del filo con la corrente di uscita e l'uscita per il cavo di massa dello stimolatore. Collegare lo stimolatore con un computer per programmare lo stimolatore.
3. Scegliere i parametri di stimolazione nel programma; per esempio, i parametri utilizzati nella malattia di Parkinson sono lunghezza dell'impulso: 60 msec; Frequenza: 130 Hz. Stimolare il topo con una ampiezza della corrente crescente fino discinesia sono riconosciuti. Ridurre °e l'intensità elettrica del 10-20% al di sotto l'intensità che ha suscitato discinesia o fino a segni neurologici scompaiono e l'animale è confortevole. Impulsi rettangolari monofasici sono stati utilizzati in questo studio.
4. Dopo aver completato l'esperimento, l'eutanasia l'animale con isoflurano: Regolare il flusso isofurane o la concentrazione al 5% o superiore. Continuare esposizione isoflurano fino al 1 ° min dopo il respiro si ferma.

Risultati

Impiantare un elettrodo nel STN di un ratto utilizzando un sistema di registrazione - come presentato qui - è una procedura efficace e preciso per DBS che richiede circa 1 ora per animale. Questo modello è una procedura abbastanza minore: su 10 ratti sottoposti a intervento chirurgico, tutto sopravvissuti dell'intervento. Ventiquattro ore dopo l'intervento, lo stato di ciascun ratto è stato monitorato e nessun animale realizzato più di 1 di 3 punti in base al codice di gravità. Durante il periodo di continua stimolazion...

Discussione

Questo studio presenta una serie passo-passo di istruzioni per impiantare un elettrodo monopolare cronica nel STN di ratti. Sebbene elettrodi di tungsteno con bassa impedenza sono spesso utilizzati per DBS ^18,19, un elettrodo monopolare di platino / iridio (Pt / Ir) è stata impiegata che aveva un'impedenza di circa 1 MW. Elettrodi Pt / Ir sono utilizzati anche nei pazienti con malattia di Parkinson a causa delle loro proprietà favorevoli: dimostrano minima erosione ²⁰ e non producono dann...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Elettrodo Pt/Ir	FHC Inc.	UE	Su misura: Specifica: Spine UEPSEGSECN1M
	GT Labortechnik (Arnstein/Germania)		Connettore maschio su misura
	DISTRELEC	143-95-324	fila singola, 90° 1x3 datamate, Tipo M80-8420342
Presa	DISTRELEC	143-95-621	fila singola, dritta 2 mm polo n.1 x 3 datamate, Tipo M80-8400342
Molla in acciaio inox	Plastica ONE	SS0102	Parte-#: .120 X .156 ID molla (mm): 3.0  Diametro esterno molla (mm): 4.0
Cemento dentale/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	Liquido, 500 ml
Cemento dentale/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	Polvere, rosa, 500 g
Vite a testa	Hummer & Reiss	V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept PVP	Vetoquinol		435678/E04
Mepivacain 1%	AstraZeneca		PZN03338515
Epinefrina	Sanofi-Aventis		PZN00176118
Tramadolcloridrato	Rotexmedica		38449.00.00