Articolo metodologico

Determinazione Preferenze ultrasuoni vocalizzazione nei topi utilizzando un test di riproduzione a due scelta

DOI:

10.3791/53074

⸱

3 settembre 2015

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1School of Veterinary Medicine, Azabu University, 2Division of Electric and Information Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Kato Acoustics Consulting Office

In questo articolo

Sommario

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Le vocalizzazioni ultrasoniche (USV) nei topi differiscono a seconda dell'età, del sesso, della condizione e del background genetico. Utilizzando due emettitori di ultrasuoni che trasmettono simultaneamente in luoghi diversi, questo test a due scelte può valutare il riconoscimento murino e le risposte delle preferenze a diverse caratteristiche degli USV.

Abstract

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I topi emettono vocalizzazioni ultrasoniche (USV) durante una varietà di condizioni, come l'isolamento dei cuccioli e le interazioni sociali degli adulti. Questi USV differiscono per età, sesso, condizione e background genetico dell'animale emittente. Sebbene molti studi abbiano caratterizzato queste differenze, resta da chiarire se i topi riceventi siano in grado di discriminare tra USV oggettivamente diversi e mostrare preferenze per particolari tratti sonori. Per determinare se i topi possono discriminare tra le diverse caratteristiche degli USV, è stato recentemente sviluppato un esperimento di riproduzione, in cui le risposte di preferenza dei topi a due diversi USV potrebbero essere valutate sotto forma di preferenza di luogo.

Innanzitutto, sono stati registrati gli USV dei topi. Quindi, gli USV registrati sono stati modificati, tagliati di conseguenza ed esportati come file audio stereofonici. Successivamente, le ampiezze USV generate dai due emettitori di ultrasuoni utilizzati nell'esperimento sono state regolate allo stesso livello di pressione sonora. Gli emettitori termoacustici in silicio nanocristallino sono stati utilizzati per riprodurre gli USV. Infine, per studiare la preferenza dei topi soggetti rispetto agli USV selezionati, coppie di due diversi segnali USV sono state riprodotte simultaneamente in una scatola di test a due scelte. Entrando ripetutamente in una zona definita vicino a un emettitore di ultrasuoni e cercando la rete metallica davanti all'emettitore, il mouse rivela la sua preferenza per un suono rispetto a un altro. Questo modello consente di confrontare l'attrattiva delle varie caratteristiche degli USV di topo, in vari contesti.

Introduzione

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Molti animali usano vocalizzazioni per la comunicazione intraspecifica. Nel topo Mus musculus, uno importante tipo di segnale di comunicazione è vocalizzazioni ultrasoniche (USV), che hanno frequenze superiori a 20 kHz. USV emessi dai topi sono considerati una componente di riconoscimento sociale in maschio-femmina 1-4, femmina-femmina 1, 5, e maschio-maschio 1, 6 interazioni. USV vengono emessi anche da cuccioli quando sono isolate dalla loro madre, che aumenta il suo comportamento-pup recupero, e di conseguenza la sopravvivenza Pup 7. Anche se molti studi hanno analizzato e classificato USV del mouse 8, 9, le risposte comportamentali e meccanismi neurali dell'animale ricevente sono stati meno documentati 10, 11. Quest'ultimo è necessario per chiarire il significato biologico delle diverse caratteristiche di USV. Per rivelare questi meccanismi, l'esperimento di riproduzione è un metodo efficiente. Studi di riproduzione recenti hanno rivelato che femminilei topi sono attratti da USV 12, e che preferiscono USV da maschi che sono diversi dai loro genitori 13, 14.

Questo articolo spiega il test di riproduzione utilizzato per valutare USV preferenza nei topi. Una scatola test a due scelta è stata sviluppata in cui due USV differenti possono essere riprodotte contemporaneamente in due compartimenti di un contenitore di prova, come illustrato in Figura 1. Questo tipo di scatola di prova impedisce la contaminazione suono dividendo l'area di prova in tre sottocamere , con muri di piombo. Gli emettitori di ultrasuoni si trovano al di fuori di ogni stanza. Nel muro tra le camere e emettitori di ultrasuoni sono buchi coperti di rete metallica. Topi può muoversi liberamente nelle tre sale, e mostra una "ricerca della rete" comportamento, come se per rispondere a USV riprodotte dagli emettitori di ultrasuoni. In questo test, i topi soggiornare per periodi di durata diversa vicino a un emettitore sonoro o l'altro. Questi parametri possono essere registrati per ottenere un sensibile misu re di preferenza suono.

Per riprodurre i USV indietro, silicio nanocristallino emettitori termo-acustico (cioè, "emettitore nc-Si"), sono stati utilizzati come in studi precedenti 15-17. Questi dispositivi sono composti da un elettrodo a film sottile riscaldatore, uno strato di silicio poroso nano, e un wafer di silicio monocristallino. Il file audio digitale viene convertito in un segnale analogico e poi fatto passare attraverso l'elettrodo riscaldatore. Il dispositivo converte i segnali termici derivanti voltaggio-dipendenti in significativo di pressione sonora con bassa distorsione. Questo dispositivo è unico in quanto, a differenza di generatori di suoni comuni che dipendono da vibrazioni meccaniche, può riprodurre il suono senza la necessità di un diaframma. L'emettitore presenta un livello di pressione sonora piatta a frequenze da 20 a 160 kHz (figura 2), e può riprodurre USV murini digitalmente registrate molto accuratamente in termini di durata, frequenza e livello sonoro di pressione 15, 18, ​​19.

ve_content "> In un esperimento rappresentativo mostrato in Figura 3, C57BL / 6 (B6) femmine hanno permesso di scegliere tra BALB / c (BALB) USV maschi e rumore di fondo. Inoltre, la Figura 4 mostra la scelta delle femmine B6 e BALB tra riproduzioni USV simultanee da un topo BALB e un maschio B6, come riportato in un precedente studio 14. Le caratteristiche di USV maschili differiscono B6 e BALB ceppi 20. Come mostrato da questi risultati, l'attrattiva di USV può essere valutata con il presente protocollo, in cui i suoni sono registrati da un individuo dal vivo, acusticamente analizzati e riprodotti ad altri individui.

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Protocollo

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Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico di Azabu University. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in una camera insonorizzata.

1. Preparazione degli animali

  1. Maschi per la registrazione
    1. Ottenere topi maschi sessualmente maturi esperienza in accoppiamento.
  2. Soggetti di sesso femminile
    1. Ottenere vergine topi femmina che hanno ospitato da 2 a 5 fratellini per gabbia (di solito 8 - 12 settimane).
    2. Ottenere striscio vaginale giornaliero per determinare la fase del ciclo estrale prima della prova, secondo McLean 21. Si deve prestare attenzione a ridurre al minimo la stimolazione vaginale per evitare pseudogravidanza.
    3. Stain gli strisci con Giemsa, e determinare fase del ciclo estrale in base alla presenza o assenza di leucociti, cellule epiteliali cornified e cellule epiteliali nucleate, secondo Nelson 22.

2. Dispositivi (Figura 1)

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Figura 1. Schema del due scelta Box Test e dispositivi. I topi possono accedere sale A e B attraverso i piccoli cancelli situati tra loro e la zona neutra. La scatola due scelta e due emettitori ultrasuoni sono posti sul pavimento di una camera insonorizzata. Il microfono è sospeso all'interno della camera insonorizzata. Abbreviazione:. PC, personal computer Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
  1. Per la registrazione
    1. Collegare un microfono a condensatore ad ultrasuoni a un PC utilizzando un convertitore USB A / D.
    2. Impostare il livello di guadagno del convertitore A / D a "7".
    3. Dati acustici record in file di formato a 16 bit con una frequenza di campionamento di 400 kHz utilizzando il software di acquisizione audio.
  2. Per la riproduzione
    1. Collegare un convertitore D / A al PC utilizzandoun'interfaccia USB.
    2. Collegare due amplificatori per il convertitore D / A attraverso un attenuatore. (Quest'ultimo dispositivo serve per evitare sovraccarichi.)
    3. Collegare un emettitore ad ultrasuoni per ogni amplificatore.

3. USV registrazione

  1. Inserire un topo maschio in piccole (17 x 10 x 11 cm) o medie (21 x 14 x 13 cm) gabbia con un foro di 6 cm di diametro nella parete laterale e il foro coperto con una rete metallica 0,5 cm. Quando si usa una gabbia di medie dimensioni, realizzare una partizione attraverso il centro della gabbia per ridurre l'area.
  2. Non utilizzare biancheria da letto nella gabbia per evitare fruscii che possono contaminare le registrazioni.
  3. Collocare un microfono accanto alla mesh.
  4. Iniziare il monitoraggio ultrasuoni vocalizzazione con l'impostazione di registrazione mostrata al punto 2.1.
  5. Posizionare un sessualmente maturo topo femmina sia metestrus o diestrus nella gabbia con il topo maschio.
  6. USV record per 3-5 min.

4. Test Box

  1. Costruire la casella prova utilizzando bordo acrilico (Figura 1).
    Nota: La casella di prova (alta 35 x 20, e x 20 cm) è diviso in tre scomparti: una zona neutra (15 x 20 cm), e sale A e B (20 x 10 cm, ciascuno). Camere A e B hanno ciascuno un foro di 4 centimetri di diametro che è coperto con una rete metallica 0,5 centimetri. I fori e tele si trovano a ciascuna estremità del sale A e B. Fai cancelli (5 x 5 cm ciascuno) tra la zona neutra e camere A e B.
  2. Per evitare perdite suono isolare ciascun emettitore ultrasuoni, ad eccezione del lato rivolto verso la rete, utilizzando lastre in gomma, loro tenuta alla scatola intorno al perimetro di ciascuna maglia.
  3. Sigilli di piombo posto su entrambi i lati del muro tra le stanze A e B per l'isolamento acustico.

5. La preparazione per la riproduzione del suono

  1. Creazione di riproduzione Suoni
    1. Catturare un segmento di 20 secondi di USV dal file registrato utilizzando software di editing audio digitale.
    2. Selezionare e catturare sfondo noise (0.35 sec) dal file segmento 20 sec USV. Creare un file di rumore di fondo 20 sec ripetendo il segmento rumore.
    3. Per riprodurre i due file audio contemporaneamente, esportarli come un unico file audio stereo, con un file per il "orecchio sinistro" e l'altro file per il "orecchio destro."
    4. Filtrare i file audio utilizzando come filtro passa-alto con un taglio di 40 kHz.
    5. Ridurre il rumore utilizzando lo strumento di riduzione del rumore in software di post-elaborazione. Selezionare e catturare un segmento del file che contiene USV come il profilo di riduzione del rumore, ed eseguire la riduzione del rumore con il livello 40.
  2. Taratura di riproduzione Suoni
    1. Assicurarsi che lo spazio tra gli emettitori di ultrasuoni e il microfono è di 10 cm.
    2. Per calibrare i livelli di pressione sonora dagli emettitori di ultrasuoni, effettuare il monitoraggio ad ultrasuoni utilizzando la configurazione descritta al punto 2.1. Misurare il livello di pressione sonora dal microfono in decibel (dB).
    3. Using l'attenuatore e amplificatori, regolare il volume dei USV generati dai emettitori ultrasuoni allo stesso livello di pressione sonora come USV maschi registrate nel passaggio 3.
    4. Quando si utilizzano i due emettitori di ultrasuoni e un file audio composto da USV e rumore di fondo, verificare che i due emettitori di ultrasuoni presentano lo stesso livello di pressione sonora con un suono di calibrazione (per esempio, un tono puro 75-kHz) prima di eseguire il test comportamentale.
    5. Quando si riproduce un file audio composto da due flussi di USV, regolare i due livelli di pressione sonora generati allo stesso livello, prima del test.

6. Prova a due scelta

  1. Posizionare gli emettitori di ultrasuoni dietro le maglie della scatola della prova.
  2. Chiudere le porte di stanze A e B con un bordo acrilico, e abituare il soggetto femminile alla zona neutra per 30 min. Coprire la scatola con bordo acrilico per evitare che il mouse può sfuggire.
  3. Avviare la registrazione video utilizzando un CCFotocamera D montata sopra la casella. La telecamera (non mostrato in figura 1) comprende una superficie di tutte tre scomparti.
  4. Rimuovere il cancello e la copertura di bordo e lasciare la femmina di esplorare liberamente la casella di prova, comprese le zone sane.
  5. Una volta che la femmina ha indagato due maglie, ed è tornato alla zona neutra, avviare la riproduzione di un file audio di 20 secondi più volte per 5 o 10 minuti.
  6. Condurre il monitoraggio comportamentale per 5 o 10 minuti.
  7. Per ridurre stimoli olfattivi indesiderati depositati dal soggetto precedente, pulire le gabbie di prova tra le prove con il 70% di etanolo.
  8. Accendere il luogo di emettitori di ultrasuoni A e B in modo casuale al fine di evitare pregiudizi inerenti effetto lato verso le camere A o B.

7. Analisi statistica

  1. Utilizzando il software comportamentale evento-gol, l'analisi dei seguenti parametri: numero totale delle voci in ogni stanza; durata totale di permanenza in ogni zona mediana; durata totale di permanenza in ogni zona del suono; edurata totale di ricerca di ciascuna maglia davanti ultrasuoni emettitore. Figura 1 illustra ciò che si intende per "zona intermedia" e "zona suono."
    Nota: Nei casi in cui il mouse rimane sulla linea di separazione tra le due zone (figura 1, linea tratteggiata) decidere la posizione della direzione della testa. Quando la testa rivolta verso il lato della maglia, è segnato come permanenza nella zona di suono.
  2. Per ogni parametro comportamentale, confrontare le risposte per camere A e B con un Wilcoxon prova firmato-rank, o t -test in coppia con un livello di significatività di 0.05.

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Risultati

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I USV registrate da un topo BALB-maschio (161 sillabe per 20 sec), così come rumore di fondo sono stati utilizzati come riprodurre suoni nell'esperimento rappresentante illustrato nella figura 3. In questo esperimento, 7 topi B6 femminili sono stati usati a 9 settimane di età . Per determinare la migliore durata della prova della risposta femminile di riproduzione suoni, i parametri comportamentali sono state analizzate separatamente per i primi e gli ultimi cinque minuti del tempo di collaudo totale 10...

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Discussione

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Qui, i risultati di un test rappresentativo hanno mostrato che i topi femmina possono discriminare tra USV maschi artificiali e rumore di fondo (Figura 3). La conclusione che si può trarre da questi risultati è che il segnale di discriminazione si riflette nella durata della permanenza nella stanza e nella zona sonora, e nella durata della ricerca della rete nei primi 5 minuti di test, ma non nei secondi 5 minuti (Figura 3C, E e F). Questi dati indicano che i topi si abituano ai suoni di...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa-in-Aid per JSPS Fellows a AA; da sovvenzioni-in-Aid per la Ricerca Scientifica sulle zone innovative per JSP Fellows (n 4501 e n 25.132.712) di TK; e da una borsa di progetto di ricerca assegnato dalla Azabu University. figura 2 è ristampato da Kihara, T., Harada, T., e Koshida, N. Wafer-compatibile fabbricazione e le caratteristiche del silicio nanocristallino emettitori di ultrasuoni indotte termicamente. In: Sensori e Attuatori A: fisiche, volume 125, Elsevier, pag. 426, (2006), con il permesso di Elsevier.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Camera insonorizzataMuromachi Kikai
Gabbia piccolaCLEA JapanCL-0113-1
Gabbia centraleCLEA JapanCL-0103-1
Microfoni a condensatore ad ultrasuoniAvisoft BioacousticsCM16/CMPA
Convertitore A/DAvisoft BioacousticsUltraSoundGate116H
Audio softwareAvisoft BioacousticsRECORDER USGH
Adobe Audition 3.0 / Software di editing audioAdobeSystems Adobe Audition 3.0
Emettitore Nc-SiOriginalenon disponibile in commercio ma si prevede di esserlo nel prossimo futuro
Convertitore D/ANational InstrumentsNI USB-6251 BNC
AttenuatorOriginal
AmplificatoreYamatake
PCWindows 7 professionaleIntel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, sistema operativo a 64 bit
Registratore di eventi Excel-macro / Software di punteggiodi eventi originaleProgrammato da Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto
CCD Camera
Piastre di gomma (realizzate in resina elastomerica)Tokyo bouonTI-75BK B4Tagliarle alla misura corretta http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3
Giemsa's azur eosin metilene blue solutionMerck Millipore1.09204.0500

Riferimenti

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