Articolo metodologico

Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

DOI:

10.3791/53078

⸱

29 settembre 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospitals for Children-Boston

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La creazione di microtessuti funzionali all'interno di dispositivi microfluidici richiede la stabilizzazione dei fenotipi cellulari adattando le tecniche tradizionali di coltura cellulare alle limitate dimensioni spaziali dei microdispositivi. La modifica del collagene consente la deposizione strato per strato di assemblaggi di collagene ultrasottili in grado di stabilizzare le cellule primarie, come gli epatociti, come modelli di tessuto microfluidico.

Abstract

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Sebbene la microfluidica fornisca un controllo squisito del microambiente cellulare, la coltura di cellule all'interno di dispositivi microfluidici può essere challenging. 3D la coltura di cellule in gel di collagene di tipo I aiuta a stabilizzare la morfologia e la funzione cellulare, necessaria per la creazione di modelli di tessuto microfluidico nei microdispositivi. La traduzione delle tradizionali tecniche di coltura 3D per piastre di coltura tissutale in dispositivi microfluidici è spesso difficile a causa delle dimensioni limitate dei canali. In questo metodo, descriviamo una tecnica per modificare il collagene nativo di tipo I per generare soluzioni di collagene policationico e polianionico che possono essere utilizzate con la deposizione strato per strato per creare assemblaggi di collagene ultrasottili sopra le cellule coltivate in dispositivi microfluidici. Questi sottili strati di collagene stabilizzano la morfologia e la funzione cellulare, come dimostrato utilizzando gli epatociti primari come cellula di esempio, consentendo la coltura a lungo termine di microtessuti in dispositivi microfluidici.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sebbene la microfluidica consenta un controllo squisito del microambiente cellulare, la coltura di cellule, in particolare cellule primarie, all'interno di dispositivi microfluidici può essere impegnativa. Molte tecniche tradizionali di coltura cellulare sono state sviluppate per sostenere e stabilizzare la funzione cellulare quando vengono coltivate in piastre di coltura tissutale, ma tradurre tali tecniche in dispositivi microfluidici è spesso difficile.

Una di queste tecniche è la coltura di cellule sopra o inserite tra gel di collagene come modello dell'ambiente cellulare 3D fisiologico. 1 Il collagene di tipo I è una delle proteine più utilizzate per le applicazioni di biomateriali grazie alla sua ubiquità nella matrice extracellulare, all'abbondanza naturale, ai robusti siti di adesione cellulare e alla biocompatibilità. 2 Molte cellule beneficiano della coltura 3D con collagene, tra cui le cellule tumorali3,45, le cellule endoteliali microvascolari6 e gli epatociti7. Mentre l'uso di gel di collagene è facile in formati aperti, come le piastre di coltura tissutale, le dimensioni limitate del canale e la natura chiusa dei dispositivi microfluidici rendono l'uso di liquidi che gelificano senza bloccare l'intero canale.

Per superare questo problema, abbiamo combinato la tecnica di deposizione strato per strato8 con modifiche chimiche di soluzioni di collagene nativo per creare assemblaggi di collagene ultrasottili sopra le cellule coltivate in dispositivi microfluidici. Questi strati possono stabilizzare la morfologia e la funzione cellulare in modo simile ai gel di collagene e possono essere depositati sulle cellule in dispositivi microfluidici senza ostruire i canali con matrice polimerizzata. L'obiettivo di questo metodo è modificare il collagene nativo per creare soluzioni di collagene policationico e polianionico e stabilizzare le cellule in coltura microfluidica depositando sottili assemblaggi di matrice di collagene sulle cellule. Questa tecnica è stata utilizzata per stabilizzare la morfologia e la funzione degli epatociti primari in dispositivi microfluidici. 9

Sebbene la deposizione strato per strato sia stata precedentemente riportata con polielettroliti naturali e sintetici10 per coprire gli epatociti nella coltura su piastra11,12 e come strato di semina per gli epatociti nei dispositivi microfluidici13,14, questo metodo descrive la deposizione di uno strato di collagene puro sopra gli epatociti, imitando le tecniche di coltura del collagene 3D. In questo protocollo, utilizziamo gli epatociti come cellule di esempio che possono essere mantenute utilizzando strati di collagene 3D. I molti altri tipi di cellule che beneficiano della coltura 3D nel collagene possono allo stesso modo beneficiare della coltura dopo la deposizione strato per strato di un assemblaggio di matrice di collagene ultrasottile.

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Protocollo

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1. Preparazione della soluzione nativa Solubile Collagene

  1. Preparare o acquistare 200 mg di acidificato, solubile, collagene di tipo I da code di ratto a 1-3 mg / ml utilizzando i protocolli di isolamento standard, come riportato da Piez et al. 15
  2. Scalare la quantità di materiale di partenza in base al volume finale desiderato soluzioni collagene modificati. Circa fare 25-30 ml di metilato e 25-30 ml di soluzione di collagene succinilate, ciascuno a 3 mg / ml, da 200 mg di collagene nativo solubile.

2. Collagene metilazione

  1. Diluire 100 mg del, acidificata (pH 2-3) soluzione di collagene nativo ad una concentrazione di 0,5 mg / ml con ghiaccio acqua sterile fredda e mantenere la soluzione in ghiaccio per evitare la gelificazione.
  2. Regolare il pH della soluzione di collagene di 9-10 con poche gocce di NaOH 1 N e agitare a temperatura ambiente per 30 min. Osservare il precipitato collagene, causando la soluzione per diventare torbida.
  3. Spin giù la soluzione di collagene precipitato a 3.000 g per 25 min. Un chiaro, precipitato gelatinoso dovrebbe essere visibile nel fondo delle provette. Aspirare e smaltire il liquido surnatante.
  4. Risospendere il precipitato collagene in 200 ml di metanolo con HCl 0,1 N e lasciare che la reazione di metilazione di verifica con agitazione a temperatura ambiente per 4 giorni. Il collagene non si dissolvono, ma dovrebbe rompersi in pezzi molto piccoli visibili che renderanno la soluzione torbida.
  5. Dopo la metilazione, centrifugare la soluzione a 3.000 × g per 25 minuti per far sedimentare il collagene denaturato. Aspirare e smaltire il surnatante metanolo acidificato.
  6. Sciogliere il collagene metilata in 25 ml di PBS sterile, dando una concentrazione di circa 3 mg / ml, con pipettaggio ripetute, e filtrare la soluzione attraverso un colino cella di 60 micron. Regolare il pH della soluzione a 7,3-7,4 usando 20 ml incrementi di 1 N NaOH.
  7. Valutare la concentration della soluzione con un commerciale collagene topo kit ELISA o kit di analisi idrossiprolina. Diluire la soluzione di 3 mg / ml con PBS sterile.
  8. Sterilizzare la soluzione di collagene denaturato trasferendolo ad una bottiglia di vetro con tappo a vite, stratificazione accuratamente 3 ml di cloroformio sul fondo della bottiglia, consentono la bottiglia per impostare O / N a 4 ° C, e poi asetticamente rimuovere e conservare la strato superiore, che è il collagene denaturato.
  9. Conservare la soluzione a 4 ° C per l'uso entro 1 mese.

3. Il collagene succinilazione

  1. Diluire l'altra 100 mg del, acidificata (pH 2-3) soluzione di collagene nativo ad una concentrazione di 0,5 mg / ml con ghiaccio acqua sterile fredda e mantenere la soluzione in ghiaccio per evitare la gelificazione.
  2. Regolare il pH della soluzione di collagene di 9-10 con poche gocce di NaOH 1 N e agitare a temperatura ambiente per 30 min. Il collagene non precipitare, provocando la soluzione per diventare torbida.
  3. Sciogliere 40 mg di succinico anidride (0,4 mg per mg di collagene) in 10 ml di acetone (1/20 il volume della soluzione di collagene). Lentamente (in circa 0,5 ml incrementi) aggiungere il composto alla soluzione di collagene sotto agitazione mentre continuo monitoraggio del pH. Mantenere il pH superiori a 9,0 aggiungendo 1 o 2 gocce di NaOH 1 N come il pH si avvicina 9,0.
  4. Continua agitazione a temperatura ambiente per 120 minuti dopo l'aggiunta di tutti i anidride succinica in acetone. Osservare la soluzione a diventare chiaro come il collagene succinilata dissolve. Controllare periodicamente il pH per garantire che rimanga sopra 9,0.
  5. Regolare il pH della soluzione a 4,0 con 20 microlitri di 1 incrementi N HCl. Osservare la soluzione torbida di nuovo, come il collagene succinilata precipita.
  6. Dopo la succinilazione, centrifugare la soluzione a 3.000 × g per 25 minuti per far sedimentare il collagene succinilata. Aspirare e smaltire il surnatante acidificato con reagito anidride succinica.
  7. Sciogliere il collagene succinilatain 25 ml di PBS sterile, dando una concentrazione di circa 3 mg / ml, con pipettaggio ripetute, e filtrare la soluzione attraverso un colino cella di 60 micron. Regolare il pH della soluzione a 7,3-7,4 usando 20 ml incrementi di 1 N NaOH.
  8. Valutare la concentrazione della soluzione con un commerciale topo collagene kit ELISA o kit di analisi idrossiprolina. Diluire la soluzione di 3 mg / ml con PBS sterile.
  9. Sterilizzare la soluzione di collagene succinilata trasferendolo ad una bottiglia di vetro con tappo a vite, stratificazione accuratamente 3 ml di cloroformio sul fondo della bottiglia, consentono la bottiglia per impostare O / N a 4 ° C, e poi asetticamente rimuovere e conservare la strato superiore, che è il collagene succinilata.
  10. Conservare la soluzione a 4 ° C per l'uso entro 1 mese.

4. Verifica del collagene Modifiche

  1. Preparare 1 ml campioni da ciascuna delle soluzioni collagene nativo, metilato, e succinilate e diluire ad una concentration di 0,1 mg / ml con acqua pura sterile per ioni idrogeno titolazione. Diluire ulteriormente il buffer almeno 1.000 volte con la dialisi contro acqua attraverso un taglio di 10 kDa membraneusing 3 soluzione cambia per almeno 4 ore ciascuna.
  2. Aggiustare il pH delle soluzioni a 7.3 con piccole quantità di NaOH e HCl. Utilizzando pH 7,3 come riferimento arbitraria, eseguire ione idrogeno titolazione su ciascuno dei campioni come descritto da Tanford 16 per creare curve di titolazione per le soluzioni collagene nativo, metilato, e succinilata.
  3. Tracciare la variazione di pH per volume di acido aggiunto rispetto al numero di ioni per molecola H + bound. La gamma "amino" alto pH dovrebbe mostrare un cambiamento nel collagene succinilata verso il punto neutro (perdita di gruppi amminici), e il basso pH range "carbossile" dovrebbe mostrare uno spostamento verso sinistra del collagene denaturato (perdita di gruppi carbossilici ) e uno spostamento verso destra della collagene succinilata (un guadagno in gruppo carbossilicos), rispetto al collagene nativo.
  4. Valutare l'efficacia della reazione succinilazione determinando la% di gruppi amminici in collagene nativo sostituito da succinilazione utilizzando acido 2,4,6-trinitrobenzensulfonico (TNBA) metodo colorimetrico, seguendo protocolli standard 17,18.

5. Realizzazione di dispositivi Microfluidic e il seeding cellulare

  1. Realizzare dispositivi microfluidici utilizzando metodi standard di 9. Utilizzare replica stampaggio di PDMS da SU-8 master sul silicio definita utilizzando fotolitografia per creare microfluidica camere di coltura cellulare con 100 micron di altezza, 0,4-1,5 mm e 1-10 mm di lunghezza canali per la crescita delle cellule.
  2. Utilizzare un detergente plasma per ossidare le superfici del dispositivo e un vetrino, quindi premere insieme al legame. Dopo la sterilizzazione del dispositivo per esposizione a luce UV per almeno 30 minuti, riempire la camera con 50 ug / ml di fibronectina in PBS sterile e incubare a 37 ° C per 45 min.
  3. Inizializzare il dispositivo con le cellule, come ratto primaria o epatociti umani, che richiedono un gel di collagene per la stabilizzazione del fenotipo o stato di differenziazione. Usiamo 20 l di appena isolate di ratto primario epatociti 7,19 o disponibili in commercio crioconservati epatociti umani primari seminati a 14 × 10 6 cellule / ml al dispositivo.
  4. Permettono alle cellule di allegare per 4-6 ore, e poi lavare le cellule non attaccati e sostituiscono i terreni in piastra con i media di crescita. Incubare O / N a garantire cella piena diffusione e creare un monostrato confluente di cellule.

6. strato per strato deposizione di collagene

  1. In una cappa coltura tissutale flusso laminare, preparare volumi sufficienti di soluzioni collagene denaturato e succinilate per 10 applicazioni di ciascuna soluzione per dispositivo, nonché alcuni ml di media. Mantenere le soluzioni su ghiaccio. Usiamo 20 l (10-15 volte il volume totale del dispositivo) di collagene per strato per dispositivo.
  2. Esseresgranatura con la soluzione di metilato (policationico), si alternano gli scarichi dei dispositivi con 20 ml di metilato e poi succinilata soluzioni di collagene, in attesa 1 minuto tra ogni applicazione. Lavare il dispositivo per un totale di 10 volte al di soluzione, che dovrebbe durare circa 20 minuti. Lavorare velocemente per minimizzare la quantità di tempo le cellule sono prive di mezzi.
  3. Osservare collagene lentamente accumularsi in ingresso / uscita in funzione della sua dimensione. Se la resistenza al flusso fluido aumenta, a filo il dispositivo una o due volte con i media, e poi continuare stratificazione.
  4. Dopo aver applicato tutti gli strati, sciacquare il dispositivo due volte con mezzi freschi e ritornare alla incubatore. A seconda del tipo di cellula, i cambiamenti morfologici extracellulare dalla matrice, ad esempio maggiore polarizzazione in epatociti, dovrebbero essere visibili entro poche ore.
  5. Preparare dispositivi rappresentativi per microscopia elettronica a trasmissione utilizzando metodi standard 9 per verificare la presenza di una matrice di collagenemontaggio sulla parte superiore delle cellule in coltura.

7. Stabilizzazione del fenotipo delle cellule e funzione

  1. Immagine la morfologia cellulare, la vitalità, e la polarità utilizzando metodi standard per il tipo di cella. Per epatociti, raccogliere le immagini più di 14 giorni utilizzando la microscopia di fase, LIVE / colorazione MORTO per la vitalità, e CMFDA tintura per la polarizzazione apicale per dimostrare gli effetti della deposizione di collagene.
  2. Per morfologia cellulare, lavare il dispositivo attraverso l'ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per sciacquare, iniettare 20 ml di PBS, e l'immagine del dispositivo tramite microscopio a contrasto di fase.
  3. Per LIVE / colorazione MORTO, lavare il dispositivo attraverso l'ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per lavare, iniettare 20 ml di soluzione colorante LIVE / MORTO con DAPI preparati secondo le istruzioni del produttore, incubare per 30 minuti a 37 ° C, lavare il Dispositivo di nuovo con 20 ml di PBS, e l'immagine del dispositivo tramite microscopia a fluorescenza.
  4. Per bile canalicolorazione culi, lavare il dispositivo attraverso l'ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per sciacquare, iniettare 20 ml di 2 soluzione colorante mM CMFDA con DAPI preparati secondo le istruzioni del produttore, incubare per 30 minuti a 37 ° C, lavare il dispositivo di nuovo con 20 ml di PBS, e l'immagine del dispositivo usando la microscopia a fluorescenza.
  5. Raccogliere i media spesi e misurare prodotti metabolici cellulari in appositi punti di tempo per tutta la durata della cultura per determinare la funzione delle cellule. Per epatociti, misurare la quantità di albumina e urea nei media spesi.
  6. Effettuare analisi funzionali endpoint sulle cellule stesse, come la valutazione dei livelli degli enzimi di attività, colorazione degli anticorpi, o analisi di RNA. Per epatociti, indurre e misurare le attività enzimatici del citocromo P450 o di fase II coniugazione enzima glutatione S-transferasi.

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Risultati

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Collagene nativo può essere modificato con metilazione e succinilazione per creare soluzioni di collagene policationici e polianionici per l'uso in strato per strato di deposizione. Succinilazione modifica i gruppi ε-amino di collagene nativo con gruppi succinil e metilazione modifica i gruppi carbossilici di collagene nativo con un gruppo metilico (Figura 1A). Queste modifiche alle catene laterali di aminoacidi della proteina collagene alterano le curve di titolazione del pH per le soluzioni. Succinila...

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Discussione

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Ultrasottili assiemi collagene puro possono essere depositati su cellule caricate o superfici dei materiali utilizzando deposizione layer-by-layer di collageni modificati. I risultati di questo studio dimostrano che la metilazione e succinilazione di collagene nativo creare soluzioni collagene policationici e polianionici (Figura 1) che può essere utilizzato con la tecnica layer-by-layer depositare assiemi matrice di collagene ultrasottili sulle cellule (Figura 2) o altro addebitate sup...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health, tra cui una sovvenzione del consorzio di sistemi microfisiologici dal National Center for Advancing Translational Sciences (UH2TR000503), una borsa di studio post-dottorato Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F32DK098905 per WJM) e un premio pathway to independence (DK095984 per AB) dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
collagene di tipo I, coda di rattoLife TechnologiesA1048301opzione per collagene concentrato di coda di ratto
collagene di tipo I, coda di rattoSigma-AldrichC3867-1VLopzione per collagene concentrato di coda di ratto
collagene di tipo I, coda di rattoEMD Millipore08-115opzione per collagene concentrato di coda di ratto
collagene di tipo I, coda di rattoR%D Systems3440-100-01opzione per anidride
succinicaSigma-Aldrich239690-50Greagente di succinilazione
metanolo anidroSigma-Aldrich322415-100MLreagente di metilazione
idrossido di sodioSigma-AldrichS5881-500GReagente di precipitazione del pH
cloridricoSigma-Aldrich320331-500MLReagente per precipitazione del pH
collagene di ratto di tipo I ELISAChondrex6013opzione per rilevare il contenuto di collagene
kit di dosaggio dell'idrossiprolinaSigma-AldrichMAK008-1KTopzione per il rilevamento del contenuto di collagene
kit di dosaggio dell'idrossiprolinaQuickzyme BiosciencesQZBtotcol1opzione per il rilevamento del contenuto di collagene
concentrata di collagene di coda di ratto acido

Riferimenti

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  1. Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
  2. Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
  3. Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
  4. Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).
  5. Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).
  6. Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).
  7. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).
  8. Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
  9. McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).
  10. Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).
  11. Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).
  12. Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).
  13. Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).
  14. Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).
  15. Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).
  16. Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
  17. Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).
  18. Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).
  19. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).

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