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Articolo metodologico

Ponteggi composto di fibre di interfacce polielettrolita per rilascio controllato di Biomolecole temporalmente

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DOI:

10.3791/53079

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19 agosto 2015

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1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Mechanobiology Institute, Singapore, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

In questo articolo

Sommario

Gli scaffold per l'ingegneria tissutale devono ricapitolare il complesso microambiente biochimico e biofisico della nicchia cellulare. Qui, mostriamo l'uso di fibre interfacciali di complessazione polielettrolitica come piattaforma per creare scaffold polimerici compositi e multicomponente con rilascio biochimico sostenuto.

Abstract

Vari scaffold utilizzati nell'ingegneria tissutale richiedono un ambiente biochimico controllato per imitare la nicchia cellulare fisiologica. Le fibre interfacciali di complessazione polielettrolitica (IPC) possono essere utilizzate per la somministrazione controllata di vari agenti biologici come farmaci a piccole molecole, cellule, proteine e fattori di crescita. La semplicità della metodologia nella produzione di fibre IPC offre flessibilità nella sua applicazione per la somministrazione controllata di biomolecole. Qui, descriviamo un metodo per incorporare fibre IPC in due diversi scaffold polimerici, polisaccaride idrofilo e policaprolattone idrofobo, per creare uno scaffold composito multicomponente. Abbiamo dimostrato che le fibre di IPC possono essere facilmente incorporate in queste strutture polimeriche, migliorando la capacità di rilascio prolungato e una migliore conservazione delle biomolecole. Abbiamo anche creato un'impalcatura polimerica composita con segnali topografici e rilascio biochimico prolungato che può avere effetti sinergici sul comportamento cellulare. Gli scaffold polimerici compositi con fibre IPC rappresentano un metodo nuovo e semplice per ricreare la nicchia cellulare.

Introduzione

La matrice extracellulare ha segnali biochimici e biofisici intrinseci che dirigono i comportamenti cellulari. L'imitazione di questo microambiente fisiologico tridimensionale (3D) è una strategia ampiamente esplorata per la medicina rigenerativa e le applicazioni di ingegneria tissutale. Ad esempio, sia i substrati di origine naturale che quelli sintetici sono stati modificati con segnali topografici come mezzo per imitare l'ambiente cellulare biofisico. 1 Ad esempio, gli scaffold in policaprolattone (PCL) possono essere facilmente modellati mediante colata su substrati PDMS modellati. 2 Tuttavia, la maggior parte degli scaffold sintetici non riassume adeguatamente l'ambiente biochimico controllato in vivo. La modifica del volume o della superficie dei materiali sintetici presenta solo segnali biochimici per l'adesione cellulare, ma manca ancora di regolazione temporale del rilascio biochimico. 3 Pertanto, c'è bisogno di scaffold ottimali in grado di imitare il sistema di rilascio biochimico temporalmente regolato della matrice extracellulare.

I sistemi di consegna biochimica come le microsfere sono afflitti da problemi di perdita di bioattività e bassa efficienza di incorporazione a causa della gravità e della complessità del processo di sintesi a più fasi. 4-6 È stato dimostrato che i metodi alternativi che utilizzano un metodo di fabbricazione e incorporazione in un'unica fase hanno un eccellente potenziale per creare un microambiente biochimico favorevole senza l'inefficienza e la perdita di bioattività che ne derivano. Una soluzione praticabile è l'uso di fibre interfacciali di complessazione polielettrolitica (IPC) per veicolare e proteggere gli agenti biologici. Quando due soluzioni acquose di polielettrolita caricate in modo opposto vengono riunite, le fibre IPC possono essere estratte dall'interfaccia. Praticamente qualsiasi tipo di biomolecola idrofila in soluzione acquosa può essere aggiunta alla soluzione polielettrolitica caricata negativamente o positivamente, facilitando così l'incorporazione di biomolecole utili nella fibra IPC durante il processo di complessazione. Inoltre, questo processo richiede solo condizioni acquose e ambientali, riducendo così il rischio di perdita di bioattività. Utilizzando questo metodo, sono stati somministrati con successo fattori di crescita attivi2,7 ecellule pari 8,9. Inoltre, il semplice metodo di formatura delle fibre IPC consente lo stampaggio in qualsiasi forma o orientamento. La stabilità di tali fibre è stata vantaggiosa nella loro incorporazione sia in polimeri idrofobici2 che idrofili7 per creare scaffold compositi. Questi scaffold compositi con fibre IPC sono utili per creare un ambiente biochimico fisiologicamente rilevante, fornendo al contempo un ancoraggio fisico per le cellule.

In questo studio, mostriamo un metodo per incorporare fibre IPC in un'impalcatura idrofila e idrofobica con topografia per il rilascio controllato di biomolecole attive. Come prova di concetto, incorporiamo fibre IPC a base di chitosano e alginato nell'idrogel idrofilo pullulano-destrano biocompatibile, non immunogenico e non antigenico o nello scaffold idrofobico policaprolattone biocompatibile.

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Protocollo

1. Preparazione di polielettrolita Solutions

  1. Purificare chitosano, come dettagliato in Liao et al. Brevemente, creare un 1% (w / v) di chitosano a 2% (v / v) di acido acetico e filtro di vuoto usando grade 93 carta da filtro. Neutralizzare il filtrato utilizzando 5M NaOH fino a pH stabilizzato per 7. Centrifugare chitosano precipitato a 1.200 xg per 10 min. Decantare il surnatante e aggiungere acqua deionizzata per lavare il chitosano. Ripetere la fase di centrifugazione e lavaggio altre due volte. Congelare il chitosano precipitato a -80 ° C e lyophilize O / N avere la forma purificata. Conservare chitosano purificato in un armadio deumidificato.
  2. Pesare 1 g di chitosano purificato in un piatto di coltura tissutale sterili. Posizionare il chitosano nella cultura piatto tessuti più vicino possibile alla lampada UV nella cappa di sicurezza biologica ed esporre alla luce UV per 15 min. Utilizzando pinze sterili, collocare il chitosano sterilizzato in un contenitore di vetro. Sciogliere chitosano utilizzando filtrato 0.15M acido acetico ad una concentrazione finale compresa tra 0,5% e 1% (w / v).
  3. Pesare 0,1 g del sale sodico dell'acido alginico e sciogliere in 10 ml deionizzata (DDI) di acqua distillata per ottenere una soluzione all'1% (w / v). Mescolare il sale sodico dell'acido alginico per almeno 2 ore sul vortex per garantire la completa dissoluzione. Filtrare la soluzione di alginato attraverso 0,2 micron filtro siringa. Conservare la soluzione di alginato a 4 ° C.
  4. Ricostituire fattori umani ricombinanti crescita come fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) o beta - nerve growth factor (NGF), come raccomandato dal costruttore.

2. Disegno di fibre IPC

  1. Mescolare proteine, fattori di crescita o altre biomolecole in 10-20 microlitri aliquota della soluzione polielettrolita che ha una carica netta simile. Molecole biologiche con carica negativa (ad esempio albumina di siero bovino [ASC]) al netto deve essere miscelato con la soluzione di alginato. Molecole biologiche con carica positiva netta (ad esempio VEGF) devono essere mescolati consoluzione chitosano.
  2. Inserire piccole aliquote (10-20 mL) di chitosano e alginato su una superficie piana e stabile che è coperto con parafilm. Le goccioline di chitosano e alginato devono essere posti in prossimità ma non in contatto tra loro.
  3. Leggermente immergere ogni punta su un paio di pinze nelle chitosano e alginato goccioline. Portare le goccioline di polielettroliti insieme stringendo la pinza. Quando le goccioline entrano in contatto tra loro, tirare lentamente la pinza verticalmente verso l'alto per disegnare la fibra IPC dall'interfaccia delle due gocce (Figura 1A).
  4. Posizionare accuratamente l'estremità della fibra IPC disegnato sulla pinza su un collettore, ad esempio una matrice polimerica piatta apposto su un mandrino rotante (vedere la sezione 3 e 4). Ruotare il mandrino ad una velocità fissa di 10 mm / sec per permettere la formazione di uniforme e beadless fibre IPC. Aumentando la velocità di trarre le fibre IPC formeranno perline, che provocherà una raffica di rilascio incorporataterminazione fibra biochimica e prematura. 10
  5. Per determinare l'efficienza di incorporazione, raccogliere tutte le rimanenti liquidi lasciati sul parafilm diluendo con 500 ml di 1X tampone fosfato salino (PBS). Misurare la proteina o la crescita dei contenuti fattore residuo attraverso BCA assay (per BSA), ELISA (per VEGF e NGF) o un test appropriato per rilevare biomolecola incorporato.

3. Realizzazione di composito Hydrogel impalcatura di Pullulan-destrano (PD) polisaccaride e Fibre IPC

  1. Realizzazione telaio pullulan sacrificale per la raccolta fibra IPC
    1. Pesare polisaccaride pullulan e mescolare con deionizzata distillata (DDI) acqua per creare un 20% (w / v) in soluzione acquosa. Mescolare la soluzione pullulan O / N per assicurare l'omogeneità.
    2. Cast 15 g di soluzione di pullulano in un 10 centimetri coltura di tessuti diametro polistirene (TCPS) piatto. Asciugare la soluzione pullulan O / N a 37 ° C. Tagliare i film pullulano in 7mm x 7 mm cornici quadrate.
  2. Preparazione soluzione polisaccaride pullulano destrano
    1. Creazione di un 30% (w / v) di polisaccaridi pullulan e destrano (rapporto 3: 1) in acqua DDI. Mescolare O / N per assicurare l'omogeneità della soluzione polisaccaride. Aggiungere lentamente in bicarbonato di sodio alla soluzione di polisaccaride per ottenere una concentrazione finale del 20% (w / v). Mescolare O / N per assicurare l'omogeneità della soluzione. Conservare la soluzione polisaccaride a 4 ° C.
  3. Raccolta fibre IPC sul telaio pullulano
    1. Fissare il telaio pullulan sacrificale (punto 3.1) con un coccodrillo. Stick il coccodrillo e cornice pullulan sull'estremità del mandrino rotante con nastro adesivo plastificato. Ruotare il mandrino con il telaio affisso a una velocità costante di 10 mm / sec. Il telaio pullulan può essere apposto sul mandrino rotante orientamenti desiderati.
  4. Disegnare le fibre IPC con un paio di pinze (sezione 1) e attach fine disegnato delle fibre IPC sul telaio pullulan rotante. Disegnare le fibre IPC a velocità costante. Raggiunta l'estremità terminale della fibra IPC, asciugare il costrutto O fibre-on-frame / N a RT.
  5. Incorporare fibre IPC nel PD idrogel ponteggio
  6. Per reticolare ogni grammo di soluzione pullulan-destrano, aggiungere 100 ml di 11% (w / v) di sodio trimetafosfato soluzione acquosa e idrossido di sodio 10M 100 microlitri. 7 Mescolare la soluzione a 60 rpm con una stirplate per 1 a 2 min. Dopo l'aggiunta di trimetafosfato di sodio e idrossido di sodio, la soluzione polisaccaride sarà reticolare quasi immediatamente. Versare la soluzione polisaccaride viscosa sul costrutto fibre-on-frame da incorporare completamente le fibre IPC. Incubare le fibre pullulan-destrano-IPC combinate (PD-IPC) a 60 ° C per 30 minuti per formare un reticolato chimicamente scaffold compositi (Figura 1B).
  7. ATTENZIONE: Eseguire il punto 3.3.2 della cappa e il corretto utilizzo equi di protezionepment come acido acetico è un corrosivo e infiammabile.
  8. Per indurre la formazione di pori nella scaffold PD-IPC, immergere l'intera impalcatura nel 20% (w / v) di acido acetico per 20 min.
  9. Rimuovere i reagenti che non hanno reagito per lavaggio impalcature PD-IPC in 1X PBS per 5 minuti agitando a 100 rpm. Ripetere questa operazione 2 volte.
  10. Rimuovere l'eccesso di PBS e congelare immediatamente i ponteggi PD-IPC a -80 ° CO / N. Lyophilize i ponteggi, almeno 24 ore prima dell'utilizzo in qualsiasi rilascio o di bioattività dosaggi controllati.

4. Realizzazione di composito impalcatura di PCL e fibre IPC

ATTENZIONE: diclorometano è una sostanza pericolosa. Utilizzare la cappa e dispositivi di protezione personale quando si impiega diclorometano.

  1. Creazione incontaminate e fantasia PDMS substrati
    1. Creare un polidimetilsilossano incontaminato (PDMS) substrato elastomerico con un pezzo di TCPS di dimensione desiderata mediante processo di litografia soffice. Crea pattePDMS rned substrati utilizzando metodi litografiche soft di serie di poli (metilmetacrilato) modelli con la topografia desiderata. 12
  2. Realizzazione sacrificale telaio PCL per la raccolta fibra IPC
    1. Pesare PCL e sciogliere in diclorometano per creare un 0,9% (w / v). Per ogni 1 cm 2 superficie del substrato PDMS, goccia 500 ml di soluzione di PCL 0,9%. Consentire tutto il solvente diclorometano di evaporare completamente nella cappa. Ripetere il processo di colata 0,9% PCL per addensare il film fino allo spessore desiderato. Rimuovere la pellicola PCL essiccato dal substrato PDMS. Creare un foro nel telaio PCL utilizzando un perforatore di dimensioni adeguate. 2
  3. Raccolta fibre IPC sul telaio PCL
    1. Fissare il telaio PCL sacrificale con foro (da 4.2.1) in un coccodrillo. Attaccare il coccodrillo sul mandrino rotante utilizzando nastro adesivo plastificato. Collegare l'estremità tratto della fibra IPC sul fram PCLe prima di iniziare la rotazione ad una velocità costante di 10 mm / sec (sezione 2). Dopo la fine del IPC filatura della fibra, asciugare la fibra-on-frame costrutto O / N a 4 ° C.
  4. Incorporare fibra-on-frame costrutto in fantasia substrato PCL
    1. Cada 500 ml di soluzione di PCL 0,9% sul substrato PDMS di creare una base PCL incontaminata o fantasia, come richiesto. Cast strati multipli di soluzione PCL 0,9% per ottenere un ponteggio con lo spessore desiderato. Consentire tutto il solvente diclorometano di evaporare completamente nella cappa.
    2. Posizionare il costrutto fibra-on-frame (sezione 4.3.1) sulla parte superiore della base PCL. Aggiungere la soluzione PCL 0,9% sui più volte fibra-on-frame costruire per ottenere lo spessore desiderato e incorporare completamente le fibre IPC, fabbricare un ponteggio composita PCL-IPC (Figura 1C).

5. Misura di emissione di agenti biologici da Composite IPC Ponteggi

  1. Mettere in composito PD-IPC oImpalcature PCL-IPC e stand-alone fibre IPC separatamente in una piastra da 24 pozzetti.
  2. Immergere il patibolo e stand-alone fibre IPC con 500 ml di PBS 1X. Incubare i campioni a 37 ° C. Raccogliere PBS in vari momenti (Comunicato stampa) e sostituirlo con 500 ml di PBS 1X.
  3. Misurare la quantità di proteine ​​o di fattore di crescita nei mezzi di rilascio utilizzando un saggio BCA (BSA), ELISA (VEGF e NGF) o altri test appropriato calcolare il profilo di rilascio cumulativo per la biomolecola incorporato.

6. Semina di Celle compositi IPC Ponteggi testare bioattività di agenti biologici Usciti

  1. Sterilizzare i liofilizzati PD-IPC o PCL-IPC ponteggi compositi usando la luce UV nella cappa di sicurezza biologica per almeno 20 minuti.
  2. Utilizzare tecniche standard di coltura cellulare per ottenere una sospensione di cellule di 2 x 10 5 cellule in 200 microlitri terreni di crescita. Seme la sospensione cellulare concentrata sulle impalcature compositi. After 20 min, top-up il volume di terreni di crescita per immergere completamente i ponteggi.
  3. Misurare l'attività delle cellule attraverso tecniche standard quali Alamar blu metabolico attività di analisi, PC12 neurite saggio escrescenza o immunofluorescenza.

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Risultati

In questo articolo, abbiamo cercato di creare impalcature compositi con fibre IPC per il rilascio prolungato di diverse biomolecole. Caratteristiche delle biomolecole utilizzati in questo studio sono presentati nella tabella 1. Fibre IPC sono stati incorporati in un PD idrogel idrofila per creare un'impalcatura composita PD-IPC (Figura 1B). Modello molecola BSA è stata testata prima di determinare la possibilità di utilizzare un ponteggio in composito per il rilascio controllato bio...

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Discussione

Fibre IPC sono formate dall'interazione di due polielettroliti carica opposta. Il processo utilizza l'estrazione del complesso dall'interfaccia dei polielettroliti, facilitando il processo di auto-assemblaggio di fibra formazione stabile. Il meccanismo di formazione della fibra IPC garantisce che qualsiasi biomolecola aggiunto nella polielettroliti con carica simile può essere incorporato durante il processo di complessazione. 10,11 contrario, l'aggiunta di una biomolecola nel polielettrolita ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale delle Ricerche Singapore amministrata da uno dei suoi Centri di Ricerca di eccellenza, l'Istituto mechanobiology, Singapore. MFAC è sostenuta dall'Agenzia per la Scienza, Tecnologia e Ricerca (Singapore) e l'Agenzia Nazionale per la Ricerca (Francia) programma comune con il numero 1122703037. BKKT progetto è sostenuto dall'Istituto mechanobiology. Ringraziamo il Sig Daniel HC Wong per il manoscritto e la signora Alba JH Neo per contribuire alla realizzazione di video di lettura a prova di.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pullulan Hayashibara Inc, Okayama, Giappone, Peso molecolare (MW): 200 kDa. Questo materiale è il pullulan di grado farmaceutico utilizzato per realizzare telai pullulan e scaffold PD-IPC.
destranoSigma AldrichD1037MW 500 kDa. Questo materiale non viene più prodotto da Sigma Aldrich. L'alternativa suggerita è il numero di catalogo 31392 (Sigma Aldrich). Questo materiale viene utilizzato per realizzare scaffold PD-IPC.
Bicarbonato di sodio SigmaAldrich S5761deve essere aggiunto lentamente alla soluzione polisaccaridica pullulano-destrano. L'aggiunta rapida di bicarbonato di sodio provocherà precipitazioni.
Trimetafosfato di sodioSigma AldrichT5508Questa sostanza chimica è igroscopica e deve essere conservata nell'armadio di deumidificazione. La soluzione acquosa di trimetafosfato di sodio deve essere sempre fresca.
Idrossido di sodioSigma AldrichS5881Questo materiale è pericoloso e deve essere maneggiato con dispositivi di protezione adeguati come guanti in nitrile.
ChitosanSigma Aldrich448877MW 190-310 kDa. Grado di acetilazione dal 75% all'85%. La purificazione del chitosano è necessaria per creare fibre IPC stabili.
Acido aceticoMerckQuesto può essere sostituito da un altro tipo di marca. Questo materiale è corrosivo e infiammabile. Quando si maneggia questa sostanza chimica nella cappa aspirante, è necessario indossare dispositivi di protezione come visiera, guanti in nitrile, camice da laboratorio e copriscarpe.
Acido alginico sale sodico da alghe brune, bassa viscositàSigma AldrichA2158Sciogliere in acqua per una notte. Filtra attraverso sterile 0,2  µ m filtro siringa prima dell'uso. Conservare a 4 °C.
Reagentedell'albumina sinopharm del siero bovinoSciogliere in PBS sterile e filtrare utilizzando 0,2 µ m filtro siringa prima dell'uso. 
Kit di analisi BCAPierce23225Questo kit è stato utilizzato per misurare il rilascio di BSA dagli scaffold PD-IPC.
Fattore di crescita endoteliale vascolare ricombinante umanoR& Sistemi D293-VESciogliere il fattore di crescita in una soluzione di eparina allo 0,2% ad una concentrazione finale di 5  mg/ml.
Sale sodico di eparina da suinoSigma AldrichH3393Questo può essere sostituito da un altro tipo di marca. Sciogliere il sale di eparina in acqua sterile ad una concentrazione finale dell'1% e filtrare attraverso 0,2µ m filtro siringa prima dell'uso. 
Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)LonzaC2517AQuesto tipo di cellula primaria è stato utilizzato nel test per determinare la bioattività del VEGF dopo il rilascio da scaffold PD-IPC.
Alamar blueLife TechnologiesDAL1025Viene utilizzato per misurare l'attività metabolica cellulare. Incubare il blu di Alamar con le cellule e mantenerlo in condizioni standard di coltura cellulare per 2-4 ore. Misurare l'assorbanza a 570 nm per determinare la percentuale di riduzione del blu Alamar, che è correlata all'attività cellulare.
Liofilizzatore ScanVac CoolsafeLabogene7.001.200.060Si tratta di un liofilizzatore non programmabile che funziona da -105 a -110  °C. Questo può essere sostituito da altri liofilizzatori da laboratorio standard.
Policaprolattone (PCL)Sigma Aldrich181609MW 65 kDa. Questo non è più prodotto da Sigma Aldrich. Questo può essere sostituito dal numero di catalogo Sigma Aldrich 704105.
DiclorometanoSigma AldrichV800151Questo può essere sostituito da un altro tipo di marca. Questo materiale è pericoloso e deve essere maneggiato nella cappa aspirante. I dispositivi di protezione devono essere indossati in ogni momento quando si maneggia questa sostanza chimica.
Polidimetilsilossano (PDMS; kit di elastomeri siliconici 184)Dow Corning(240)4019862Il kit di elastomeri viene fornito con base polimerica e reticolante. Mescolando la base polimerica e il reticolante in rapporti diversi si otterrà una diversa rigidità del PDMS.
Fattore di crescita beta-nervoso ricombinante umano (NGF)R& Sistemi D256-GFRicostituito in acqua deionizzata sterile ad una concentrazione finale di 100  µ g⁠/⁠ml. Aliquotare e conservare in -20 ° C fino all'uso.
Cellule staminali mesenchimali umane (hMSC)CambrexQuesto tipo di cellula è stato utilizzato nel test per determinare l'effetto sinergico dell'NGF e della nanotopografia.
Cellule di feocromocitoma PC12 di ratto ATCCQuesto tipo di cellula è stato utilizzato nel saggio di crescita dei neuriti per determinare la bioattività dell'NGF. Dopo l'esposizione al terreno di rilascio con NGF, misurare il numero di cellule con estensioni neuritiche e normalizzare al numero totale di cellule.
Carta da filtro grado 93WhatmanZ699675Viene utilizzata per la purificazione del chitosano dopo la sua precipitazione con idrossido di sodio a pH 7.
Centrifuga a secchiello oscillanteEppendorf5810RDa utilizzare durante la purificazione del chitosano utilizzando una velocità di 1.200 x g.
Motore con mandrino rotante a velocità costanteRhymebusRM5EIl motore viene utilizzato per la fabbricazione di fibre IPC su telaio pullulan o PCL.
Soluzione salina tamponata con fosfatoFirstBaseSterilize per filtrazione (0,2 & micro; m filtro) e autoclave.
Piatto di polistirene per colture tissutali di 10 mm di diametro (TCPS)GreinerIl piatto TCPS viene utilizzato per la colata del telaio in pullulano.
Kit ELISA VEGF umanoR& D systemsDVE00Il kit ELISA viene utilizzato per il rilevamento di VEGF nel mezzo di rilascio.
Kit ELISA NGF umanoR& D systemsDY256Il kit ELISA viene utilizzato per il rilevamento di NGF nel mezzo di rilascio.
Nastro adesivo plastificatoBel-Art9040336Il nastro adesivo viene utilizzato per attaccare saldamente la clip a coccodrillo al mandrino rotante
Il bicarbonato di sodio chimico

Riferimenti

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