Il seguente protocollo descrive la procedura per assemblare colture simili a sandwich da utilizzare come stadio intermedio tra ambienti cellulari bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D). I sistemi ingegnerizzati possono avere applicazioni in microscopia, biomeccanica, biochimica e saggi di biologia cellulare.
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Articolo metodologico
Microambienti sandwich di sfruttare Cellulari / Materiale Interazioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Colture cellulari è stata tradizionalmente effettuata su substrati bi-dimensionali (2D) in cui le cellule aderiscono con recettori ventrali alla superficie biomateriale. Tuttavia in vivo, la maggior parte delle cellule sono completamente circondati dalla matrice extracellulare (ECM), risultando in un tridimensionale (3D) distribuzione dei recettori. Questo può innescare differenze nella outside-in vie di segnalazione e quindi nel comportamento delle cellule.
Questo articolo dimostra che la stimolazione dei recettori dorsali di cellule già aderito ad un substrato 2D sovrapponendo una pellicola di un nuovo materiale (una coltura a sandwich) innesca modifiche importanti rispetto a culture 2D standard. Inoltre, l'eccitazione contemporanea dei recettori ventrale e dorsale sposta comportamento delle cellule più vicina a quella che si trova in ambienti 3D. Inoltre, a causa della natura del sistema, una cultura sandwich è uno strumento versatile che permette lo studio di diversi parametri di cella / materiale interactions, ad esempio, la topografia, la rigidità e diversi rivestimenti di proteine su entrambi i lati ventrale e dorsale. Infine, dal momento che le culture sandwich si basano su substrati 2D, diverse procedure di analisi già sviluppati per le culture 2D standard, può essere utilizzato normalmente, superando le procedure più complesse necessarie per i sistemi 3D.
Introduzione
Tradizionalmente, coltura cellulare è stata effettuata su (2D) substrati bi-dimensionali, anche se la maggior parte dei microambienti cellulari in vivo hanno un (3D) natura tridimensionale. Questo ambiente 2D innaturale provoca cambiamenti nel comportamento delle cellule, come un modo di auto-adattamento ad un mondo piatto, che influenza direttamente il destino della cellula 1,2. Pertanto, i risultati ottenuti su colture cellulari 2D non sono sempre riproducibili in vivo. Ciò ha favorito lo sviluppo di nuovi sistemi di coltura interessati cercano di fornire condizioni più fisiologiche simili per ottenere ulteriori approfondimenti qualsias....
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Protocollo
1. Produzione di dorsali Substrati
- Produzione di un film piano di PLLA per colata solvente.
- Lavorare in una cappa aspirante per preparare una soluzione di 2% (w / v) PLLA in cloroformio (2 g PLLA in 100 ml di cloroformio) agitando a temperatura ambiente (RT) fino a completa dissoluzione (3 ore circa).
- Mettere le rondelle su una piastra di Petri di vetro.
Nota: Usare rondelle in acciaio inossidabile con un diametro interno di 10,5 mm (leggermente inferiore al diametro del campione ventrale) in modo che la rondella è posto sulla parte superiore del substrato ventrale. Altri materiali quali politetrafluoroetilene (PTFE) o lavabicchie....
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Risultati
La stimolazione dei recettori dorsali all'interno della cultura sandwich innesca cambiamenti nella morfologia cellulare, adesione cellulare e vie di segnalazione intracellulare (ad es chinasi di adesione focale, FAK) 10-12. Come esempio, colture di fibroblasti nel sistema sandwich overexpressed la α 5 integrina subunità rispetto al 2D, come osservato per altre culture 3D 15,16.
Destino cellulare è strettamente dipendente dal tempo in cui i recett.......
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Discussione
Al giorno d'oggi, la cultura 3D è un tema importante per l'industria farmaceutica e biotecnologica, nonché la ricerca in biologia cellulare, tra cui il cancro e le cellule staminali. Di conseguenza sono stati sviluppati diversi sistemi di coltura 3D. Purtroppo, le differenze tra i sistemi 3D di solito determinano il comportamento cellulare diverso, ostacolando la comprensione del destino delle cellule. Inoltre, le procedure sperimentali di solito non sono così semplice come per sistemi di coltura 2D. Quindi lo s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il supporto di ERC attraverso HealInSynergy (306990) e il programma FPU AP2009-3626 sono riconosciuti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Stratagemma (acido lattico) | Reagente | NatureWorks | 4042D |
| Occhiali di copertura (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Attrezzatura |
| Cloroformio | Scharlab | CL0200 | Reagente |
| 1,1,1,3,3,3-Esafluoro-2-propanolo (HFIP) | Sigma | 105228 | Siringa reagente |
| (1 ml) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | |
| Attrezzatura Pompa a siringa | New Era Sistemi di pompaggio | NE1000 | |
| Attrezzatura Alimentatore CC ad alta tensione | Glassman Incubatore per apparecchiature FC serie ad alta tensione | ||
| Hucoa-Herlö s | 3111 | Attrezzatura | |
| Cappa a flusso laminare | Telstar | AV30/70 | Attrezzatura |
| Fibronectina umana | Sigma | F2006 | Reagente |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagente |
| Microscopio invertito | Leica Microsystems | DMI 6000 | Attrezzatura |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagente |
| Albumina | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagente |
| Interpolazione 20 | Reagente Sigma-Aldrich | P2287 |
Riferimenti
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J.
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Ristampe e permessi
