Descriviamo un modello di coltura 3D dell'epitelio mammario umano adatto per studiare l'azione ormonale.
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Articolo metodologico
Una cultura Modello 3D Ormone-sensibile della Human ghiandola mammaria Epithelium
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il processo di morfogenesi epiteliale mammaria è influenzato dagli ormoni. Lo studio dell'azione ormonale sull'epitelio mammario utilizzando colture 2D è limitato alla proliferazione cellulare e agli endpoint di espressione genica. Tuttavia, nell'organismo, la morfogenesi mammaria avviene in un ambiente 3D. I sistemi di coltura 3D aiutano a colmare il divario tra la coltura cellulare monostrato (2D) e la complessità dell'organismo. In questo articolo, descriviamo un modello di coltura 3D dell'epitelio mammario umano adatto a studiare l'azione ormonale. Utilizza come matrice la linea cellulare epiteliale mammaria umana ormono-responsiva, T47D, e il collagene di coda di ratto di tipo 1. Questo modello di coltura 3D risponde ai principali ormoni mammotropici: estradiolo, progestinici e prolattina. L'influenza di questi ormoni sulla morfogenesi epiteliale può essere osservata dopo 1 o 2 settimane di trattamento a seconda dell'endpoint. Le colture 3D possono essere raccolte per l'analisi della morfogenesi epiteliale, della proliferazione cellulare e dell'espressione genica.
Introduzione
Diversamente culture standard 2D, modelli surrogati di coltura cellulare 3D permettono lo studio del comportamento delle cellule epiteliali in un contesto fisiologicamente rilevanti, uno simile a un tessuto. culture 3D della ghiandola mammaria hanno contribuito a chiarire molti aspetti dello sviluppo della ghiandola mammaria e neoplasie. Tuttavia, la maggior parte dei modelli di coltura 3D attualmente disponibili non sono adatti per studiare l'azione ormonale perché le linee di cellule epiteliali umane utilizzate per l'attività carenti dell'ormone del recettore espressione 6,7,9.
Qui, descriviamo un modello di coltu....
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Protocollo
1. Preparazione dei reagenti
- Sciogliere il promegestone sintetico progestinico (R5020) e 17-β-estradiolo (E2) in etanolo per fare 10 -3 soluzioni madre M. Sciogliere prolattina in acqua deionizzata distillata per fare un / Soluzione 1 mg ml. Sciogliere il antiestrogeno ICI 182,780 in DMSO per ottenere una soluzione stock 10 -2 M. Conservare queste soluzioni a -20 ° C per un massimo di 6 mesi.
- Carbone destrano (CD) messo a nudo siero e medie CDFBS:
- Calore inattivare siero bovino fetale (FBS) in un bagno di acqua 57 ° per 30 min.
Nota: utilizzare solo vetreria d'acido per il resto di questo protocollo.
- Calore inattivare siero bovino fetale (FBS) in un bagno di acqua 57 ° per 30 min.
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Risultati
La Figura 1 riassume il procedimento per la preparazione delle culture 3D ormone-sensibile. strutture epiteliali sono osservati in interi monti del gel in coltura per 2 settimane in presenza di E2 da solo e in combinazione con altri ormoni. Solo le cellule singole o gruppi di 2-3 cellule sono presenti quando ormoni vengono aggiunti al mezzo di coltura (media CDFBS) (Figura 2). Questa condizione serve come controllo negativo.
Le cellule in strutture di forma .......
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Discussione
Qui, descriviamo un modello di coltura 3D sensibile agli ormoni per testare l'azione degli ormoni sull'epitelio mammario. La risposta agli ormoni può essere valutata a livello di morfologia tissutale, proliferazione cellulare ed espressione genica 12. Una limitazione di questa tecnica è che la visualizzazione durante il periodo di coltura è limitata alla microscopia ottica poiché le colture vengono coltivate in una piastra inferiore di plastica. Il sistema di coltura 3D potrebbe essere adattato a piastre con f.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Noi apprezziamo molto i contributi editoriali di Cheryl Schaeberle. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni Avon # 02-2009-093 e 02-2011-095, e NIEHS / NIH ES 08314 di AMS. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute of Environmental Health Sciences o il National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre per colture tissutali a 12 pozzetti (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Provette coniche in polistirene da 15 ml | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Carbone attivo | Sigma | C-5510 | |
| Allume carminio | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenasi, Tipo 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Microscopio confocale | Zeiss | LSM510 | Equipaggiato con laser HeNe 633nm |
| Destrano T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, senza rosso fenolo | Life Technologies | 11339-021 | Terreni privi di rosso fenolo per uso ormonale |
| DMEM, basso glucosio, piruvato, senza glutammina, senza rosso fenolo | Life Technologies | 11054-020 | Terreni privi di rosso fenolo per uso ormonale |
| 17-β-estradiolo | EMD Millipore | 3301 | disciolto in etanolo |
| Etanolo | Koptec | V1001 | |
| Siero fetale bovino | Hyclone | SH30070.03 | Per l'uso con ormoni, deve essere Destrano di carbone spogliato |
| Filtri (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0,88, 0,45, 0,20 micron, rispettivamente |
| Formalina, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-glutammina (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | disciolto in microtomo DMSO |
| Leica | RM2155 | ||
| Terreno di inclusione tissutale | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillina | Sigma | 7794-10MU | Disciolto in 10 ml di acqua distillata deionizzata |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolattina | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Disciolto in acqua distillata deionizzata |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Disciolto in etanolo |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | I lotti possono contenere concentrazioni variabili, si noti di conseguenza |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Processore di tessuti da banco semichiuso | Leica | TP1020 | |
| Idrossido di sodio | Sigma Aldrich | S5881 | Preparare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Spazzola antistatica | Amstat | C3500 | |
| Stripette Pipette sierologiche | Corning | 4101 | |
| Palloni T-25 | Corning | ||
| Cassette tissutali | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Fiale di Wheaton, vetro, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xilene | VWR | 95057-822 |
Riferimenti
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325(2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S.
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Ristampe e permessi
