Articolo metodologico

Metodi Per inibire batterica Pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo

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DOI:

10.3791/53105

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31 agosto 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Wisconsin Milwaukee

In questo articolo

Sommario

La produzione batterica di piomelanina determina un aumento della resistenza allo stress ossidativo e alla virulenza. Riportiamo le tecniche che possono essere utilizzate per determinare l'inibizione della produzione di piomelanina e per valutare il conseguente aumento della sensibilità allo stress ossidativo nei batteri, oltre a determinare la concentrazione minima inibitoria (MIC) degli antibiotici.

Abstract

La piomelanina è un pigmento extracellulare rosso-marrone prodotto da diverse specie batteriche e fungine. Questo pigmento deriva dalla via del catabolismo della tirosina e contribuisce ad aumentare la resistenza allo stress ossidativo. La produzione di piomelanina in Pseudomonas aeruginosa è ridotta in modo dose-dipendente attraverso il trattamento con 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC). Descriviamo un metodo di titolazione che utilizza concentrazioni multiple di NTBC per determinare la concentrazione del farmaco che ridurrà o abolirà la produzione di piomelanina nei batteri. Il metodo di titolazione ha un risultato facilmente quantificabile, una riduzione visibile della produzione di pigmenti con l'aumento delle concentrazioni di farmaci. Descriviamo anche un metodo di piastra per microtitolazione per dosare la concentrazione minima inibitoria (MIC) di antibiotici nei batteri. Questo metodo utilizza un numero minimo di risorse e può essere facilmente scalato per testare più antibiotici in una piastra per microtitolazione per un ceppo di batteri. Il test MIC può essere adattato per testare gli effetti di composti non antibiotici sulla crescita batterica a concentrazioni specifiche. Infine, descriviamo un metodo per testare la sensibilità batterica allo stress ossidativo incorporando H2O2 nelle piastre di agar e individuando più diluizioni di batteri sulle piastre. La sensibilità allo stress ossidativo è indicata dalla riduzione del numero e delle dimensioni delle colonie per le diverse diluizioni su piastre contenenti H2O2 rispetto a un controllo senza H2O2. Il test su piastra spot per lo stress ossidativo utilizza un minimo di risorse e basse concentrazioni di H2O2. È importante sottolineare che ha anche una buona riproducibilità. Questo test su piastra spot potrebbe essere adattato per testare la sensibilità batterica a vari composti incorporando i composti in piastre di agar e caratterizzando la crescita batterica risultante.

Introduzione

Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram negativo che produce una varietà di pigmenti tra cui la piomelanina, un pigmento rosso-marrone che aiuta a fornire protezione dallo stress ossidativo1-4 e lega una varietà di composti, inclusi gli antibiotici aminoglicosidici5-7. La produzione di piomelanina è causata da un difetto nella via del catabolismo tirosina4,8, sia attraverso delezioni o mutazioni del gene che codifica per l'omogentisato 1,2-diossigenasi (HmgA)1,9 o attraverso squilibri nei vari enzimi della via10. L'omogentisato si accumula a causa dell'inattivazione di HmgA e viene secreto e ossidato per formare piomelanina11. La produzione di piomelanina può essere abolita o ridotta in modo dose-dipendente attraverso il trattamento con l'erbicida 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC)12, che inibisce la 4-idrossifenilpiruvato diossigenasi (Hpd) nella via del catabolismo tirosina13. L'Hpd è necessaria per la formazione dell'omogentisato, e quindi della piomelanina11.

Descriviamo in dettaglio tre tecniche che sono state importanti nei nostri studi sul trattamento NTBC dei ceppi di P. aeruginosa che producono piomelanina. Queste tecniche includono la titolazione di NTBC per determinare le concentrazioni che aboliranno o ridurranno la produzione di piomelanina nei ceppi di laboratorio e clinici che producono piomelanina, la determinazione della concentrazione inibitoria minima (MIC) degli antibiotici quando i batteri vengono trattati con NTBC e la conseguente sensibilità allo stress ossidativo con il trattamento NTBC.

Il test di titolazione che abbiamo sviluppato serve a due scopi. In primo luogo, il test consentirà all'utente di determinare se NTBC può abolire o ridurre la produzione di piomelanina nel batterio in esame e a quali concentrazioni. Ciò consentirà all'utente di determinare la sensibilità all'NTBC, poiché diversi ceppi di batteri possono avere diverse sensibilità a questo composto, come osservato in P. aeruginosa12. In secondo luogo, il saggio di titolazione NTBC consentirà all'utente di determinare la concentrazione appropriata di NTBC da utilizzare nei test successivi, come i MIC antibiotici e i test di risposta allo stress ossidativo, se l'obiettivo è quello di abolire o ridurre la produzione di piomelanina e determinare gli effetti della riduzione del pigmento.

Il test di titolazione funziona perché si può osservare una differenza visibile nella produzione di piomelanina nei ceppi trattati con NTBC e le differenze nella produzione di piomelanina dipendono dalla dose12. Inoltre, questa tecnica può essere applicata allo studio di altri composti che possono eliminare o migliorare la produzione di pigmenti nei batteri.

Le MIC antibiotiche vengono utilizzate per determinare la sensibilità dei batteri agli antibiotici. Esistono diversi metodi per determinare le MIC, tra cui le piastre di diluizione dell'agar e le diluizioni del brodo14. Le diluizioni del brodo possono essere eseguite in piccole provette o in una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Il metodo di determinazione della MIC su piastra per microtitolazione qui descritto consentirà all'utente di testare un'ampia gamma di antibiotici utilizzando un minimo di risorse. Il test offre riproducibilità e flessibilità nel numero di antibiotici e ceppi testati con questo metodo. Inoltre, con l'incorporazione di NTBC nel test, l'utente può determinare se l'eliminazione o la riduzione della produzione di piomelanina altera la sensibilità agli antibiotici nei batteri che producono piomelanina.

La risposta batterica allo stress ossidativo può essere testata in diversi modi. I metodi più comuni descritti sono la conta vitale dei batteri sottoposti a stress ossidativo per un periodo di tempo1 o i saggi di diffusione del disco da stress ossidativo15. Questi metodi tendono a utilizzare alte concentrazioni di fattori di stress ossidativo per esaminare gli effetti dello stress ossidativo nei batteri e i risultati possono essere piuttosto variabili tra le repliche biologiche. Il saggio di conta vitale tende anche a utilizzare più piastre di agar rispetto agli altri metodi. Il test su piastra spot che descriviamo utilizza basse concentrazioni di H2O2 e consente all'utente di testare la risposta allo stress ossidativo di più ceppi utilizzando un minimo di piastre. Il test è inoltre costantemente riproducibile tra repliche tecniche e biologiche. Poiché la piomelanina è coinvolta nella resistenza allo stress ossidativo, l'incorporazione di NTBC nel test consente all'utente di determinare gli effetti dell'eliminazione della produzione di piomelanina sulla resistenza allo stress ossidativo.

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Protocollo

1. Preparazione della Cultura Media, antibiotici, e 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoile] -1,3-cicloesandione (NTBC)

  1. Rendere brodo LB (1% triptone, estratto di lievito 0,5%, 0,25% di NaCl in H 2 O) e aliquota in volumi appropriati. Sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
  2. Rendere 100 ml LB agar (1% triptone, estratto di lievito 0,5%, 0,25% NaCl, 1,5% agar in H 2 O) in 250 ml beute. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente. Assicurarsi che l'agar viene fuso prima di versare in piastre.
    NOTA: Boccette contenenti 100 ml di LB agar produrrà 4 piatti. La quantità di LB agar può essere modificato per corrispondere al numero di lastre necessarie per il dosaggio.
  3. Fai la PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Sterilizzare in autoclave o filtrazione e conservare a temperatura ambiente.
  4. Preparare le soluzioni madre di antibiotici per gentamicina, kanamicina, und tobramicina.
    1. Preparare opportune concentrazioni azionari antibiotici per P. aeruginosa ceppi contenenti 100 mg / ml gentamicina, 30 mg / ml di kanamicina, e 10 mg / ml tobramicina. Sciogliere gli antibiotici in acqua, sterilizzare il filtro (0,2 micron), e conservare a 4 ° C. Modificare gli antibiotici e le concentrazioni seconda batterio studiata.
  5. Preparare le soluzioni madre NTBC. Disciogliere 10 mg di NTBC in 400 ml di DMSO. Questo produce una concentrazione di 75,9 NTBC mM. Store Solutions NTBC azionari a -20 ° C. Soluzioni scongelare a temperatura ambiente, se necessario.
    NOTA: diverse fonti di NTBC hanno differenze di solubilità. Determinare il veicolo appropriato per sciogliere il NTBC in base alle raccomandazioni del costruttore e regolare Passo 1.5 di conseguenza.

2. NTBC titolazioni di Ceppi batterici

  1. Impostare le culture durante la notte dei ceppi da testare. Aggiungere 2 ml di brodo LB a 16 x 150 mm provettas (uno per ceppo) e inoculare con 1 isolato colonia da ogni ceppo. Incubare per una notte a 37 ° C con aerazione su un rotatore coltura tissutale in un incubatore dell'aria.
  2. Il giorno seguente, preparare titolazioni di NTBC in LB brodo. Utilizzare una prima serie 0-900 micron NTBC da ceppi diversi hanno differenze nella sensibilità al NTBC.
    1. Aggiungere 1 ml di brodo LB per 4 a 5 provette (16 x 150 mm) per ceppo.
    2. Aggiungere la soluzione di riserva NTBC (75,9 mm) per le provette (16 x 150 mm) in un intervallo di concentrazioni. Vedi Tabella 1 per le concentrazioni di NTBC e corrispondenti volumi delle scorte di aggiungere ad 1 ml di brodo LB.
  3. Misurare il diametro esterno 600 delle culture durante la notte. Lavare le culture prima di OD 600 letture per eliminare pyomelanin presente nei media.
    1. Lavare le culture centrifugazione 1 ml di coltura in una microcentrifuga a 16.000 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante e tutte le cellule senza bloccare in pellet conun micropipettatore e risospendere il pellet cellulare solido in 1 ml LB.
  4. Inoculare tubi di titolazione a OD 600 0.05. Calcolare la quantità di coltura lavato necessari per inoculare le provette.
    NOTA: Utilizzare le culture lavati per vaccinazioni da pyomelanin non dovrebbe essere presente.
  5. Incubare le provette titolazione per circa 24 ore a 37 ° C con aerazione usando un tessuto coltura rotatore in un incubatore dell'aria.
  6. Fotografa i tubi di titolazione e confrontare produzione di pigmenti all'interno e tra i ceppi per determinare la quantità di NTBC da utilizzare per MIC e lo stress ossidativo saggi. Utilizzare OD 600 letture per determinare la quantità di pyomelanin in cella libera supernatante di coltura e per determinare la densità cellulare.
    NOTA: Il rapporto di OD 600 pyomelanin nella cultura surnatante in cellule può essere calcolato per quantificare le differenze nella produzione pyomelanin dopo il trattamento con NTBC.

3. antibiotico minima inibizioneConcentrazione tory (MIC) Assay in piastre con 96 pozzetti

  1. Impostare le culture durante la notte dei ceppi da testare in LB con e senza NTBC.
    NOTA: Questo protocollo è descritta utilizzando il livello rappresentativo di 300 micron NTBC. Il livello adeguato di NTBC da utilizzare è determinato nel passo 2.6.
    1. Aggiungere 300 micron NTBC a 2 ml LB. Aggiungere un volume equivalente di veicolo (DMSO) a 2 ml LB per la condizione non NTBC.
    2. Utilizzando stuzzicadenti sterili, inoculare provette con uno isolato colonia di batteri. Ci sarà una cultura con NTBC e una cultura senza NTBC per ogni ceppo. Incubare per una notte a 37 ° C con aerazione usando un tessuto coltura rotatore in un incubatore dell'aria.
  2. Il giorno seguente, fare LB + NTBC e soluzioni maestri LB + DMSO per l'impostazione del test MIC. Aggiungere NTBC ad una concentrazione di 600 mM come questa saranno diluiti due volte quando si aggiunge inoculo, ottenendo una concentrazione finale di 300 mM.
    1. Per provare uno antibiotic per un ceppo, aggiungere 600 micron NTBC a 2 ml di LB e mescolare per rendere la soluzione principale NTBC. Aggiungere un volume equivalente di veicolo (DMSO) a 2 ml LB e mescolare per rendere la soluzione maestro non NTBC. Utilizzare queste soluzioni per la creazione di soluzioni madre di antibiotici, nonché per la creazione di una serie di diluizioni in piastre da 96 pozzetti.
      NOTA: Le formulazioni in soluzione maestri produrrà soluzione in più per tenere conto di errori di pipettamento. Le soluzioni master può essere aumentato o giù come richiesto a seconda del numero di antibiotici e ceppi testati.
  3. Preparare le soluzioni antibiotiche nelle soluzioni maestri LB + NTBC o LB + DMSO.
    NOTA: La concentrazione di antibiotico in queste soluzioni dovrebbero essere il doppio della concentrazione finale desiderata. Soluzione abbastanza dovrebbe essere fatto per trasferire 100 ul di quattro pozzi in una piastra da 96 pozzetti.
    1. Preparare gentamicina +/- soluzione madre NTBC a 64 mg / ml. Per rendere questa soluzione, aggiungere 0,288 ml di gentamicina magazzino (100 mg / ml) per 450ul LB + NTBC o soluzione maestro LB + DMSO.
      NOTA: la concentrazione massima di gentamicina per P. aeruginosa PAO1 è 32 mg / ml.
    2. Rendere la kanamicina +/- soluzione di riserva NTBC a 256 mg / ml. Per rendere questa soluzione, aggiungere 3,84 ml di kanamicina magazzino (30 mg / ml) per 450 microlitri soluzioni maestri LB + NTBC o LB + DMSO.
      NOTA: la concentrazione massima di kanamicina per P. aeruginosa PAO1 è di 128 mg / ml.
    3. Preparare tobramicina +/- soluzione madre NTBC a 8 mg / ml. Per rendere questa soluzione, aggiungere 0,36 ml di tobramicina magazzino (10 mg / ml) per 450 microlitri soluzioni maestri LB + NTBC o LB + DMSO.
      NOTA: Per P. aeruginosa PAO1, la massima concentrazione di tobramicina è 4 mg / ml.
      NOTA: Gli antibiotici e le concentrazioni possono essere regolati per i batteri da testare.
  4. Aggiungere 100 ml di ogni soluzione antibiotica 2x a quattro pozzi in una piastra da 96 pozzetti. Mettere queste soluzioni in fila A. Per example, gentamicina deve essere posto in A1 a A4, kanamicina deve essere posto in A5 attraverso A8 e tobramicina deve essere posto in A9 attraverso A12. Vedere Figura 1A per un diagramma di una piastra a 96 pozzetti impostato.
    NOTA: più antibiotici possono essere testati in un piatto, ma solo ceppo devono essere testati per piastra di eliminare il rischio di contaminazione incrociata da altri ceppi.
  5. Aggiungere 50 ml di soluzione di maestro LB + NTBC o LB + DMSO alle righe B attraverso H della piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che un piatto è LB + NTBC e un piatto è LB + DMSO. Vedere la Figura 1A.
    1. Utilizzare LB + NTBC per gli antibiotici in LB + NTBC. Utilizzare LB + DMSO per gli antibiotici in LB + DMSO.
  6. Utilizzando un micropipettatore eseguire due diluizioni seriali piega degli antibiotici trasferendo 50 ml di soluzione dalla fila A alla fila B. Mix la soluzione, modificare i puntali, e trasferire 50 ml di soluzione da riga B a remare C. Ripetere l'operazione per il remainirighe ng. Dopo diluizione fila G, rimuovere 50 ml di soluzione da quella riga e scarti. Utilizzare fila H come nessun controllo antibiotico per la crescita batterica. Vedere la Figura 1B.
    NOTA: ogni bene nelle righe da A a G ora contiene 50 ml di antibiotici in LB + NTBC o LB + DMSO a 2X la concentrazione finale desiderata. Fila H contiene LB + NTBC o LB + DMSO con antibiotici.
  7. Misurare il diametro esterno 600 delle culture durante la notte. Lavare tutte le culture prima di OD 600 letture per eliminare pyomelanin presente nei media.
    1. Lavare le culture centrifugazione 1 ml di coltura in una microcentrifuga a 16.000 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante con un micropipettatore e risospendere il pellet cellulare in 1 ml LB.
  8. Diluire le culture durante la notte per 2.75x10 5 CFU / ml in LB.
    NOTA: Si supponga che una OD 600 unità è l'equivalente di 1x10 9 CFU / ml per P. aeruginosa. OD di CFU / ml conversioni può essere different in altri batteri.
  9. Aggiungere 50 ml di coltura batterica diluito nel pozzetto.
    NOTA: Le culture coltivati ​​in NTBC dovrebbero essere aggiunti ai pozzetti contenenti NTBC e culture cresciute in DMSO dovrebbero essere aggiunti ai pozzetti contenenti DMSO. Vedere la Figura 1B.
    1. Aggiungi ai batteri di tre pozzi per ogni ceppo e la concentrazione di antibiotico. Aggiungere 50 ml di LB alla quarta e di agire come un controllo per la contaminazione batterica. Vedere la Figura 1B.
    2. Utilizzare un micropipettatore multicanale per inoculare i pozzi. Assicurarsi che pipetta suggerimenti sono vicino al fondo dei pozzetti quando si aggiunge inoculo per prevenire la contaminazione dei pozzi vicini.
      NOTA: L'aggiunta di coltura batterica ai pozzetti diluire le concentrazioni di antibiotici e NTBC due volte.
  10. Coprire le piastre a 96 pozzetti con parafilm e incubare circa 24 ore a 37 ° C. Incubare le piastre a 96 pozzetti staticamente, in un incubatore dell'aria.
  11. Esaminarele piastre per la crescita batterica nei pozzetti. La MIC è la più bassa concentrazione di antibiotico in cui nessuna crescita batterica è visibile per tutte tre repliche di ciascun ceppo.
    1. Esaminare visivamente la piastra per la crescita o leggere utilizzando un lettore di set piatto di OD 600.

4. Spot Assay Piastra per Stress ossidativo risposta

  1. Impostare le culture durante la notte dei ceppi da testare in LB con e senza NTBC come descritto al punto 3.1.
  2. Il giorno successivo, preparare piastre di agar LB contenenti H 2 O 2 come fattore di stress ossidativo. Una gamma di H 2 O 2 concentrazioni da 0 a 1 mm è un buon punto di partenza.
    1. Sciogliere i palloni LB agar. Supporti Raffreddare a circa 50 ° C a temperatura ambiente.
    2. Aggiungere H 2 O 2 direttamente ai media raffreddati alle concentrazioni desiderate. Fiaschi Swirl per mescolare. Vedere la Tabella 2 per le concentrazioni di H 2 O 2e volumi di H 2 O 2 concentrato da aggiungere. Questi valori sono basati su 100 ml di LB agar.
    3. Versare in piastre subito dopo l'aggiunta H 2 O 2 e fiamme la superficie per rimuovere bolle. La resa è di 4 piastre per 100 ml di LB agar. Segnare i piatti con la concentrazione di H 2 O 2.
    4. Posizionare le piastre scoperto in una cappa a flusso biologico con il ventilatore acceso per 30 minuti per rimuovere l'umidità in eccesso dalle piastre.
      NOTA: Utilizzare le lastre lo stesso giorno in cui vengono preparati. In caso contrario si potrebbe causare dati incoerenti.
      NOTA: fattori di stress ossidativo, come il paraquat può essere sostituito per H 2 O 2 in questo saggio. Le concentrazioni utilizzate per altri fattori di stress ossidativi possono variare rispetto a quelli utilizzati per H 2 O 2.
  3. Lavare e misurare il diametro esterno 600 delle culture durante la notte come descritto al punto 3.7.
  4. Normalizzare la OD 600 di tutta la cu durante la notteltures al valore più basso per il set di ceppi testati. P. aeruginosa ha generalmente un diametro esterno 600 di circa 2,5 quando cresciuto durante la notte in LB + NTBC o LB + DMSO.
    1. Determinare il volume della cultura necessaria per diluire la coltura al OD più basso 600 in un volume totale di 1 ml. Ad esempio, se una coltura ha un diametro esterno 600 del 3 e l'OD più basso 600 per il set di ceppi è 2.5, eseguire il seguente calcolo: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml di coltura saranno collocati in una provetta per microcentrifuga.
    2. Calcolare la quantità di LB + NTBC (300 micron) o LB + DMSO necessaria a portare il volume cultura di 1 ml. Per l'esempio nel passaggio 4.4.1, la quantità di LB + NTBC o LB + DMSO aggiunto alla cultura sarebbe 0.167 ml (1 ml di volume totale - 0.833 ml cultura). Fai soluzioni stock di LB + NTBC e LB + DMSO da utilizzare per queste diluizioni in base al volume necessario per diluire tutti i ceppi.
    3. Mescolare la cultura e LB + NTBC o LB + DMSO nel vortex.
  5. Per mantenere le culture in una concentrazione costante di NTBC o DMSO, eseguire dieci diluizioni seriali di piegatura delle culture durante la notte normalizzati in PBS + NTBC o PBS + DMSO.
    1. Fai soluzioni stock di PBS + NTBC e PBS + DMSO. Per una serie di diluizioni di un ceppo, mescolare 300 pM NTBC o un volume equivalente di DMSO con PBS per ottenere un volume totale di 720 microlitri. Scala questi stock alto o in basso a seconda di quante ceppi vengono testati.
    2. Tubi Label microcentrifuga per 10 -1 attraverso diluizioni 10 -7 seriali. Aggiungere 90 ml di PBS + NTBC o PBS + DMSO ai tubi appropriati. Usa PBS + NTBC per i ceppi cresciuti in LB + NTBC e utilizzare PBS + DMSO per i ceppi cresciuti in LB + DMSO.
    3. Aggiungere 10 ml di cultura alla competente 10 -1 provetta di diluizione. Mescolare nel vortex e trasferire 10 ml di diluizione 10 -1 al tubo di diluizione 10 -2. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le diluizioni sono stati perfoconfermate. Cambiare puntali tra diluizioni.
  6. Spot 5 ml di 10 -3 attraverso 10 -7 diluizioni su LB + H 2 O 2 piastre in duplicato per ogni ceppo. Utilizzare una punta della pipetta se i punti sono placcati da più diluito al meno diluito (10 -7 a 10 -3). Non ribaltare la piastra fino a quando il liquido si è asciugata nella piastra.
  7. Incubare le piastre per 24-48 ore a 37 ° C (incubatore aria), a seconda del ceppo.
    NOTA: P. aeruginosa PAO1 avrà buone colonie dimensioni su LB dopo 24 ore di incubazione. Incubare ceppi fino colonie hanno approssimativamente la stessa dimensione PAO1.
  8. Fotografare i piatti utilizzando una fotocamera CCD sopra un transluminator. Facoltativamente, modificare le foto per il contrasto e la coltivazione alla stessa dimensione. Contare il numero di colonie in ogni posto per determinare le variazioni di sensibilità allo stress ossidativo.

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Risultati

Titolazioni NTBC

Le titolazioni NTBC sono stati utilizzati per determinare se NTBC è stata in grado di ridurre la produzione pyomelanin in P. aeruginosa, e anche identificare la concentrazione di NTBC che elimina o riduce pyomelanin produzione per uso in test aggiuntivi. Ci possono essere variazioni nei livelli di pyomelanin prodotto in diverse repliche, ma tendenze generali rimanere costante. Il saggio di titolazione NTBC potrebbe anche essere modificato per testare altri ...

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Discussione

Il metodo di titolazione NTBC descritto in questo protocollo consentirà all'utente di determinare se NTBC è in grado di ridurre o eliminare la produzione di piomelanina nei batteri e di determinare la concentrazione di NTBC richiesta. La fase più critica del test di titolazione NTBC consiste nel determinare l'intervallo di concentrazioni di NTBC da utilizzare nel test. Diversi ceppi di P. aeruginosa hanno sensibilità diverse alle NTBC e i ceppi di laboratorio possono essere più sensibili alle NTBC rispetto agli ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Dara Frank e Carrie Harwood per il loro generoso contributo di varietà. La Milwaukee Research Foundation dell'Università del Wisconsin detiene il brevetto n. 8.354.451; con affermazioni ampiamente dirette al trattamento o all'inibizione della progressione dell'infezione di un microrganismo in un paziente mediante la somministrazione di un composto inibitore della 4-idrossifenilpiruvato diossigenasi come il 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC). Gli inventori sono Graham Moran e Pang He. Questa ricerca è stata supportata dal National Institutes of Health (R00-GM083147). La libreria di mutanti trasposoni P. aeruginosa dell'Università di Washington è supportata da NIH P30 DK089507.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC)Sigma-AldrichSML0269-50mgChiamato anche nitisinone. Solubile in DMSO.
H2O2Sigma-Aldrich216763-100ML30 % in peso in H2O.  Stabilizzato.
GentamicinaGold BioG-400-100solubile in H2O.  Filtro sterilizzare.
KanamicinaFisher ScientificBP906-5solubile in H2O.  Filtro sterilizzare.
TobramicinaSigma-AldrichT4014-100MGsolubile in H2O.  Filtro sterilizzare.

Riferimenti

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092(2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

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