Metodi Per inibire batterica Pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo

Sommario

La produzione batterica di piomelanina determina un aumento della resistenza allo stress ossidativo e alla virulenza. Riportiamo le tecniche che possono essere utilizzate per determinare l'inibizione della produzione di piomelanina e per valutare il conseguente aumento della sensibilità allo stress ossidativo nei batteri, oltre a determinare la concentrazione minima inibitoria (MIC) degli antibiotici.

Abstract

La piomelanina è un pigmento extracellulare rosso-marrone prodotto da diverse specie batteriche e fungine. Questo pigmento deriva dalla via del catabolismo della tirosina e contribuisce ad aumentare la resistenza allo stress ossidativo. La produzione di piomelanina in Pseudomonas aeruginosa è ridotta in modo dose-dipendente attraverso il trattamento con 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC). Descriviamo un metodo di titolazione che utilizza concentrazioni multiple di NTBC per determinare la concentrazione del farmaco che ridurrà o abolirà la produzione di piomelanina nei batteri. Il metodo di titolazione ha un risultato facilmente quantificabile, una riduzione visibile della produzione di pigmenti con l'aumento delle concentrazioni di farmaci. Descriviamo anche un metodo di piastra per microtitolazione per dosare la concentrazione minima inibitoria (MIC) di antibiotici nei batteri. Questo metodo utilizza un numero minimo di risorse e può essere facilmente scalato per testare più antibiotici in una piastra per microtitolazione per un ceppo di batteri. Il test MIC può essere adattato per testare gli effetti di composti non antibiotici sulla crescita batterica a concentrazioni specifiche. Infine, descriviamo un metodo per testare la sensibilità batterica allo stress ossidativo incorporando H₂O₂ nelle piastre di agar e individuando più diluizioni di batteri sulle piastre. La sensibilità allo stress ossidativo è indicata dalla riduzione del numero e delle dimensioni delle colonie per le diverse diluizioni su piastre contenenti H₂O₂ rispetto a un controllo senza H₂O₂. Il test su piastra spot per lo stress ossidativo utilizza un minimo di risorse e basse concentrazioni di H₂O₂. È importante sottolineare che ha anche una buona riproducibilità. Questo test su piastra spot potrebbe essere adattato per testare la sensibilità batterica a vari composti incorporando i composti in piastre di agar e caratterizzando la crescita batterica risultante.

Introduzione

Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram negativo che produce una varietà di pigmenti tra cui la piomelanina, un pigmento rosso-marrone che aiuta a fornire protezione dallo stress ossidativo^1-4 e lega una varietà di composti, inclusi gli antibiotici aminoglicosidici^5-7. La produzione di piomelanina è causata da un difetto nella via del catabolismo tirosina^4,8, sia attraverso delezioni o mutazioni del gene che codifica per l'omogentisato 1,2-diossigenasi (HmgA)^1,9 o attraverso squilibri nei vari enzimi della via¹⁰. L'omogentisato si accumula a causa dell'inattivazione di HmgA e viene secreto e ossidato pe....

Protocollo

1. Preparazione della Cultura Media, antibiotici, e 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoile] -1,3-cicloesandione (NTBC)

1. Rendere brodo LB (1% triptone, estratto di lievito 0,5%, 0,25% di NaCl in H _{2 O)} e aliquota in volumi appropriati. Sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
2. Rendere 100 ml LB agar (1% triptone, estratto di lievito 0,5%, 0,25% NaCl, 1,5% agar in H _{2 O)} in 250 ml beute. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente. Assicurarsi che l'agar viene fuso prima di versare in piastre.
   NOTA: Boccette contenenti 100 ml di LB agar produrrà 4 piatti. La quantità di LB agar....

Risultati

Titolazioni NTBC

Le titolazioni NTBC sono stati utilizzati per determinare se NTBC è stata in grado di ridurre la produzione pyomelanin in P. aeruginosa, e anche identificare la concentrazione di NTBC che elimina o riduce pyomelanin produzione per uso in test aggiuntivi. Ci possono essere variazioni nei livelli di pyomelanin prodotto in diverse repliche, ma tendenze generali rimanere costante. Il saggio di titolazione NTBC potrebbe anche essere modificato per testare altri .......

Discussione

Il metodo di titolazione NTBC descritto in questo protocollo consentirà all'utente di determinare se NTBC è in grado di ridurre o eliminare la produzione di piomelanina nei batteri e di determinare la concentrazione di NTBC richiesta. La fase più critica del test di titolazione NTBC consiste nel determinare l'intervallo di concentrazioni di NTBC da utilizzare nel test. Diversi ceppi di P. aeruginosa hanno sensibilità diverse alle NTBC e i ceppi di laboratorio possono essere più sensibili alle NTBC rispetto agli .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Chiamato anche nitisinone. Solubile in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 % in peso in H2O.  Stabilizzato.
Gentamicina	Gold Bio	G-400-100	solubile in H2O.  Filtro sterilizzare.
Kanamicina	Fisher Scientific	BP906-5	solubile in H2O.  Filtro sterilizzare.
Tobramicina	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	solubile in H2O.  Filtro sterilizzare.