Valutazione della cocaina indotta sensibilizzazione comportamentale e conditioned place preference nei topi

Sommario

Questo protocollo ha lo scopo di consentire ai ricercatori di condurre esperimenti progettati per testare questi aspetti della dipendenza utilizzando la preferenza di luogo condizionata e i saggi di sensibilizzazione comportamentale locomotoria.

Abstract

Si pensa che le esperienze gratificanti con le droghe creino forti associazioni contestuali e incoraggino l'assunzione ripetuta. A loro volta, esposizioni ripetute a droghe d'abuso provocano alterazioni durature nella funzione cerebrale di individui vulnerabili, e queste alterazioni persistenti probabilmente servono a mantenere i comportamenti disadattivi di ricerca e assunzione di droghe caratteristici della dipendenza/dipendenza². Nei roditori, l'esperienza di ricompensa e le associazioni contestuali sono spesso misurate utilizzando il test di preferenza di luogo condizionato, o CPP, in cui viene misurata la preferenza per un contesto precedentemente accoppiato con un farmaco. La sensibilizzazione comportamentale, d'altra parte, è un aumento di un comportamento indotto da farmaci che si sviluppa progressivamente nel corso di esposizioni ripetute. Poiché i comportamenti sensibilizzati possono spesso essere misurati dopo diversi mesi di astinenza dal farmaco, a seconda della dose e della durata dell'esposizione iniziale, sono considerati correlati osservabili della plasticità indotta dal farmaco duratura. I ricercatori hanno trovato questi saggi utili per determinare i substrati neurobiologici che mediano gli aspetti della dipendenza, nonché per valutare il potenziale di diversi interventi nell'interrompere questi comportamenti. Questo manoscritto descrive protocolli di base ed efficaci per la CPP del topo e la sensibilizzazione comportamentale locomotoria alla cocaina.

Introduzione

La ricerca volta a comprendere la tossicodipendenza utilizzando modelli animali deve adottare una varietà di approcci per affrontare ciascuna delle componenti assortite che ostacolano il successo del trattamento, tra cui ricompensa/rinforzo/motivazione e ritiro e ricaduta, così come la persistenza generale che complica ulteriormente questi problemi nella dipendenza. Poiché si ritiene che le esperienze gratificanti associate all'assunzione di una droga d'abuso motivino l'uso successivo, gli studi incentrati sulle associazioni farmaco-contesto possono essere particolarmente utili per comprendere i meccanismi cerebrali che contribuiscono all'assunzione e alla ricerca di droghe. Uno di questi saggi, la preferenza di luogo condizionata (CPP) è un metodo ad alto rendimento per confrontare le differenze di gruppo nella sensibilità alla ricompensa. L'interpretazione tradizionale del compito coinvolge il condizionamento classico, o pavloviano, in cui uno stimolo condizionato (CS) è accoppiato con uno stimolo incondizionato (UCS) e, dopo molteplici accoppiamenti, il CS suscita lo stesso comportamento dell'UCS (tuttavia, vedi^39,40). In teoria, gli animali imparano ad associare uno stato interocettivo (ricompensa o avversione) a segnali contestuali. L'intensità relativa avversiva o appetitiva dello stato interocettivo viene quindi valutata determinando la preferenza dell'animale per i segnali contestuali. L'uso del condizionamento del luogo per misurare le associazioni farmaco-ricompensa risale almeno al 1957, a uno studio che utilizzava la morfina su ratti in un labirinto a Y^3,4. Negli ultimi decenni, le variazioni di questo metodo sono state ampiamente utilizzate per studiare la preferenza di luogo e l'avversione nei roditori a vari stimoli, e rimane particolarmente utile nello studio delle associazioni indotte da droghe d'abuso. Nella ricerca sulle tossicodipendenze, il test è stato utilizzato per valutare le proprietà gratificanti di un certo numero di farmaci e il contributo di diversi sistemi cerebrali e proteine alla ricompensa dei farmaci (per le recensioni, vedi^5-7,44). Sebbene esistano metodi superiori per valutare i fattori che contribuiscono alla tossicodipendenza, in particolare l'autosomministrazione di farmaci, la CPP è un approccio semplice e molto più accessibile per misurare la funzione di ricompensa.

La maggior parte dei protocolli attuali per la preferenza e l'avversione condizionata al luogo (CPA) utilizzano un apparato che consente ai roditori di avere accesso a due camere distinte, tramite una porta o una camera di collegamento più piccola. Le distinzioni tra le due camere sono spesso basate, come minimo, su segnali visivi e tattili, tra cui il colore delle pareti e la struttura del pavimento, ma a volte includono altri elementi, come i segnali olfattivi. I progetti "distorti" in genere tentano di invertire una preferenza innata preesistente per una camera rispetto all'altra, come quella che i roditori generalmente mostrano per una camera nera rispetto a quella bianca. I progetti "imparziali" mirano a creare una preferenza per una delle due camere che inizialmente erano ugualmente attraenti, controbilanciando casualmente l'assegnazione a una delle due camere all'interno di un gruppo. Un design "equilibrato" viene utilizzato quando gli animali mostrano piccole preferenze, ma non preferiscono, come gruppo, la stessa camera. Gli obiettivi di quest'ultimo disegno sono di produrre 1) punteggi di preferenza pre-test per la (eventuale) camera accoppiata con cocaina che non siano significativamente diversi tra i gruppi sperimentali e 2) preferenza trascurabile per la camera accoppiata con cocaina al pre-test, sia positiva che negativa⁸. Il design bilanciato è ideale per l'uso con le camere descritte, che utilizzano pregiudizi contraddittori per il colore delle pareti (nero su bianco) e il pavimento (filo su barra), risultando in una distribuzione approssimativamente uguale di piccole preferenze per entrambi i lati bianco e nero in diversi animali. I calcoli di bilanciamento sono descritti più dettagliatamente di seguito.

Durante il condizionamento, gli animali vengono esposti a un farmaco e rapidamente inseriti in uno di questi due ambienti per un periodo di tempo limitato. L'esposizione avviene tipicamente tramite iniezione intraperitoneale (i.p.) o talvolta sottocutanea (s.c.), sebbene siano stati sviluppati anche paradigmi per l'autosomministrazione endovenosa (i.v.)⁹ e le infusioni intracraniche³⁸ in un apparato di preferenza di luogo. Questi accoppiamenti sono integrati da accoppiamenti non farmacologici (veicolo) della stessa durata condotti nella camera opposta, che possono avvenire lo stesso giorno degli accoppiamenti farmacologici o in giorni separati. In generale, quando viene permesso loro di esplorare l'apparato dopo il condizionamento, gli animali trascorreranno più tempo dove hanno ricevuto un farmaco gratificante (cioè uno che gli esseri umani e gli animali si autosomministreranno volontariamente), mentre eviteranno un luogo in cui è stato somministrato loro un farmaco che ha indotto la malattia (ad esempio, il cloruro di litio). Diversi studi sono stati dedicati all'ottimizzazione delle condizioni per la preferenza di luogo a diverse droghe d'abuso (per la revisione, vedi⁷). Le dosi di cocaina (i.p.) per i topi variano generalmente da 1 a 20 mg/kg, con dosi inferiori a 5 mg/kg spesso utilizzate per analizzare l'alta sensibilità in un gruppo. In genere sono necessari due o più accoppiamenti di farmaci per i topi adulti¹⁰ e la lunghezza di questi accoppiamenti è una considerazione importante. Dosi molto basse di cocaina richiedono un condizionamento immediato e breve, probabilmente perché questo metodo cattura il periodo più gratificante dell'esposizione. Periodi di condizionamento ritardati o molto lunghi possono portare a nessuna preferenza, o possono addirittura indurre avversione^11,12. Qui viene presentato un metodo di base per ottenere una preferenza di luogo condizionata alla cocaina nei topi adulti.

Sebbene il test CPP sia un metodo ideale per valutare l'apprendimento correlato alla ricompensa e la memoria delle associazioni farmaco-contesto, la sensibilizzazione comportamentale è probabilmente più facile da eseguire e consente la valutazione dei cambiamenti che si sviluppano nel corso del trattamento ripetuto. Conosciuta anche come tolleranza inversa, i comportamenti sottoposti a sensibilizzazione sono incrementalmente migliorati rispetto alle esposizioni ripetute a una particolare droga d'abuso, in particolare agli psicostimolanti, ed è noto che la sensibilizzazione incrociata si verifica tra alcune, ma non tutte, di queste droghe. Una delle prime valutazioni della sensibilizzazione locomotoria indotta dalla cocaina, in particolare, nei roditori è stata pubblicata nel 1976¹³. Un certo numero di laboratori ha dimostrato che la locomozione sensibilizzata è rilevabile molto tempo dopo la cessazione della droga, a seconda della durata originale, della posizione e della dose di esposizione^14-17, e l'attuale protocollo è stato utilizzato per rilevare la sensibilizzazione fino a 10 mesi dopo sette giorni (30 mg/kg) di trattamento con cocaina nei topi¹⁸. Il test può essere eseguito utilizzando tecnologie di fotoraggio o di tracciamento video, in apparecchiature di diverse dimensioni e forme, semplificando l'esecuzione per molti laboratori. La natura robusta, la semplicità e la persistenza della sensibilizzazione locomotoria rendono la sua valutazione una parte ideale dell'esame dei meccanismi di base dei cambiamenti duraturi nel comportamento indotto dai farmaci.

Come viene approfondito nella discussione, una considerazione importante quando si esegue il test di sensibilizzazione locomotoria è se il farmaco viene somministrato nell'ambiente domestico o nella gabbia di prova. Per sfruttare la robusta sensibilizzazione che si verifica quando la somministrazione del farmaco avviene al di fuori della gabbia domestica, questo protocollo utilizza questo metodo. Tuttavia, è stato osservato che quando gli animali non sono adeguatamente abituati a un nuovo ambiente prima dell'esposizione al farmaco, il primo giorno si verifica un effetto soffitto indotto dalla novità, che può mascherare parzialmente o completamente la natura progressiva della sensibilizzazione. È probabile che ciò rappresenti effetti sinergici di attivazione locomotoria del farmaco insieme alla novità e, sebbene i meccanismi alla base di tali effetti possano essere interessanti, il metodo descritto è progettato per ridurre il ruolo della novità e consentire di misurare gli effetti del farmaco in modo più indipendente. Mentre ci si aspetta che questo metodo sarà utile nella valutazione di altri farmaci sensibilizzanti locomotori, ha valutato principalmente la sua efficacia con la cocaina nei topi C57BL/6.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa McLean Hospital. NOTA: La seguente protocollo descrive un approccio unico al CPP e locomotore sensibilizzazione, molti dettagli di cui differiscono da altri protocolli di successo (ad esempio, luce- vs test scuro fase, consecutiva contro somministrazione intermittente, etc.). Novizi possono desiderare iniziare con questi protocolli, o semplicemente usarli come guide, adattando alterazioni dalla letteratura sulla base del presupposto dell'esperimento (s) a portata di mano. sono descritti metodi di misurazione automatizzati; tuttavia, è possibile utilizzare non automatizzato per ogni saggio (cioè, registrazione video, mano scoring).

1. place-preference

1. Attrezzature e locale di installazione:
   1. Maniglia topi sperimentale per 1-3 minuti ogni giorno, per almeno 3-5 giorni prima del test.
      NOTA: Non manico topi possono trovare rimozione dalla camera di stressful, che possono interferire con o alterare condizionata.
   2. Ottenere quattro o più apparati CPP tre camerata, preferibilmente dotati di photobeams per la raccolta automatica dei dati ^18. Assicurarsi che ogni camera ha due camere grandi, visually- e tattilmente-distinte che collegano ad una camera più piccola, neutro tramite porte che può essere sollevato / abbassato per controllare l'accesso. Coperchi in ciascuna camera dovrebbero aprire per l'inserimento / rimozione di topi e di essere montato con le luci di piccole dimensioni, controllabili singolarmente (dimmerabili) (uno per camera).
      NOTA: CPP disegni da camera variano e possono essere acquistati in commercio o costruiti dai ricercatori. Per il motivo "bilanciata", un regime raccomandato è una camera grande con pareti bianche e pavimenti griglia metallica e l'altra con pareti nere e pavimenti bar. La camera centrale dovrebbe avere pareti grigie e solido pavimento in Plexiglass grigio. Per facilitare la descrizione, queste camere saranno indicati come "bianco", "nero" e "middle".I coperchi devono essere chiare Plexiglass. configurazioni alternative vano (uno o due da camera) sono anche possibili e discusso altrove (vedi la discussione).
   3. Imposta la stanza come sarà durante i test: spegnere o impostare plafoniere per l'impostazione minima e chiudere la porta. Utilizzare un misuratore di luce all'interno di ogni camera e impostare le luci coperchio in modo che le camere medie sono leggermente più brillante (15-20 lux) di camere in bianco e nero (6-10 lux), al fine di scoraggiare i topi da passare il tempo lì.
      NOTA: Se il tempo medio trascorso in mezzo è tanto o più che nelle camere bianche o nere, aumentare ulteriormente il contrasto di illuminazione descritto al punto 1.1.3. In alternativa, utilizzare pavimenti meno attraente per la metà. (Ad esempio, ~ 220 fori di diametro 0,5 cm, distribuiti uniformemente in 6 x 3.5 x ¼ "plexiglass), ma evitare di fare questa camera di avversione. Pilota alterazioni per garantire che diminuisce nel tempo di mezzo non sono causa di diminuzioni di esplorazioni totali (incroci) .
   4. Programma raccolta automatizzata dei dati ( "procedura" Figura 1A) o raccogliere manualmente i dati in base ai seguenti parametri. Set prove per iniziare alla prima pausa trave in entrambi i camera di condizionamento. Impostare le sessioni di "test" per essere 20 minuti di lunghezza e per monitorare il tempo trascorso e del fascio si rompe in ciascuna camera. Impostare le sessioni di "condizionamento" di essere 30 minuti lungo e (opzionalmente) per misurare le interruzioni del fascio in ciascuna camera. Impostare tutte le luci della camera per illuminare durante il processo.
   5. Preparare pieno volume di soluzione di cocaina necessaria per l'esperimento a portata di mano. Sciogliere cocaina HCl in 0,9% NaCl (soluzione fisiologica), basando la concentrazione finale in un volume di iniezione di 0,1 ml / 10 g di peso corporeo (ad esempio, per una dose di 5 mg / kg, la concentrazione della soluzione è di 0,5 mg / ml). miscela vortex per 30-45 secondi, filtro sterile (0,2 micron filtri per siringa) e conservare a temperatura ambiente.
2. test:
   NOTA: La timeline generale per CPP è pre-test, condizionata epoi post-test. Il pre-test può essere separato dalla condizionamento da parte di 1-3 giorni; tuttavia, condizionata e il giorno post-test dovrebbe aver luogo nei giorni consecutivi (Figura 2A). Questa temporizzazione deve essere mantenuto lo stesso per tutte le coorti nello stesso esperimento.
   1. Test durante fase leggera degli animali con la stessa apparecchiatura per ogni animale di tutti giorni.
   2. Ogni giorno di prova (ad esempio, i test e giorni di condizionamento), spostare topi per l'anticamera del comportamento e consentire loro di sedersi indisturbati nelle loro gabbie casa per 1-1,5 ore prima del processo. Scegliere una posizione dove i topi possono essere spostati rapidamente da loro gabbia all'apparato, con il minimo disturbo, quando inizia il processo. Accendere tutte le apparecchiature in modo che eventuali rumori connessi con il test (ad esempio, ventilatori Tecnica) sono presenti.
   3. Pulire accuratamente ogni apparato (pareti interne, pavimenti e vassoi) con lieve, alcool, glicole-Ethernet o a base di ammoniaca disinfezione salviette prima e dopo ogni topo (utilizzare il same il tipo di detergente per tutto l'esperimento). Non trascurare pavimentazione inferiori.
   4. Controllare che le luci della stanza siano impostati in modo appropriato (spento o in grigio) all'inizio di ogni giornata.
   5. Procedere con la seguente seconda che si tratta di un "test" o giorno "condizionamento":
      1. On Trial giorni 1 e 6 (vale a dire, il pre e post-test), posizionare le porte inter-camera in posizione aperta (Figura 2B).
      2. Caricare il programma informatico "test" e inserire gli ID degli animali (Figura 1A), quindi emettere un comando di avvio (Figura 1B), se applicabile.
      3. Delicatamente inferiore ogni topo nella camera di metà del suo apparato assegnato, di fronte alla parete di fondo, e dolcemente chiudere il coperchio. Una volta che tutte le camere sono stati caricati, lasciare la sala prove e ridurre al minimo il rumore.
      4. Lascia i topi all'interno di ogni apparato fino a quando le prove per tutti i mouse hanno chiuso / finito (Figura 1C). dati degli studi di esportazione.
   6. Appena prima o dopo il pre-test, pesare gli animali. Utilizzare questi pesi per il calcolo della dose durante il condizionamento.
   7. Al fine di prepararsi per le prove di condizionamento, calcolare pre-test "preferenza" di ogni mouse per le camere in bianco e nero dal tempo trascorso in ciascuno di questi dall'altro (cioè, "nero meno nero" e "bianco minus bianco" sottraendo; vedere Figura 3, Colonne 9 e 10).
   8. Dal momento che i topi con forti preferenze iniziali rendono difficile il bilanciamento, stabilire un limite accettabile per i punteggi di preferenza (ad esempio, <33% del tempo di prova totale) ed escludere i topi che superano da calcoli. Utilizzare un limite liberale (<66% del tempo di prova totale) per massimizzare l'inclusione quando logoramento è probabile che dopo il test è completo (ad esempio, a causa di off-bersaglio manipolazioni chirurgiche).
      NOTA: I topi che superano il limite può ancora essere testati, con un tentativo di mantenere le loro preferenze pre-test equilibrata. Più tardi, ttopi hese possono essere esclusi dalla analisi, se necessario, per bilanciare i punteggi pre-test. Se estremi pregiudizi pre-test (ad esempio,> 800 sec) colpiscono in modo sproporzionato un gruppo, considerare alterando gli ambienti di condizionamento e / o utilizzando altri saggi.
   9. Scegli la camera di bianco o nero come la camera di droga abbinamento per ogni mouse, nel frattempo sommando i corrispondenti punteggi di preferenza pre-test all'interno di ogni gruppo con le seguenti priorità in mente:
      NOTA: Fare attenzione a bilanciare i punteggi tra i gruppi all'interno di ciascuna coorte, nonché attraverso qualsiasi coorti precedenti.
      1. Rendere le somme per tutti i gruppi come equivalenti possibile.
      2. Rendere le somme il più vicino possibile allo zero (cioè, scegliere il lato preferito per alcuni topi e il lato non preferito per gli altri). Se un quasi-somma zero è impossibile per qualsiasi dato gruppo, ri-regolare tutti gli altri a corrispondere al meglio alla miglior punteggio ottenibile per il gruppo di limitazione, favorendo gruppo leggermente negativo riassume soprapositivo.
      3. Per quanto possibile, mantenere le assegnazioni di nero contro bianco e preferita rispetto a camere non preferite per abbinamenti di droga anche all'interno di ogni gruppo.
      4. Poiché non è sempre possibile per raggiungere gli obiettivi di cui sopra, correggere eventuali deviazioni rendendo opposte considerazioni di bilanciamento in coorti successive; tuttavia, cercare di evitare la produzione di coorti con selvaggiamente diverse preferenze media pre-test.
   10. Su condizionata giorni 2-5, posizionare porte inter-camera in posizione chiusa (Figura 2C).
   11. Preparare singole siringhe con la cocaina (giorni 2 e 4) o soluzione salina (giorni 3 e 5) soluzione, come descritto al punto 1.1.5 e sulla base del peso corporeo valutate al pre-test.
       NOTA: dose deve essere scelto in relazione alle aspettative sperimentali, considerazioni di cui in premessa, e potenziali effetti pavimento e soffitto. Spesso è meglio per condurre esperimenti indipendenti utilizzando almeno due dosi differenti.
   12. Load "cID animale onditioning programma per elaboratore "e inserire (Figura 1A), quindi emettere un comando di avvio (Figura 1B), se applicabile.
   13. Scruff e iniettare ogni topo (ip), subito li abbassamento nella camera di bianco o nero appropriata del loro apparato assegnato di fronte alla parete di fondo, poi dolcemente chiudere il coperchio. Una volta che tutte le camere sono stati caricati, lasciare la sala prove e ridurre al minimo il rumore.
   14. Rimuovere i topi da loro camera come vicino esattamente 30 min fattibile (cioè, il primo topi vengono rimossi dalla loro camere mentre altri topi sono ancora condizionata). Rimuovere gli animali il più silenziosamente possibile, senza introdurre rumore.
3. Analisi statistica:
   1. Scegliere un metodo di analisi. In entrambi i casi il tempo sottrarre trascorso sul lato salina-accoppiato durante la post-test da tempo trascorso sul lato cocaina accoppiato durante la post-test (la cocaina - salina, sec) o utilizzare il tempo trascorso nella camera di droga abbinato post-testmeno il tempo di pre-test speso per la camera di droga-accoppiato.
      NOTA: se si usa il primo metodo, anche grafici lineari trama del tempo medio trascorso nel mezzo, camere saline- e droga-accoppiato durante i pre e post-test per ogni gruppo. Rispetto al pre-test, il post-test dovrebbe mostrare un aumento del tempo nel lato droga abbinato ed è diminuito il tempo trascorso nel lato salina-accoppiato (vedi figura 6, in basso, e discussione per la spiegazione).
   2. A seconda della natura e del numero di gruppi a confronto, utilizzare un t-test, uno o due Way ANOVA, a seconda dei casi, possibilmente con l'analisi post-hoc, per analizzare uno dei punteggi sottrazione sopra presentato.
      NOTA: cocaina punteggi di preferenza tendono ad essere variabile, e, inoltre, possono essere negativi (ad esempio, indicare l'avversione al lato della droga-accoppiato). I topi che mostrano l'avversione non devono essere rimossi (a meno che siano valori erratici statistici), dal momento che questo risultato è normale e probabilmente importanti per determinare le differenze tra grOups. Prevedono la necessità dimensioni del campione di 12 a 30 animali per gruppo, a seconda delle dimensioni effetto del trattamento.

2. locomotore Sensibilizzazione

1. Attrezzature e Camera Set-Up
   1. Ottenere un 4 x 8 (X x Y) Fotocellule serie (dimensioni esterne 11.5 "x 20"). Costruire una camera decappottabile in plexiglas nero (dimensioni interne 22 1/6 "x 13 ¾" x 9 3/8 ") per ospitare l'array (Figura 4A).
   2. Preparare la sala prove in modo che una luce rossa (a soffitto ea parete) può essere utilizzato durante il test.
   3. Preparare sessioni programma separato per assuefazione e iniezione prove quotidiane.
      1. Impostare prove di assuefazione ad essere tra i 30-60 min e iniezione prove per essere compreso tra 60-120 min (Figura 5B). La lunghezza raccomandata per ciascuna è di 60 min. Mantenere la lunghezza di prova consistente in più coorti all'interno dello stesso esperimento.
      2. Set prove per iniziare recording sulla prima pausa trave che si verifica dopo il segnale di avvio è stata avviata (Figura 5B). Per il processo di iniezione, impostare il segnale di avvio in modo che scatole possono essere avviati singolarmente (non all'unisono), se possibile.
      3. Impostare le interruzioni del fascio da registrare in definiti dall'utente "bidoni", preferibilmente di 5 minuti ciascuno (Figura 5B).
   4. Preparare pieno volume di soluzione di cocaina necessaria per l'esperimento a portata di mano. Sciogliere cocaina HCl in 0,9% NaCl (soluzione fisiologica), basando la concentrazione finale in un volume di iniezione di 0,1 ml / 10 g di peso corporeo (ad esempio, per una dose di 5 mg / kg, la concentrazione della soluzione è di 0,5 mg / ml). miscela vortex per 30-45 secondi, filtro sterile (0,2 micron filtri per siringa) e conservare a temperatura ambiente.
2. analisi
   NOTA: La fase iniziale di test viene eseguito per 10-11 giorni consecutivi. I topi ricevono due prove quotidiane: assuefazione (senza iniezione) e l'iniezione. Somministrare soluzione salina per i primi tre di fi nostri giorni (vedi la discussione per importanza di assuefazione fisiologica), e la cocaina per i prossimi sette utilizzando la stessa dose (ad es., 15 mg / kg / die).
   1. Ogni giorno, ambientarsi topi nelle loro gabbie a casa per l'anticamera comportamentale per 30 minuti a 1 ora.
   2. Preparare pulito radura gabbie abitative acrilico del mouse di dimensioni standard, con un sottilissimo strato di lettiera fresca (ad esempio, i chip di pino), in modo da non oscurare photobeams, se del caso (Figura 4C & D).
   3. Inserire gabbie contro l'asse Y della matrice photobeam vicino ad una estremità, in modo che cinque travi sono distanziati in modo uniforme lungo la sua lunghezza. Travi asse X non vengono utilizzati in questo test (Figura 4C & D).
   4. Prendere i topi dalla loro gabbia casa, in ordine casuale, collottola e pesare. Rimuovere ogni topo dalla barca pesare dalla base della loro coda (con il supporto) e posto direttamente nella loro gabbia motorio assegnato. Coprire ogni gabbia con un coperchio del filtro-top standard.
   5. Preparare singole siringhe wesimo salina o soluzione di cocaina, come descritto al punto 2.1.7, sulla base del peso corporeo del giorno corrente. Iniziare con una dose di 15 o 20 mg / kg, e prendere in considerazione un secondo esperimento usando una dose maggiore o minore (vedi la discussione di fattori rilevanti).
   6. Una volta che gli studi di assuefazione hanno finito per tutte le gabbie, caricare il programma di iniezione.
   7. Uno alla volta, togliere i topi dalla loro gabbia di prova, collottola e dare il loro iniezione (ip). Prima di tornare il mouse per la sua gabbia di prova, avviare rapidamente il segnale di partenza per quella gabbia (Figura 5C, in basso).
   8. Dopo tutte le prove di iniezione sono finiti, tornare topi per loro gabbie casa e la loro camera abitazioni.
   9. Se lo si desidera, consentire topi sottoposti ad una serie di periodi di sospensione e sfide droga, come il seguente: stessa dose originale, metà dose, doppia dose, poi salina, permettendo sette giorni prima della sfida stessa dose e 06:57 giorni prima di ogni ulteriore sfida. Qualunque sia la scelta di sfide, eseguire manutenzione sun periodi di sospensione simili in tutta coorti all'interno di un esperimento.
      NOTA: Se la dose iniziale è elevato (ad esempio, 30 mg / kg o superiore), la doppia dose deve essere saltato o sostituita con una dose inferiore. La sfida salina rivela alcuna attivazione locomotoria condizionata dall'ambiente cocaina-abbinato sola, e nel processo, la quantità di locomozione sensibilizzata che la cocaina-dipendente (vedi Discussione).
3. Analisi statistica
   1. Scegliere la porzione (s) di ogni prova che verrà utilizzato per l'analisi. La maggior parte locomozione indotta dalla cocaina nei roditori si verifica entro il primo ~ 15-30 minuti dopo l'iniezione di droga. A seconda variabili coinvolte, considera di analisi locomozione cumulativo per più finestre di tempo (ad esempio, la prima 15, 30, 60 e / o 120 min) o concentrarsi su spezzoni indipendenti del processo.
   2. Utilizzando il tempo cornice scelta, sommare le pause del fascio per ciascun animale al giorno per le prove di adattamento e di iniezione separatamente e poi unverage le somme per ogni gruppo. Trama significa e gli errori standard della media (SEM) in un grafico a linee su tutti i giorni. Come trattamenti possono alterare come topi rispondono al farmaco precoce e / o in ritardo in ogni prova quotidiana, anche tracciare pause medi fascio gruppo da 5 min bin nel corso di ogni prova quotidiana.
      NOTA: Tracciare le medie attività giornaliere per prove di adattamento e di iniezione (ad esempio, prima 15 min) fa apparire artificialmente che locomozione viene smorzata mediante iniezione di soluzione salina, ma ricordate che l'attività ha (molto probabilmente) rifiutato a questo livello entro la fine di assuefazione ogni giorno .
   3. Analizzare giorni saline e trattamento farmacologico consecutivi separatamente utilizzando misure ripetute (RM) ANOVA avere il fattore entro soggetti del giorno / ora e compresi eventuali fattori tra soggetti nella progettazione, a seconda dei casi. Utilizzare un t-test o One-Way ANOVA per indagare le differenze di gruppo il giorno 1 di cocaina (esposizione acuta), e una ANOVA multivariata per le sfide. Se del caso, seguire significance con i test post-hoc o Univariata ANOVA.

Risultati

Risultati rappresentativi del dosaggio CPP sono mostrate in Figura 6 con wild-type topi C57BL / 6N a circa nove settimane di età. Il disegno dello studio era un fattoriale misto 2 x 3, con una variabile entro soggetti di prova (pre e post) e tra soggetti variabile del trattamento (soluzione salina e cocaina 5 e 10 mg / kg). Una RM ANOVA ha mostrato una significativa interazione tra test e trattamento (F _2,20 = 3.68, p <0,05), che è stato interpretato in luogo dei ...

Discussione

Questo protocollo illustra metodi place preference e locomotore sensibilizzazione, ciascuno dei quali può essere utilizzato dal laboratorio media di valutare aspetti della plasticità comportamentale indotta da farmaci. Come con la maggior parte dei test comportamentali, ci sono altre considerazioni degne di là del protocollo di base. Innanzitutto, ciascuna di queste tecniche può essere concepito come avente due fasi, l'induzione ed espressione. "Asincrono" comprende lo sviluppo del comportamento per CPP si...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cocaina cloridrato USP	Mallinckrodt Pharmaceuticals	0406-1520	L'acquisto e l'uso (sostanza controllata di Tabella II) per scopi di ricerca richiede la conformità e la licenza secondo la legge statale e federale.
Preferenza di luogo condizionata,  Apparato a tre scomparti con porte e luci manuali per Mouse	Med-Associates Inc.	MED-CPP-MS & MED-CPP-3013	Il nostro laboratorio ha utilizzato queste scatole; tuttavia, molte scatole alternative sono disponibili e accettabili.
PAS-Home Monitoraggio dell'attività della gabbia Array di fotoraggi	San Diego Instruments	2325-0223 e 7500-0221	Il nostro laboratorio ospita questi array all'interno di camere costruite su misura, come descritto nel testo. Ci sono alternative disponibili.
Salviette disimpregnanti monouso Sani-Cloth	PDI	13872