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Articolo metodologico

Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti

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DOI:

10.3791/53113

⸱

11 dicembre 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University, 2Neurophysiology Research Center, Shahed University, 3Cellular and Molecular Research Center, Iran University of Medical Sciences, 4School of Advanced Technologies in Medicine, Iran University of Medical Sciences

In questo articolo

Sommario

Gli astrociti nel SNC cambiano le loro proprietà funzionali e strutturali in risposta a stimoli dannosi. Questo rapporto presenta un protocollo per la valutazione della morfologia tridimensionale degli astrociti in condizioni di malattia o dopo interventi terapeutici.

Abstract

Mentre le cellule gliali del cervello, astrociti hanno diversi ruoli funzionali nel sistema nervoso centrale. In presenza di stimoli nocivi, astrociti modificano le loro proprietà funzionali e strutturali, una condizione chiamata astrogliosis reattiva. Qui, un protocollo per la valutazione delle proprietà morfologiche di astrociti è presentato. Questo protocollo include quantificazione dei 12 parametri diversi cioè la superficie e il volume del tessuto coperto da una astrociti (territorio astrociti), l'intero astrociti compresi rami, corpo cellulare, e nucleo, così come la lunghezza totale e il numero di rami, l'intensità della fluorescenza immunoreattività di anticorpi utilizzati per il rilevamento astrociti, e la densità astrociti (numero / 1.000 micron 2). A questo scopo tridimensionali (3D) immagini microscopiche confocale sono stati creati, e immagini 3D software di analisi come Volocity 6.3 è stato utilizzato per le misurazioni. Tessuto cerebrale di ratto esposti a beta amiloide 1-40 1-40), con o senza un intervento terapeutico è stato utilizzato per presentare il metodo. Questo protocollo può essere utilizzato anche per l'analisi morfometrica 3D di altre cellule da in vivo o in vitro condizioni.

Introduzione

Nel sano il sistema nervoso centrale (SNC), astrociti svolgono un ruolo importante nella regolazione del flusso di sangue, metabolismo energetico, la funzione sinaptica e plasticità, e ionico extracellulare e neurotrasmettitore omeostasi 1-3. Inoltre, astrociti rispondono a stimoli diversi nocive e condizioni anomale, come traumi, infezioni, ischemia o neurodegenerazione con astrogliosi reattiva che è caratterizzata da ipertrofia, la proliferazione e rimodellamento funzionale degli astrociti 4,5.

Astrogliosis reattiva può progettare la risposta infiammatoria e processo di riparazione del tessuto e, quindi, può influenzare l'esito clinico di interventi terapeutici. Di conseguenza, gli astrociti hanno ricevuto attenzione da neuroscienziato nel corso degli ultimi decenni come potenziali bersagli per interventi terapeutici per una varietà di malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale.

Astrociti normalmente hanno una forma stellata con ben-drami efined che si diffondono in tutto il soma 6. In una condizione di malato nel cervello, rami astrociti diventare aggrovigliata e mostrano estremità gonfie 7, ad esempio in presenza di beta amiloide (Ap).

Questo articolo presenta un protocollo per l'analisi di immagini 3D di astrociti acquisite al microscopio confocale. Dodici diversi parametri quantitativi per ogni astrociti sono stati misurati: delle superfici e dei volumi del territorio astrociti (il tessuto coperto da un astrociti), intera cella (incluse le filiali), corpo cellulare, e nel nucleo; la lunghezza totale e il numero di sportelli; l'intensità di fluorescenza di anticorpi utilizzati per la rilevazione astrociti; e la densità degli astrociti (numero / 1.000 micron 2). A questo scopo, abbiamo usato sezioni di cervello di ratti esposti a intrahippocampal iniezione di Ap 1-40 con o senza trattamento genisteina come sostanza anti-infiammatoria. Il protocollo descritto può essere utilizzato per un morfometricaANALISI DELLA diversi tipi di cellule in vitro o in vivo in condizioni diverse.

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Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con le politiche contenute nel Manuale per la cura e l'uso di animali da laboratorio (NIH) approvate dal Comitato Etico dell'Iran dell'Università di Scienze Mediche (Teheran, Iran).

1. Gli animali, Chirurgia e campioni preparati

NOTA: Preparare il tessuto cerebrale per il 3D confocale analisi microscopica.

  1. Animali Dividere casualmente in due gruppi: Ap 1-40 -injection (n = 8), e Ap 1-40 -injection con trattamento genisteina (n = 8); amministrare genisteina (10 mg / kg diluito in un veicolo come olio di ricino polietossilato) mediante sonda gastrica 1 ora prima dell'intervento chirurgico.
  2. Anestetizzare gli animali con ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Verificare il corretto anestesia dalla mancanza di recesso reflex dopo la presa la punta. Usare pomata sugli occhi durante l'intervento chirurgico per prevenire la secchezza.
  3. Mettere animali in apparato stereotassico e la testa rasatura. Applicare iodsoluzione ine per pulire il cuoio capelluto prima incisione e mantenere il sito dell'operazione sterile durante l'intervento chirurgico per ridurre il rischio di infezione. Iniettare Ap 1-40 stereotassica (4 pl) nell'ippocampo a -3.5 mm posteriormente al bregma, ± 2 mm lateralmente alla linea mediana, e -2.8 mm al di sotto dura, secondo ratto cervello atlante 8. Per il metodo stereotassico consultare pubblicazione precedente 9.
  4. Fornire post-operatorio di osservazione / cura fino a quando gli animali sono pienamente consapevoli per garantire il comfort degli animali. Tenere gli animali al caldo durante il recupero, e non li tornare a una gabbia con altri animali fino al pieno recupero. Prestare attenzione a eventuali segni di infezione negli animali dopo l'intervento chirurgico.
  5. Anestetizzare gli animali profondamente da ketamina (150 mg / kg) tre settimane dopo l'intervento. Eseguire la fissazione transcardial mediante perfusione degli animali con soluzione fisiologica 0,9% seguito dal 4% paraformaldeide in 0,1 M PBS (pH = 7,4), quindi rimuovere e riparare il cervello come descritto in 10 </ sup>.
  6. Post-fissare i cervelli in paraformaldeide al 4% per 2-3 giorni a 4 ° C.
  7. Incorpora il tessuto in blocchi di paraffina mediante l'uso di apparecchiature tessuti embedding, ed evitare di sotto-riempimento o over-riempire la cassetta in quanto potrebbe interferire con il corretto allineamento o sezionamento. Fare attenzione all'orientamento del tessuto nel blocco di paraffina.
    NOTA: L'ippocampo di ratto, per esempio, si trova vicino al posteriore parte dell'emisfero cerebrale. Pertanto, il tessuto deve essere incorporato in modo che inizia il sezionamento a posteriori parte del cervello. Utilizzare l'atlante Paxinos 8 come guida per raggiungere la struttura anatomica desiderata.
  8. Posizionare il microtomo lontano da correnti d'aria o porte da movimenti d'aria rendono la gestione delle sezioni difficili.
  9. Utilizzare le sezioni con uno spessore ≥20 micron a questo fondo con essere necessario per produrre immagini Z-Stack di astrociti complete. Non utilizzare i primi due sezioni, in quanto potrebbero avere spessore indesiderata causa e termicoXpansion.
  10. Posizionare le sezioni sulla superficie di acqua calda (5 ± 2 C, al di sotto della temperatura di fusione per paraffina) il tempo sufficiente per appiattire sezioni.
    NOTA: Oltre espansione della sezione può disturbare la morfologia della struttura. Utilizzare piccolo pennello per trasferire accuratamente sezioni. Raccogliere due o tre sezioni su ogni diapositiva.
  11. Conservare i vetrini in un rack in posizione verticale e lasciarle asciugare a 37 ° C per diverse ore o O / N.

2. immunoistochimica

  1. Deparaffinare sezioni in xilene, 2 x 10 min, e reidratare attraverso gradiente alcol (99,8%, 95% e 70%, 10 minuti ciascuna) e PBS.
  2. Incubare con anticorpi contro la proteina gliale fibrillare acida (GFAP) diluito 1: 1500 in PBS contenente 0,25% di albumina di siero bovino (BSA), 0,25% Triton X-100 e siero normale 3,5% (O / N a 4 ° C).
  3. Lavare le sezioni in PBS per 3 x 5 min.
  4. Incubare con alcaline antibodie fosfato-coniugato secondarios per 1h (1: 100, 21 C, diluito in PBS).
  5. Lavare le sezioni in PBS per 3 x 5 min.
    NOTA: E 'importante lavare sezioni correttamente dopo anticorpi secondari per ridurre al minimo la colorazione di fondo.
  6. Incubare sezioni in oscurità con Liquid Permanent Red Cromogeno (15-20 minuti). Nota: Preparare la soluzione non più di 30 minuti prima dell'uso.
  7. Lavare le sezioni in PBS per 3 x 5 min.
  8. Infine, macchiare i nuclei con 4-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 1: 500, diluito in PBS) prima di coprire antiscivolo. Conservare i vetrini in frigorifero 24-48 ore prima di microscopia.

3. Microscopia confocale

NOTA: Per la valutazione quantitativa (vedi sotto), selezionare un astrociti con un nucleo DAPI tinto chiaramente visibile con un minimo di sovrapposizione rami per ridurre il rischio di errori. Producendo immagini Z-Stack è molto tempo. Siate pazienti e non si fermano durante la lavorazione. Laser confocale microscopio a scansione verticale è used per creare immagini 3D da astrociti.

  1. Mettere il vetrino sul microscopio palco, e selezionare l'obiettivo 63x.
  2. Aprire il software di imaging e fare clic sul sistema Start. Fare clic sulla scheda Locate. Vai a assegnare e selezionare GFP per regolare la giusta luce.
  3. Aprire l'otturatore per riflettere la luce. Trova il riflettore Revolver sul lato destro di Shutter e scegliere il colore che dovrebbe essere riflessa da astrociti (verde, rosso o viola); colore rosso (FSet20 wf) è stato utilizzato qui.
    NOTA: Non dimenticate di mettere a fuoco l'immagine direttamente nel oculare del microscopio.
  4. Per trovare la migliore messa a fuoco, fare clic su All chiuso, mettere il perno microscopio in modalità a schermo, e fare clic sulla scheda di acquisizione.
  5. Clicca su Smart Setup nella scheda di acquisizione; apre una finestra. Selezionare il fluoroforo corretto (cioè DAPI e Alexa Fluor 555, nel progetto attuale) dalla lista. Il colore viene selezionato automaticamente.
  6. Clicca su Best segnale, e su Applica, quindi fare clic su Imposta Esposizione; il computer sarà quindi impostare automaticamente i parametri di esposizione.
  7. Per ottimizzare l'immagine, passare alla finestra Canali. Deselez Track2, evidenziare Track1 e fare clic su Live. Mettere a fuoco l'immagine, se necessario.
  8. Nella finestra Canali regolare le seguenti chiavi; cliccare su 1AU per ottimizzare automaticamente il foro stenopeico. E 'molto importante fare questo passo altrimenti le immagini confocale saranno non ottimale. Regolare il guadagno di avere la migliore intensità (mantenere questa impostazione non superiore a 800 per ridurre il rumore extra). Infine, impostare il guadagno digitale tra 2 e 3.
  9. Deselez Track1, cliccare su Track2 e ripetere il punto 3.8 per Track2. Poi fermare Live.
  10. Andare alla finestra Modalità di acquisizione. Migliorare l'immagine ottimizzando Frame Size e una media di. Per cambiare dimensione del frame andare a X * Y e selezionare 1.024 x 1.024. Scegli una bassa velocità per creare una migliore immagine.
  11. Vai a della media e selezionare un numero di ≥4. Questo valore indica la media del numero di scansioni che saranno mediati per PRODUCvia e l'immagine acquisita. Ora cliccate sul pulsante di scatto, e salvare l'immagine 2D catturata.
  12. Per l'imaging 3D, contrassegnare l'elemento Z-Stack sotto Smart Setup causando la finestra di Z-Stack per aprire.
  13. Impostare la prima e l'ultima di Z-Stack, cioè la profondità della cella. Prima clicca su Live. Quindi utilizzare l'unità di messa a fuoco del microscopio di concentrarsi sulla posizione più alta di astrociti nel tessuto, dove la Z-Stack è quello di iniziare. Clicca su Imposta prima. Poi fuoco fino alla posizione più bassa del astrociti nel tessuto, dove scansione Z-Stack deve essere interrotto. Clicca su Imposta Ultimo. Poi fermare Live.
  14. Scegliere l'intervallo; 1.01 micron viene utilizzato in questo studio; Intervallo di scelta può essere fatta cliccando su ottimale per impostare il numero di fette.
  15. Fare clic su Start Experiment. Salvare le immagini una volta che la scansione è completata. Questa immagine verrà utilizzata per la misura dei seguenti parametri: area superficiale e volume del territorio astrociti, il reggiseno intera astrociti compresonches, corpo cellulare, e il nucleo.
  16. Acquisire un'immagine 2D utilizzando un obiettivo 10X o 20X come descritto nei passaggi 3.6-3.11. Questa immagine può essere usata per la misura l'intensità della fluorescenza immunoreattività di anticorpi, e la densità astrociti (numero / 1.000 micron 2).

4. astrociti Densità e GFAP + fluorescenza intensità

  1. Aprite l'immagine 20X 2D. Clicca su Histo (Hisogram) sul lato sinistro della finestra dell'immagine.
  2. Per calcolare la densità astrociti, selezionare tre campi visivi consecutivi sotto obiettivo 20X. Contare il numero di astrociti che presentano un chiaro soma con un minimo, filiali nei campi si sovrappongono.
  3. Per quantificare l'intensità di fluorescenza, selezionare uno strumento adeguato (rettangolo o un cerchio) sul footer della finestra dell'immagine, e scegliere una zona per la misurazione. Nota il valore medio e la deviazione standard vengono visualizzati automaticamente sotto l'immagine. In questo studio, un'area rettangolare 0,7 millimetri 2 tra strè stato utilizzato iatum e lama mediale del giro dentato.

5. Filiali astrociti

  1. Per quantificare la lunghezza e il numero complessivo delle filiali, utilizzare le immagini 3D (acquisite con 20X) nel software di analisi dell'immagine. Tracciare una linea manualmente lungo la lunghezza di ogni ramo del astrociti selezionato. Quindi selezionare la misura, strumento che è specializzata per misurare la linea di lunghezza. Al fine di quantificare il numero di rami, selezionare il numero di utensili per contare il numero di elementi selezionati.

6. Volume e Superficie

NOTA: Marcatura una struttura manualmente in software di analisi dell'immagine 3D richiede concentrazione e la formazione. Pratica più volte prima di iniziare un esperimento.

  1. Per quantificare il volume e la superficie del astrociti nucleo, soma, corpo cellulare e territorio, trasferire le immagini 3D (acquisite nei passaggi 3.1-3.16) per una immagine software di analisi 3D come Volocity 6.1.
  2. Aprire il software e creare un nuovobiblioteca. Trascinare tutte le immagini alla colonna grigia a sinistra nella nuova libreria. Quindi, selezionare un'immagine 3D. Sulla destra, esistono diversi canali con colori diversi. Attivare un canale di interesse; per esempio, il canale blu per DAPI quando si misura il nucleo. Modificare la luminosità manualmente per ottenere un contrasto ottimale.
  3. Selezionare il menu Strumenti, andare a fare Volume e produrre una singola immagine 3D di immagini Z-stack. Fare clic su Proprietà nel menu Modifica e assicurarsi che X, Y e Z proprietà sono presentati; altrimenti è impossibile effettuare analisi 3D.
  4. Clicca su Freehand sull'icona strumento RIO nella barra degli strumenti. Per misurare il volume e la superficie di astrociti nucleo tracciare una linea intorno al nucleo DAPI marcato.
  5. Per misurare il volume e la superficie del corpo cellulare astrociti tracciare una linea intorno alla soma escluso rami.
  6. Per misurare il volume e la superficie di tutto il astrociti (corpo cellulare incluse le filiali) tracciare una linea intorno alla soma in seguito allala superficie di tutte le filiali.
  7. Per valutare il volume e la superficie di territorio astrociti tracciare una linea tra le punte dei rami.
    NOTA: Premere il tasto Canc sulla tastiera per cancellare disegni indesiderati.
  8. Fare clic sul menu Misurazioni nella parte superiore della finestra dell'immagine per creare un protocollo di misura; Si apre una finestra contenente diversi strumenti.
  9. Trascinare Trova oggetti alla parte superiore della finestra (riquadro). Dare un nome descrittivo per la popolazione 1, selezionare il colore associato e fare clic su Misura. Si apre un'altra finestra.
  10. Scegliere una zona parametro vale a dire, il volume o di superficie. Fare clic su OK. I dati vengono visualizzati in una tabella.
  11. Per salvare i dati, fare clic sul menu di misura e selezionare Rendi Misura dell'articolo.
  12. Selezionare un nuovo elemento di misura chiamato dalla finestra aperta. Poi dare un nome ai dati e fare clic su OK.
  13. Infine, esportare i dati al software statistiche come pad grafico o excel programma. Usa t-test per analizzare i dati, quindi tracciare 2D grAPHS.

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Risultati

Questa sezione presenta alcuni esempi delle osservazioni qualitativi e quantitativi prodotti da analisi morfometrica 3D. Per i risultati completi di tutti i 12 parametri menzionati in precedenza, si prega di consultare la nostra precedente pubblicazione 10.

Osservazioni qualitative

Gli astrociti esposti rami sottili o spessi che erano solitamente lunghi in Ap 1-40 ratti iniettati (Figura 1). Alcuni piccoli astrociti a forma ...

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Discussione

Nel protocollo corrente, abbiamo impiegato 3D morfometria confocale per valutare 12 parametri diversi che sono stati associati con astrociti morfologia. A questo scopo, tessuti ippocampali di ratto con Ap 1-40 - stati usati astrogliosis indotta, con o senza pretrattamento genisteina come agente anti-infiammatorio. Utilizzando le immagini 3D e software morfometriche, siamo stati in grado di mostrare l'effetto di genisteina sulla astrogliosi cioè morfologia degli astrociti.

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Dichiarazioni

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Consiglio della Contea di Östergötland, (Svezia) e il cellulare e molecolare Research Center presso l'Iran Università degli Studi di Scienze Mediche (Teheran, Iran).

Ringraziamenti

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Beta amiloide 1-40Sigma Aldrich79793Mantenere in -70 ° C
GenisteinSigma Aldrich446-72-0mantenere in -20 °
C anticorpi policolonali di coniglio contro la proteina acida fibrillare glialeDAKOZ0334
suino coniugato con fosfato alcalino anti-coniglio Anticorpi IgGDAKO
Cromogeno permanente liquidoDAKOK0640
Tampone substrato rosso permanente liquidoDAKOK0640
Cremophor ELSigma Aldrich27963Olio di ricino polietossilato - Passaggio 1.1
LSM 700 Microscopia a scansione laser confocaleCarl Zeiss
Volocity 6.3Perkin Elmer Inc.,
Analisi delle immagini 2000Tekno
Stoelting
Graph pad Prism 5Graph pad software Inc.
Apparecchio streotassico ottico

Riferimenti

  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  2. Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
  3. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
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  12. Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
  13. Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).

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