Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti

Summary

Gli astrociti nel SNC cambiano le loro proprietà funzionali e strutturali in risposta a stimoli dannosi. Questo rapporto presenta un protocollo per la valutazione della morfologia tridimensionale degli astrociti in condizioni di malattia o dopo interventi terapeutici.

Abstract

Mentre le cellule gliali del cervello, astrociti hanno diversi ruoli funzionali nel sistema nervoso centrale. In presenza di stimoli nocivi, astrociti modificano le loro proprietà funzionali e strutturali, una condizione chiamata astrogliosis reattiva. Qui, un protocollo per la valutazione delle proprietà morfologiche di astrociti è presentato. Questo protocollo include quantificazione dei 12 parametri diversi cioè la superficie e il volume del tessuto coperto da una astrociti (territorio astrociti), l'intero astrociti compresi rami, corpo cellulare, e nucleo, così come la lunghezza totale e il numero di rami, l'intensità della fluorescenza immunoreattività di anticorpi utilizzati per il rilevamento astrociti, e la densità astrociti (numero / 1.000 micron ^2). A questo scopo tridimensionali (3D) immagini microscopiche confocale sono stati creati, e immagini 3D software di analisi come Volocity 6.3 è stato utilizzato per le misurazioni. Tessuto cerebrale di ratto esposti a beta amiloide _1-40 1-40), con o senza un intervento terapeutico è stato utilizzato per presentare il metodo. Questo protocollo può essere utilizzato anche per l'analisi morfometrica 3D di altre cellule da in vivo o in vitro condizioni.

Introduction

Nel sano il sistema nervoso centrale (SNC), astrociti svolgono un ruolo importante nella regolazione del flusso di sangue, metabolismo energetico, la funzione sinaptica e plasticità, e ionico extracellulare e neurotrasmettitore omeostasi ^1-3. Inoltre, astrociti rispondono a stimoli diversi nocive e condizioni anomale, come traumi, infezioni, ischemia o neurodegenerazione con astrogliosi reattiva che è caratterizzata da ipertrofia, la proliferazione e rimodellamento funzionale degli astrociti ^4,5.

Astrogliosis reattiva può progettare la risposta infiammatoria e processo di riparazione del tessuto e, quindi, può influe....

Protocol

Questo studio è stato condotto in conformità con le politiche contenute nel Manuale per la cura e l'uso di animali da laboratorio (NIH) approvate dal Comitato Etico dell'Iran dell'Università di Scienze Mediche (Teheran, Iran).

1. Gli animali, Chirurgia e campioni preparati

NOTA: Preparare il tessuto cerebrale per il 3D confocale analisi microscopica.

1. Animali Dividere casualmente in due gruppi: Ap _1-40 -injection (n = 8), e Ap _1-40 -injection con trattamento genisteina (n = 8); amministrare genisteina (10 mg / kg diluito in un veicolo come olio di ricino polietossila....

Results

Questa sezione presenta alcuni esempi delle osservazioni qualitativi e quantitativi prodotti da analisi morfometrica 3D. Per i risultati completi di tutti i 12 parametri menzionati in precedenza, si prega di consultare la nostra precedente ^{pubblicazione} 10.

Osservazioni qualitative

Gli astrociti esposti rami sottili o spessi che erano solitamente lunghi in Ap _1-40 ratti iniettati (Figura 1). Alcuni piccoli astrociti a forma .......

Discussion

Nel protocollo corrente, abbiamo impiegato 3D morfometria confocale per valutare 12 parametri diversi che sono stati associati con astrociti morfologia. A questo scopo, tessuti ippocampali di ratto con Ap _{1-40 -} stati usati astrogliosis indotta, con o senza pretrattamento genisteina come agente anti-infiammatorio. Utilizzando le immagini 3D e software morfometriche, siamo stati in grado di mostrare l'effetto di genisteina sulla astrogliosi cioè morfologia degli astrociti.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beta amiloide 1-40	Sigma Aldrich	79793	Mantenere in -70 ° C
Genistein	Sigma Aldrich	446-72-0	mantenere in -20 °
C anticorpi policolonali di coniglio contro la proteina acida fibrillare gliale	DAKO	Z0334
suino coniugato con fosfato alcalino anti-coniglio Anticorpi IgG	DAKO
Cromogeno permanente liquido	DAKO	K0640
Tampone substrato rosso permanente liquido	DAKO	K0640
Cremophor EL	Sigma Aldrich	27963	Olio di ricino polietossilato - Passaggio 1.1
LSM 700 Microscopia a scansione laser confocale	Carl Zeiss
Volocity 6.3	Perkin Elmer Inc.,
Analisi delle immagini 2000			Tekno
	Stoelting
Graph pad Prism 5	Graph pad software Inc.