Method Article

Analisi di sviluppo di denti Germ innervazione Uso di dispositivi Microfluidic Co-cultura

DOI:

10.3791/53114

August 14th, 2015

In This Article

Summary

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Le co-colture rappresentano un metodo prezioso per studiare le interazioni tra nervi e tessuti e organi bersaglio. I sistemi microfluidici consentono la co-coltura di gangli e interi organi o tessuti in via di sviluppo in diversi terreni di coltura, rappresentando così un valido strumento per lo studio in vitro del crosstalk tra neuroni e i loro bersagli.

Abstract

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Innervazione svolge un ruolo chiave nello sviluppo, omeostasi e la rigenerazione di organi e tessuti. Tuttavia, i meccanismi alla base di questi fenomeni non sono ancora ben compresi. In particolare, il ruolo di innervazione in sviluppo dentale e rigenerazione è trascurato.

Diversi studi in vivo hanno fornito importanti informazioni sui modelli di innervazione di tessuti dentali durante lo sviluppo e riparazione processi di vari modelli animali. Tuttavia, la maggior parte di questi approcci non sono ottimali per evidenziare le basi molecolari delle interazioni tra le fibre nervose e organi bersaglio e dei tessuti.

Co-culture costituiscono un valido metodo per indagare e manipolare le interazioni tra le fibre nervose e denti in un ambiente controllato e isolato. Negli ultimi decenni, co-colture convenzionali utilizzando lo stesso terreno di coltura sono stati effettuati per periodi molto brevi (ad esempio, due giorni)per studiare gli effetti di attrazione o repulsione di sviluppare tessuti orali e dentali su fibre nervose sensoriali. Tuttavia, l'estensione del periodo di coltura è necessario per studiare gli effetti del innervazione sul dente morfogenesi e citodifferenziazione.

Sistemi di microfluidica permettono co-colture di neuroni e diversi tipi di cellule nella loro terreni di coltura appropriati. Abbiamo recentemente dimostrato che gangli del trigemino (TG) ed i denti sono in grado di sopravvivere per un lungo periodo di tempo in cui co-coltivate in dispositivi microfluidici, e che mantengono in queste condizioni lo stesso modello innervazione che mostrano in vivo.

Su questa base, si descrive come isolare e co-coltura di sviluppo del trigemino gangli e dei denti germi in un protocollo di co-coltura microfluidica system.This descrive un modo semplice e flessibile di co-coltura gangli / nervi e tessuti bersaglio e per studiare i ruoli di molecole specifiche su tali interazioni in un controlled e ambiente isolato.

Introduction

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Innervazione svolge un ruolo chiave nello sviluppo, omeostasi e la rigenerazione di organi e tessuti 1,2. Inoltre, innervazione è coinvolto nella regolazione della proliferazione delle cellule staminali, la mobilitazione e la differenziazione 3-5. Infatti, recenti studi realizzati in tessuti del complesso orofacciale hanno dimostrato che i nervi parasimpatici sono necessari per la funzione epiteliali cellule progenitrici durante lo sviluppo e la rigenerazione delle ghiandole salivari 6,7. Analogamente, è stato dimostrato che innervazione è necessario per lo sviluppo e il mantenimento delle papille gustative 8 - 11. Pertanto....

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Protocol

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Tutti i topi sono stati mantenuti e gestiti secondo la Legge benessere degli animali svizzera e nel rispetto delle norme del ufficio cantonale di veterinaria, Zurigo.

1. Preparazione di dissezione Materiale, Cultura Media, dispositivi microfluidici

  1. Autoclave pinze micro-dissezione e forbici (121 ° C, tempo di sterilizzazione: 20 min) e conservarle in un contenitore sterile.
  2. Sterilizzare coprioggetto di vetro (24 mm x 24 mm) da loro incubazione in 1 M HCl per 24 ore in un agitatore orbitale a 37 ° C. Lavare per tre volte con una soluzione sterile, H 2 O distillata e tre volte con etanolo 99%. Secco poi i cop....

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Results

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Questi risultati mostrano che isolati gangli trigemini possono crescere in un compartimento del dispositivo microfluidico e, inoltre, che lo sviluppo dei germi isolati dente è mantenuta per un lungo periodo di tempo in altro compartimento del dispositivo microfluidico. Diversi terreni di coltura sono utilizzati nei due scomparti, e le microscolpiture tra i due compartimenti consentono estensione dell'assone dal ganglio trigeminale verso i germi di sviluppo dei denti. Figura 3 rappresenta una visualizzaz.......

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Discussion

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Precedente in studi in vitro di dente innervazione erano basati su co-colture convenzionali di gangli trigeminali e tessuti dentali o cellule 26,28,29. Sono stati condotti Questi studi per investigare principalmente gli effetti interessanti di queste cellule o tessuti di assoni sensoriali 38. Anche se portare significativi progressi nel campo, alcuni problemi tecnici sono state sollevate. Germi denti cominciano a degenerare dopo pochi giorni di coltura 37. Sulla base di.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

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Il lavoro è stato finanziato dall'Università di Zurigo. Gli autori desiderano ringraziare Estrela Neto e la dottoressa Meriem Lamghari per aver contribuito a stabilire le condizioni di co-cultura.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sono disponibili dispositivi di isolamento AXIS AxonMilliporeAX15010-TCSono disponibili microcanali di diversa lunghezza
LamininSigma AldrichL2020
NeurobasalGibco21103-049
B27Gibco17504
Topo ricombinante beta-NGFR& D Systems1156-NG-100Beta-NGF umano e ratto (R& D Systems) sono equivalenti
DMEM-F12Gibco11320-033

References

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  1. Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
  2. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue,....

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Tooth Germ InnervationMicrofluidic Co cultureTrigeminal GangliaTooth Germ IsolationNeurite OutgrowthImmunofluorescence StainingLight MicroscopyCulture Medium ChangeAxonal ChambersMicro Grooves

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