Articolo metodologico

All'inizio virali ingresso saggi per l'identificazione e la valutazione di composti antivirali

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DOI:

10.3791/53124

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29 ottobre 2015

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1Department of Chinese Medicine, Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo che esamina passaggi specifici dell'ingresso virale per identificare e valutare nuovi agenti antivirali.

Abstract

I sistemi basati su cellule sono utili per scoprire agenti antivirali. L'analisi del ciclo di vita virale, in particolare delle prime fasi di ingresso, consente un approccio meccanicistico per identificare e valutare gli agenti antivirali che mirano a fasi specifiche dell'ingresso virale. In questo rapporto, vengono descritti i metodi per esaminare l'inattivazione virale, l'attaccamento virale e l'ingresso/fusione virale come test antivirali per tali scopi, utilizzando il virus dell'epatite C come modello. Questi saggi dovrebbero essere utili per scoprire nuovi antagonisti/inibitori dell'ingresso precoce del virus e aiutare ad espandere la portata degli agenti antivirali candidati per l'ulteriore sviluppo di farmaci.

Introduzione

Le infezioni virali sono una minaccia costante per la salute pubblica e una causa significativa di malattie epidemiche, morbilità e decessi in tutto il mondo. Le modalità specifiche di controllo contro le infezioni virali includono lo sviluppo di vaccini e terapie antivirali. Mentre gli sforzi vaccinali si sono dimostrati efficaci nell'immunizzazione contro diversi virus, molti agenti patogeni virali rimangono senza un vaccino protettivo, tra cui il virus della dengue (DENV), il citomegalovirus umano (HCMV), il virus dell'epatite C (HCV), il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) e il virus respiratorio sinciziale (RSV)1-5. Gli antivirali, d'altra parte, svolgono un ruolo importante per la gestione di queste infezioni virali quando i vaccini profilattici non sono disponibili. Tuttavia, ad oggi, sono disponibili solo pochi farmaci antivirali autorizzati ed economici rispetto al numero di agenti patogeni virali che minacciano la salute pubblica. Ancora più importante, a causa dell'aumento dei viaggi globali e della rapida urbanizzazione, la situazione è aggravata dai rischi di focolai epidemici dovuti a infezioni virali emergenti/riemergenti che vengono introdotte in aree non indigene6. Recenti epidemie causate dal virus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS), dai virus influenzali (H1N1, H5N1, H3N2 e H7N9), dal DENV, dal virus del Nilo occidentale (WNV), dal virus del morbillo (MV), dal virus della sindrome respiratoria mediorientale (MERS) e dal virus Ebola6-12 sono tra gli esempi che riflettono la necessità di sviluppare antivirali quando l'immunizzazione e/o le terapie non sono disponibili. Inoltre, c'è sempre un potenziale rischio di generare infezioni resistenti ai farmaci con gli antivirali attualmente utilizzati. Pertanto, il continuo sviluppo e l'espansione della portata degli antivirali per queste infezioni virali emergenti/riemergenti sono necessari per fornire migliori strategie di gestione e salvaguardare la salute pubblica.

La maggior parte delle terapie antivirali consiste in antivirali ad azione diretta (DAA) che prendono di mira una specifica proteina virale o cofattore che media passaggi importanti nel ciclo di vita virale. Ad esempio, l'analogo nucleosidico Acyclovir inibisce l'herpesvirus DNA polimerasi, gli inibitori della proteasi Boceprevir e Telaprevir antagonizzano l'HCV NS3 e Oseltamivir e Zanamivir sono inibitori della neuraminidasi che bloccano il rilascio di particelle del virus dell'influenza dalle cellule infette13-15. Esistono tuttavia pochissimi inibitori dell'ingresso virale autorizzati, tra cui Enfuvirtide, che ha come bersaglio l'HIV gp41 per prevenire la fusione, e Maraviroc, che blocca il co-recettore dell'HIV CCR5, impedendo così l'ingresso virale16. L'esplorazione di nuovi antagonisti/inibitori dell'ingresso virale potrebbe aiutare a fornire ulteriori terapie per uso profilattico o terapeutico, ad esempio in combinazione con altri antivirali con un diverso meccanismo d'azione per gestire meglio le infezioni virali17-19.

L'identificazione degli antivirali può comportare la progettazione di farmaci guidata dalla struttura e una strategia basata sullo screening dei farmaci candidati. I metodi per valutare l'attività antivirale degli agenti in esame comprendono saggi biochimici dell'attività enzimatica e la valutazione mediante sistemi cellulari20-23. Nei sistemi cellulari, il ciclo di vita virale può essere suddiviso in fasi distinte dell'infezione, come gli eventi di ingresso (attaccamento, fusione, srivestimento), la fase di replicazione (replicazione del genoma virale e traduzione delle proteine) e l'uscita del virione (assemblaggio, maturazione e rilascio). Poiché i saggi possono essere adattati per studiare ogni stadio specifico utilizzando vari strumenti e metodi, questo approccio consente l'identificazione/l'esame di potenziali antivirali candidati con un meccanismo d'azione specifico mirato allo stadio distinto analizzato. Ad esempio, per analizzare l'effetto del farmaco in modo specifico sulle particelle virali libere prima del legame con la cellula ospite, è possibile eseguire un "saggio di inattivazione virale". In questo test, il virus viene lasciato incubare con il farmaco in esame e quindi diluito per titolare il farmaco prima di infettare un monostrato cellulare. Ulteriori passaggi come l'attaccamento virale e le fasi di ingresso/fusione possono anche essere analizzati individualmente, spostando la temperatura durante l'infezione. Per molti virus con involucro, l'ingresso/fusione virale nella membrana della cellula ospite è notevolmente facilitato a 37 °C, ma è tipicamente precluso a 4 °C, il che non influisce sul legame del virus24-29. Infine, l'uso di virus reporter o sistemi cellulari potrebbe facilitare questi studi e consentire un'analisi ad alto rendimento.

Abbiamo precedentemente impiegato l'approccio basato su cellule e analizzato l'ingresso precoce di vari virus avvolti per l'esame di composti antivirali che potenzialmente antagonizzano l'ingresso virale30,31. Qui vengono descritti i vari metodi utilizzati, tra cui l'inattivazione virale, l'attaccamento virale e i saggi di ingresso/fusione virale.

Protocollo

Nota: verificare che tutte le procedure che coinvolgono coltura cellulare e l'infezione da virus sono condotte in cappe di biosicurezza certificate che sono appropriati per il livello di biosicurezza dei campioni essere manipolati. Per lo scopo di descrivere i protocolli, Gaussia luciferasi giornalista HCV-tag è usato come modello di virus 32. Nel contesto dei risultati rappresentativi, l'acido composti chebulagic (CHLA) e punicalagin (PUG) sono utilizzati come farmaci antivirali candidati che hanno come target le interazioni glicoproteina virale con glicosaminoglicani superficie cellulare durante la ingresso del virus presto passi 31. Eparina, che è noto per interferire con l'ingresso di molti virus 30,31,33,34, viene usato come trattamento controllo positivo in questo contesto. Per informazioni generali di base sulle tecniche di virologia, la propagazione di virus, determinazione del titolo del virus, e l'espressione della dose infettante in unità formanti placca (PFU), si concentrano unità formanti (FFU), o molteplicità di infezione (MOI), il lettore è reFERRED di riferimento 35. Per esempi precedenti e condizioni ottimizzate utilizzati per virus mostrati nei risultati rappresentativi, si rimanda ai riferimenti 30-32,36-39 e dettagli elencati nella Tabella 1, Figura 1A, 2A e Figura.

Cultura 1. Cella, Preparazione Compound, e Compound citotossicità

  1. Grow rispettiva linea cellulare per il sistema virus da analizzare (Tabella 1). Per HCV, far crescere le cellule Huh-7.5 in modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 200 U / ml di penicillina G, 200 mg / ml di streptomicina, e 0,5 mg / ml di amfotericina B.
  2. Preparare i composti in esame ei controlli utilizzando rispettivi solventi: per esempio, sciogliere CHLA e PUG in dimetilsolfossido (DMSO); preparare eparina in acqua bidistillata sterile. Per tutte le diluizioni successive, utilizzare terreni di coltura.
    Nota: Il concent finalerazione di DMSO nei trattamenti composto in esame è inferiore all'1% negli esperimenti; 1% DMSO è inclusa come trattamento controllo negativo nei saggi di confronto.
  3. Determinare la citotossicità dei composti in esame (per esempio, CHLA e PUG) sulle cellule per l'infezione virale utilizzando una vitalità cellulare determinare reagente come XTT (2,3-bis [2-metossi-4-nitro-5-solfofenil] -5-fenilammino) carbonile] idrossido -2H-tetrazolio):
    1. Per HCV, sementi Huh-7,5 cellule in un piatto da 96 pozzetti (1 × 10 4 cellule per pozzetto) e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% O / N per ottenere un monostrato.
    2. Applicare controllo DMSO (1%) e concentrazioni crescenti dei composti di prova e CHLA PUG (es. 0, 10, 50, 100, e 500 pM) ai pozzetti di coltura in triplice copia.
    3. Incubare a 37 ° C per 72 ore, poi scarta il mezzo in piastra e lavare le cellule con 200 ml di tampone fosfato salino (PBS) due volte.
    4. Aggiungere 100 ml di assaying soluzione dal kit in vitro tossicologia basata XTT ciascun pozzetto ed incubare le piastre a 37 ° C per altri 3 ore per permettere la produzione XTT formazan.
    5. Determinare l'assorbanza con un lettore per micropiastre alla lunghezza d'onda di prova di 492 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 690 nm.
    6. Calcolare la percentuale di cellule sopravvissute utilizzando la seguente formula: vitalità cellulare (%) = A / As × 100%, dove 'A' e 'Come' consultare l'assorbanza dei composti in esame e il controllo solvente (ex 1% DMSO. ) trattamenti, rispettivamente. Determinare la concentrazione di citotossicità cellulare 50% (CC 50) dei composti in esame da un software di analisi come GraphPad Prism secondo il protocollo del produttore.

2. Lettura di infezione virale

Nota: La lettura di infezione virale dipende dal sistema virus impiegato e può comportare metodi come saggi placca o measuring segnali giornalista da virus giornalista-tag. Il metodo per determinare l'infezione giornalista-HCV in base all'attività della luciferasi è descritto di seguito.

  1. Raccogliere i surnatanti dai pozzetti infetti e chiarire a 17.000 xg in una microcentrifuga per 5 minuti a 4 ° C.
  2. Mescolare 20 ml di surnatante di prova a 50 ml di luciferasi substrato dal kit assay luciferasi Gaussia e misurare direttamente con un luminometro secondo le istruzioni del produttore.
  3. Express HCV infettività come log 10 di unità di luce relativa (RLU) per determinare l'inibizione virale (%) e calcolare la concentrazione del 50% efficace (CE 50) dei composti in esame contro l'infezione da HCV utilizzando algoritmi da software GraphPad Prism secondo il protocollo del produttore.

3. disattivazione virale Assay

Nota: esempi di periodo di incubazione e la dose virale per vari virus unri elencati nella Figura 1A. Concentrazioni più elevate del virus possono essere testati aumentando il MOI / PFU.

  1. Seme Huh-7.5 celle in una piastra a 96 pozzetti (1 × 10 4 cellule per pozzetto) e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% O / N per ottenere un monostrato.
  2. Incubare i composti di prova o di controllo (concentrazioni finali sono: CHLA = 50 micron; PUG = 50 micron; eparina = 1,000 mg / ml; DMSO = 1%) con le particelle di HCV a 37 ° C (Figura 1A, 'a lungo termine' ) in un rapporto 1: 1. Ad esempio, per un inoculo del virus 100 ml contenente 1 x 10 4 FFU, aggiungere 100 ml di una diluizione di lavoro 100 mM CHLA; questo produce trattamento CHLA ad una concentrazione finale di 50 mM.
  3. Diluire la miscela virus-farmaco (inefficace) concentrazione "sub-terapeutica" dei composti in esame. Ad esempio, la concentrazione di CHLA inefficace e PUG contro l'HCV è a 1 pM 31; dunquequesto richiede una diluizione di 50 volte della miscela virus farmaco che può essere realizzato con 9,8 ml di mezzo basale (medium di coltura delle cellule con 2% FBS).
    Nota: La diluizione a concentrazione sub-terapeutica impedisce significativa interazione tra i composti di prova e la superficie della cellula ospite e consente l'esame degli effetti del trattamento sui virioni cell-free. Si noti che questa diluizione è dipendente dalla dose-risposta antivirale dei composti in esame contro la particolare infezione virale, ed è determinata prima di eseguire questo particolare test 31.
  4. Per confronto, mescolare il virus con i composti di test e immediatamente diluito (senza periodo di incubazione) alla concentrazione sub-terapeutica prima di infezione (Figura 1A, 'a breve termine').
  5. Aggiungere 100 pl di miscela HCV-farmaco diluito sulla Huh-7.5 monostrato di cellule (la quantità di virus è ora a 1 x 10 2 FFU; finale MOI = 0.01) e incubare per 3 ore a 37 ° C per consentire viraleadsorbimento.
  6. Seguendo l'infezione, rimuovere il inoculi diluito e lavare delicatamente i pozzetti con 200 ml di PBS due volte.
    Nota: Eseguire le lava delicatamente per evitare di sollevare le cellule.
  7. Applicare 100 ml di terreno di base a ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 72 ore.
  8. Analizzare l'infezione risultante analizzando il surnatante per l'attività luciferasi come descritto in '2. Lettura di infezione virale '.

4. Viral Allegato Assay

Nota: esempi di periodo di incubazione e la dose virale per vari virus sono elencati nella Figura 2A, 'allegato'. Concentrazioni più elevate del virus possono essere testati aumentando il MOI / PFU.

  1. Seme Huh-7.5 celle in una piastra a 96 pozzetti (1 × 10 4 cellule per pozzetto) e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% O / N per ottenere un monostrato.
  2. Pre-raffreddare i monostrati cellulari in piastre a 4 ° C for 1 ora.
  3. Co-trattare le cellule con HCV inoculo (MOI = 0.01) e composti di prova o controlli (concentrazioni finali sono: CHLA = 50 mM; PUG = 50 mM; eparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) a 4 ° C per 3 ore. Ad esempio, per un inoculo del virus 90 ml contenente 1 x 10 2 FFU, aggiungere 10 ml di una diluizione di lavoro 500 mM CHLA; questo produce trattamento CHLA ad una concentrazione finale di 50 mM e un'infezione da HCV a MOI = 0.01 sul monostrato cellulare.
    Nota: È importante effettuare l'esperimento a 4 ° C in quanto consente per il legame del virus, ma preclude ingresso che si verifica più efficiente a 37 ° C. Effettuare l'aggiunta di composti di virus e di test su ghiaccio e la conseguente incubazione in un 4 ° C frigorifero per garantire che la temperatura è mantenuta a 4 ° C.
  4. Rimuovere il surnatante e lavare delicatamente il monostrato cellulare con 200 ml di ghiacciata PBS due volte.
    Nota: Eseguire le lava delicatamente per evitare di sollevare le cellule <./ li>
  5. Applicare 100 ml di terreno di base a ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 72 ore.
  6. Analizzare l'infezione risultante analizzando il surnatante per l'attività luciferasi come descritto in '2. Lettura di infezione virale '.

5. Viral Entrata / Fusion Assay

Nota: Esempio di periodi di incubazione e la dose virale per vari virus sono elencati nella Figura 2A 'Entry / fusione'. Concentrazioni più elevate del virus possono essere testati aumentando il MOI / PFU.

  1. Seme Huh-7.5 celle in una piastra a 96 pozzetti (1 × 10 4 cellule per pozzetto) e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% O / N per ottenere un monostrato.
  2. Pre-raffreddare i monostrati cellulari in piastre a 4 ° C per 1 ora.
  3. Infettare le cellule con HCV (MOI = 0,01) a 4 ° C per 3 ore. Ad esempio, utilizzare un inoculo del virus 100 ml contenente 1 x 10 2 FFU.
    Nota: Eseguire la addizione dell'inoculo virale su ghiaccio e la conseguente incubazione in un 4 ° C frigorifero per mantenere la temperatura a 4 ° C, che permette virale entrata ma non vincolante.
  4. Rimuovere il surnatante e lavare delicatamente i monostrati cellulari con 200 ml di ghiacciata PBS due volte.
    Nota: Eseguire le lava delicatamente per evitare di sollevare le cellule.
  5. Trattare i pozzetti con i composti in esame o controlli (concentrazioni finali sono: CHLA = 50 mM; PUG = 50 mM; eparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) e incubare a 37 ° C per 3 ore. Ad esempio, aggiungere 10 ml di una diluizione di lavoro di 500 micron CHLA a 90 ml di media, mescolare, e trattare i pozzetti; questo produce trattamento CHLA ad una concentrazione finale di 50 mM.
    Nota: Il passaggio da 4 ° C a 37 ° C facilita ora l'evento di ingresso / fusione virale e quindi permette la valutazione dell'effetto composti di prova 'su questo particolare punto.
  6. Aspirare il surnatante contenente droga e rimuovere non interiorizzatovirus extracellulari né dal lavaggio con 200 ml di tampone citrato (citrato di sodio 50 mM, cloruro di potassio 4 mM, pH 3,0) o PBS. Applicare 100 ml di terreno di base prima di incubazione a 37 ° C per 72 ore.
  7. Analizzare l'infezione risultante analizzando il surnatante per l'attività luciferasi come descritto in '2. Lettura di infezione virale '.

Risultati

Nella figura 1, il 'inattivazione virale test' stata effettuata per verificare se due specifici composti CHLA naturale e PUG potrebbero inattivare i diversi virus con involucro in stato senza cellulare e prevenire l'infezione successiva. La citotossicità e antivirale dose-risposta di questi composti sono stati determinati prima di eseguire lo studio meccanicistica 31. I virus sono stati pretrattati con composti in esame e poi le miscele virus-farmaco sono stati diluiti a concentrazioni sub-terapeutiche prima dell'inoculazione sul rispettivo monostrato cellulare per ogni sistema virus. Come mostrato in Figura 1, sia CHLA e PUG sembravano interagire con i virioni cellule libere, con gravi effetti irreversibili che proteggeva il monostrato cellulare dalla successiva infezione. I due composti in esame ha realizzato un vicino di inibizione 100% contro HCMV, HCV e DENV-2, mentre un 60 - blocco 80% è stata osservata contro MV e RSV. Questi risultati Suggest che CHLA e PUG hanno un impatto diretto su queste particelle virali libere inattivando loro e neutralizzando la loro infettività.

Nella figura 2, l'allegato e di ingresso / test di fusione sono stati eseguiti per esplorare l'effetto di CHLA e PUG contro questi eventi rapida entrata correlati virali da HCMV, HCV, DENV-2, MV, e RSV. Sia CHLA e PUG efficacemente impedito vincolante del virus esaminati sui rispettivi cellula ospite come mostrato dalla inibizione virale risultante (Figura 2, 'Allegato': luce barre grigie). L'effetto inibitorio sulla attaccamento virus da entrambi i composti era simile contro HCMV (Figura 2B), HCV (Figura 2C), DENV-2 (Figura 2D), e RSV (Figura 2F), che vanno da 90 - 100%. D'altra parte, PUG sembrava essere più efficace contro CHLA MV assorbente (figura 2E), con il tasso di inibizione della two composti variabili tra 50 - 80%. L'eparina trattamento di controllo, che è noto per impedire l'ingresso di molti virus, anche inibito attaccamento di HCMV, DENV-2, RSV, annuncio MV, ma era meno efficace contro HCV. La conseguente 'test di ingresso / fusione virale' esaminato se CHLA e PUG conservato la loro attività durante la fase di entrata del virus / fusione (Figura 2, 'Entry / Fusion': barre grigio scuro). Ancora una volta, sia CHLA e PUG stati osservati compromettere efficacemente l'ingresso virale passo / fusione dei virus esaminati (Figura 2B - F), ottenendo un 50 - effetto protettivo 90% corrisponde monostrato cellulare. Eparina anche potentemente inibito l'ingresso / fusione DENV-2 e infezioni da RSV, ma era meno efficace contro HCMV, HCV, e MV (<40% di inibizione in media).

Virus Tipo di cella
HCMV HEL
HCV Huh-7.5
DENV-2 Vero
MV CHO-SLAM
RSV HEp-2

Tabella 1:. Tipo cellula ospite per infezione virale è indicato il tipo cellulare utilizzato per ogni sistema infezione virale descritto nei risultati rappresentativi. Ulteriori dettagli riguardanti le cellule possono essere trovati in riferimento 31.

figure-results-1
Figura 1. L'inattivazione di infezioni virali da parte CHLA composti di prova e PUG diversi virus sono stati trattati con i composti di prova per un lungo periodo. (Incubate per 1,5-3 ora prima titolazione; luce barre grigie) o breve periodo (immediatamente diluita; grigio scuro bar) a 37 ° C prima di una diluizione di concentrazione sub-terapeuticizione e successiva analisi di infezione delle cellule rispettivo ospitanti. (A) Schema dell'esperimento (mostrato a sinistra) con la concentrazione di virus finale (PFU / pozzetto o MOI), il periodo di incubazione del virus farmaco-lungo termine (i), e tempo di incubazione successivo (ii) indicato per ciascun virus nella tabella a destra. Analisi per (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, e (F) RSV sono indicati in ogni pannello supplementare. I risultati sono riportati contro il trattamento di controllo negativo DMSO per infezione da virus ed i dati indicati sono il mezzo ± errori standard della media (SEM) da tre esperimenti indipendenti. Questa cifra è stata modificata da riferimento 31. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2. Valutazione delle attività antivirale del CHLA composti di prova e PUG contro virus e attaccamento entrata / fusion. (A) La procedura sperimentale, concentrazione virale (PFU / pozzetto o MOI), e il tempo di aggiunta e trattamento con i composti in esame (i, ii, iii) sono presentati per ogni virus negli schemi e le tabelle associate. Nell'analisi allegato virus (luce barre grigie), monostrati di diversi tipi cellulari sono stati pre-raffreddato a 4 ° C per 1 ora, poi co-trattati con rispettivi virus e composti di prova a 4 ° C (1.5 - 3 ore; i) prima di lavare via i monostrati e composti di prova per la successiva incubazione (37 ° C; ii) e l'esame di infezione da virus. In entrata virus / analisi fusione (barre grigio scuro), monostrati di cellule sono stati seminati pre-raffreddata a 4 ° C per 1 ora e poi sfidato con rispettivi virus a 4 ° C per 1,5 - 3 ore (i). Le cellule sono state poilavata e trattata con i composti di prova per un periodo di incubazione addizionale (ii) durante il quale la temperatura è stata spostata a 37 ° C per facilitare l'evento di ingresso / fusione virale. Al termine dell'incubazione, virus extracellulari sono stati rimossi da uno tampone citrato (pH 3,0) o lavaggi PBS e le cellule sono state ulteriormente incubate (iii) per l'analisi di virus. Risultati per (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, e (F) RSV sono indicati in ogni pannello supplementare. I dati sono riportati contro il trattamento di controllo negativo DMSO di infezione da virus e sono presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. Questa cifra è stata modificata da riferimento 31. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

In questo rapporto sono stati descritti i metodi per identificare e valutare i composti antivirali basati su un approccio meccanicistico di sezionamento degli eventi di ingresso virale precoce. In particolare, i saggi ci hanno permesso di esaminare l'effetto dei composti in esame sulle particelle virali libere, sull'attaccamento virale e sull'ingresso/fusione virale. Sono state implementate misure critiche per valutare distintamente l'effetto del farmaco sullo stadio specifico dell'ingresso precoce del virus. Ad esempio, nel "saggio di inattivazione virale", la diluizione della miscela virus-farmaco a una concentrazione sub-terapeutica impedisce un'interazione significativa tra il composto in esame e la superficie della cellula ospite "titolando" il farmaco. Ciò garantisce che l'effetto inibitorio osservato sulla successiva infezione della cellula ospite sia dovuto a un'interazione diretta tra il composto in esame e i virioni liberi da cellule, piuttosto che a un effetto del composto in esame sulla membrana della cellula ospite o sulle molecole associate alla membrana, compresi i recettori virali30. Analogamente, lo spostamento della temperatura tra 4 °C (che consente il legame ma non l'ingresso del virus) e 37 °C (che facilita l'ingresso/fusione del virus) nel "saggio di attacco virale" e nel "saggio di ingresso/fusione virale" è fondamentale per determinare l'effetto del composto in esame su ciascuno di questi eventi specifici. Ciò è possibile a causa della sensibilità alla temperatura dei virus avvolti durante queste fasi dell'infezione24-29. È quindi importante che i saggi vengano eseguiti alla temperatura indicata per garantire l'accuratezza dei risultati; ad esempio, effettuando l'esperimento su ghiaccio per mantenerlo a 4 °C e posizionando il campione direttamente in un incubatore a 37 °C per lo spostamento della temperatura. Inoltre, l'uso di controlli negativi (es. solvente DMSO per la preparazione dei farmaci) e positivi (es. trattamento con eparina) aiutano a stabilire ulteriormente l'accuratezza dei test. L'utilità e l'applicabilità di tali metodi sono state dimostrate in molti studi antivirali26,30,31,40,41. Si noti che, sebbene l'eparina sia inclusa come controllo per tutti e tre i test nel contesto dei risultati rappresentativi, in genere blocca il legame iniziale del virus piuttosto che la successiva fase di fusione/ingresso (come riflesso dai dati nella Figura 2). Potrebbero essere utilizzati anche controlli aggiuntivi, come gli anticorpi neutralizzanti diretti contro il virus (per il test di inattivazione virale), gli anticorpi che mascherano i recettori della superficie cellulare per il virus (per il test di attaccamento virale) e gli inibitori della fusione di membrana (per il test di fusione/ingresso virale).

I saggi descritti in questo rapporto, che sono specifici per le prime fasi dell'infezione virale, sono utili in termini di applicazione come test secondari per caratterizzare il meccanismo d'azione dei farmaci candidati dagli screening primari che tipicamente mirano all'infezione virale in modo più ampio. In alternativa, potrebbero anche essere incorporati negli screening primari se si è specificamente alla ricerca di inibitori dell'ingresso precoce del virus, inclusi agenti inattivanti del virus, antagonisti dell'attaccamento virale e inibitori dell'ingresso/fusione virale. In questo caso, il loro utilizzo consente un'analisi dello schermo più mirata e precisa per l'identificazione di candidati antivirali meccanismo-specifici, che, a sua volta, accelererebbe lo sviluppo di farmaci a valle.

L'uso di saggi basati su cellule per identificare gli agenti antivirali offre diversi vantaggi importanti rispetto ai saggi biochimici, tra cui la rivelazione di potenziali effetti off-target (come la citotossicità) e l'aggiunta di rilevanza fisiologica alla bioattività degli agenti in esame42. Questi aspetti sono considerazioni importanti per decidere se un agente candidato è di valore per la continuazione nelle fasi successive dello sviluppo del farmaco. Analogamente, i saggi specifici per l'ingresso virale precoce descritti in questo rapporto consentono di esaminare l'effetto del farmaco sullo stadio di ingresso virale distinto a livello cellulare, e più specificamente nel contesto di un'autentica infezione virale in vitro. I risultati ottenuti da tali saggi aiuterebbero quindi a prevedere meglio l'efficacia antivirale dei composti in esame e a identificare anche gli effetti potenzialmente indesiderati fuori bersaglio contro la cellula ospite. Un potenziale limite, tuttavia, è che un test in vitro basato su cellule potrebbe non riflettere completamente l'effettiva fase di ingresso in vivo nel contesto di un'infezione virale naturale. Ciononostante, i saggi presentati in questo protocollo fungono da piattaforma analitica per l'identificazione e la valutazione basata su meccanismi di nuovi agenti antivirali.

Lo sviluppo di virus reporter o sistemi cellulari reporter per quantificare la quantità di infezione virale ha notevolmente facilitato lo screening e la valutazione dei composti antivirali su base cellulare. Gli esempi includono l'uso di virus ricombinanti portatori di un gene reporter o per mezzo di linee cellulari umane ricombinanti contenenti un gene reporter guidato dal promotore specifico del virus31,43. In questo rapporto, l'infezione da HCV marcato con luciferasi può essere facilmente monitorata quantificando il segnale reporter, facilitando così l'analisi dei dati. Incorporando questi utili strumenti basati su reporter, i saggi di ingresso virale precoce qui descritti possono essere essenzialmente adattati in un formato ad alto rendimento per lo screening basato su meccanismi di librerie di piccole molecole.

In conclusione, è stato descritto un protocollo per i saggi che sezionano l'ingresso virale precoce come mezzo per identificare e valutare i composti antivirali meccanismo-specifici. Tali saggi sarebbero utili per scoprire nuovi antagonisti/inibitori dell'ingresso virale e contribuirebbero ad ampliare la portata degli agenti antivirali per lo sviluppo come trattamenti profilattici e/o terapeutici.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non esistono interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo studio è supportato da finanziamenti del Taipei Medical University Hospital (102TMU-TMUH-19) e del Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMGIBCO11995-040
FBSGIBCO26140-079
Penicillina-StreptomicinaGIBCO15070-063
Amfotericina BGIBCO15290-018
DMSOSigmaD5879
Kit di test tossicologici in vitro,SigmaTOX2
basato su XTTPBS pH 7,4 GIBCO10010023
Lettore di micropiastreThermo Scientific89087-320
MicrocentrifugaThermo Scientific75002420
Kit per il dosaggio della luciferasi BioLux Gaussia NewEngland BiolabsE3300L     
LuminometroPromegaGloMax-20/20
Citrato di sodio, diidratoSigma71402
Cloruro di potassioSigmaP5405

Riferimenti

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