Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Andrew Nickerson; Tao Huang; Li-Jung Lin; Xioalin Nan

doi:10.3791/53154

Articolo metodologico

Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

DOI:

10.3791/53154

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22 dicembre 2015

Andrew Nickerson¹^,²^,³ , Tao Huang¹^,²^,³ , Li-Jung Lin¹^,²^,³ , Xioalin Nan¹^,²^,³

¹Department of Biomedical Engineering, Oregon Health and Science University, ²Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, ³OHSU Center for Spatial Systems Biomedicine, Oregon Health and Science University

In questo articolo

Sommario

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Le interazioni proteina-proteina vengono visualizzate in cellule con risoluzione spaziale nanometrica combinando la complementazione a fluorescenza bimolecolare (BiFC) con la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM). Qui viene descritto l'uso di BiFC-PALM per l'imaging delle interazioni Ras-Raf nelle cellule U2OS per visualizzare il clustering e la diffusione su scala nanometrica di singoli complessi Ras-Raf.

Abstract

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Le interazioni proteina-proteina (PPI) sono eventi molecolari chiave per la biologia. Tuttavia, rimane una sfida visualizzare i PPI con risoluzione e sensibilità sufficienti nelle cellule, perché la risoluzione della microscopia ottica convenzionale è limitata alla diffrazione a ~250 nm. Combinando la complementazione a fluorescenza bimolecolare (BiFC) con la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM), i PPI possono essere visualizzati in cellule con sensibilità a singola molecola e risoluzione spaziale nanometrica. BiFC è una tecnica comunemente usata per visualizzare i PPI con contrasto di fluorescenza, che comporta la scissione di una proteina fluorescente in due frammenti non fluorescenti. PALM è una recente tecnica di microscopia a superrisoluzione per l'imaging di campioni biologici su scala nanometrica e di singola molecola, che utilizza sonde fluorescenti fototrasformabili come le proteine fluorescenti fotoattivabili (PA-FP). BiFC-PALM è stato dimostrato dividendo PAmCherry1, un PA-FP compatibile con PALM, per la sua natura monomerica, la buona luminosità di una singola molecola, l'elevato rapporto di contrasto e l'utilità per le misure stechiometriche. Se diviso tra gli amminoacidi 159 e 160, PAmCherry1 può essere trasformato in una sonda BiFC che si ricostituisce in modo efficiente a 37 °C con un'elevata specificità per i PPI e una bassa ricostituzione aspecifica. L'interazione Ras-Raf viene utilizzata come esempio per mostrare come BiFC-PALM aiuti a sondare le interazioni su scala nanometrica e con risoluzione di una singola molecola. La loro diffusione può essere tracciata anche in cellule vive utilizzando il tracciamento di singole molecole (smt-) PALM. In questo protocollo, vengono discussi i fattori da considerare durante la progettazione delle proteine di fusione per BiFC-PALM, vengono spiegate la preparazione del campione, l'acquisizione delle immagini e le fasi di analisi dei dati e vengono presentati alcuni risultati esemplari. Fornendo un'elevata risoluzione spaziale, specificità e sensibilità, BiFC-PALM è uno strumento utile per lo studio dei PPI in campioni biologici intatti.

Introduzione

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Interazioni proteina-proteina (PPI) sono fondamentali per la biologia ¹ e sono strettamente regolati attraverso meccanismi spazio-temporali attraverso molte tempo e lunghezza scale. Gli studi sulla segnalazione cellulare sulla membrana cellulare, ad esempio, hanno rivelato dinamici, scompartimenti spaziali nanoscala che facilitano PPI specifici e processi cellulari ^2. Quindi, la capacità di sondare PPI nei sistemi biologici con risoluzioni sufficienti spaziali e temporali, alta specificità e sensibilità elevata è la chiave per raggiungere una comprensione meccanicistica della biologia.

Biomolecolare fluorescenza comp....

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Protocollo

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1. Clonazione

Determinare le configurazioni per clonare e scegliere un linker. Proteine tag con i frammenti sul N- o C-terminale come descritto di seguito in modo da non interrompere la loro localizzazione corretta. Utilizzare un linker flessibile come (GGGGS) x2.
Geneticamente contrassegnare le proteine di interesse ai frammenti PAmCherry1. Come un'opzione, utilizzare i plasmidi clonazione elencate nella Lista dei materiali contenente il frammenti RN (residui PAmCherry1 1-159) e RC (Met più residui PAmCherry1 160-236) con sequenze fiancheggianti MCS.
1. Linearizzare i plasmidi contenenti i frammenti RN e RC con inversa PCR (o restr....

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Risultati

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L'esempio BiFC-PALM mostrata è KRAS G12D mutante interagire con Ras legame dominio (RBD) del CRAF (Figura 1A). Come discusso, la RN o frammenti RC non contrassegnati al C-terminale di Ras perché interromperebbe la localizzazione di membrana e quindi l'attività biologica di Ras. Questo riduce le possibili combinazioni da otto a quattro (Figura 1B). Ciascuno di questi quattro combinazioni stato introdotto in cellule U2OS utilizzando infezione lentivirale. Le cellule sono state fissate com.......

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Discussione

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BiFC è una tecnica comunemente usata per il rilevamento e la visualizzazione PPI nelle cellule, mentre PALM è una recente tecnica di microscopia molecola SuperResolution unico che permette l'imaging su nanoscala di campioni biologici intatti. La combinazione di BiFC con PALM raggiunto l'imaging selettivo di PPI all'interno di una cella con nanometrica risoluzione spaziale e sensibilità singola molecola. BiFC-PALM estende l'utilità di entrambe le tecniche, e come dimostrato in questo lavoro, mostra una gr.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano i dottori Steven Chu e Joe W. Gray per le utili discussioni, Henry Marr per il suo lavoro iniziale sul progetto BiFC-PALM e Alexis Shoemaker per la sua assistenza tecnica. Questo lavoro è supportato da fondi di avvio a X.N. da OHSU. La ricerca nel laboratorio Nan è stata supportata anche dal NIH 5U54CA143836-05, dalla Damon Runyon Cancer Research Foundation, dal MJ Murdock Charitable Trust e dalla società FEI.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Telaio per microscopio	Nikon	Ti-U
60X obiettivo TIRF a immersione in olio con 1,49 NA	Nikon	CFI Apo TIRF 60x H
Fotocamera EMCCD	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Opto Engine	MGL-FN-561
405 nm laser	Coherent	CUBE-405 50mW
561 nm specchio	dicroicoSemrock	Filtro Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm filtro notch	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperatura e CO₂ stadio controllato	Tokai Hit	INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
Reagente di trasfezione X-tremeGENE	Roche	13873800
Lab-Tek II Coverglass a camera	Thermo Scientific	155409	#1.5 piastre con fondo in vetro
Celle U2OS	ATCC	HTB-96
293T/17 celle	ATCC	CRL-11268
DMEM con rosso fenolo	Life Technologies	11995
DMEM senza rosso fenolo	Life Technologies	21063
Siero fetale bovino	Life Technologies	10082
L-15 di Leibovit, senza rosso fenolo	Life Technologies	21083-027
Siero ridotto medium	Life Technologies	31985
Soluzione salina tamponata con fosfato	Life Technologies	14040
Siringa	BD Biosciences	309604
Filtro per siringa	Millipore	SLHV033RB
Concentratore lentivirale	Clontech	631231
Concentratore retrovirale	Clontech	631455
coltura da 10 cm piatto	BD Biosciences	353003
piastra di coltura a 6 pozzetti	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromicina	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomicina
Doxiciclina	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
sodio	Sigma	S5881
Paraformaldeide	Sigma	158127
Glutaraldeide	Sigma	G6257
TUBI	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Solfato di magnesio	Sigma	M2643
Idrossido di potassio	Sigma	221473
Cloruro di sodio	Fisher	BP358
Cloruro di magnesio	Fisher	M33
100 nm particelle d'oro	BBI Soluzioni	EM. GC100
Acqua di grado molecolare	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
Kit di purificazione PCR	Qiagen	28104
Kit Miniprep	Qiagen	27104
Kit Midiprep	Macherey-Nagel	740410
Provette per microcentrifuga da 0,6 ml	Fisher	05-408-120
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml	Fisher	05-408-137
Provette da 15 ml	Fisher	05-539-12
Provette da 5 ml in polipropilene a fondo tondo	BD Biosciences	352063
14 ml in polipropilene provette a fondo tondo	BD Biosciences	352059
tubo da 50 ml	BD Biosciences	352070
Provetta per PCR	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB brodo	BD Biosciences	244610
Kanamicina solfato	Fisher	BP906
Cellule competenti	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks

Idrossido di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation.

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Interazioni proteina proteina tracciamento di singole molecole microscopia a super risoluzione risoluzione spaziale nanometrica imaging di cellule vive frammenti di proteine fluorescenti sonde fototrasformabili interazione Ras Raf

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