Articolo metodologico

Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca 2+ E transmembrana potenziale nel Rabbit Heart Langendorff-perfuso

DOI:

10.3791/53166

⸱

10 settembre 2015

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California Davis, 2Departments of Pharmacology and Biomedical Engineering, University of California Davis

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo viene descritto il protocollo dettagliato e le attrezzature necessarie per la mappatura ottica doppio di transmembrana potenziale (V m) e senza reticolo intra-sarcoplasmatico (SR) Ca 2+ nel cuore di coniglio Langendorff-perfusione. Questo metodo consente l'osservazione diretta e la quantificazione delle Vm e SR Ca 2+ dinamica nel cuore intatto.

Abstract

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'La manipolazione del Ca2+ del reticolo sarcoplasmatico (SR) svolge un ruolo chiave nel normale accoppiamento eccitazione-contrazione e la manipolazione aberrante del Ca2+ SR è nota per svolgere un ruolo significativo in alcuni tipi di aritmia. Poiché le aritmie sono fenomeni emergenti spazialmente distinti, devono essere studiate a livello tissutale. Tuttavia, i metodi per sondare direttamente il Ca2+ SR nel cuore intatto rimangono limitati. Questo articolo descrive il protocollo per la doppia mappatura ottica del potenziale transmembrana (Vm) e del libero intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) nel cuore di coniglio perfuso da Langendorff. Questo approccio sfrutta l'indicatore Ca2+ a bassa affinità Fluo-5N, che ha una fluorescenza minima nel citosol dove [Ca2+] intracellulare ([Ca2+]i) è relativamente bassa ma mostra una fluorescenza significativa nel lume SR dove [Ca2+]SR è nell'intervallo millimolare. Oltre a rivelare le caratteristiche della SR Ca2+ spazialmente attraverso la superficie epicardica del cuore, questo approccio ha il netto vantaggio del monitoraggio simultaneo di Vm, consentendo indagini sulla relazione bidirezionale tra Vm e SR Ca2+ e sul ruolo di SR Ca2+ nei fenomeni aritmogeni.

Introduzione

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La doppia mappatura ottica del Ca2+ intracellulare e del potenziale transmembrana (Vm) nel cuore intatto perfuso di Langendorff è diventata un pilastro delle indagini in elettrofisiologia cardiaca, compresi i meccanismi di aritmia e l'accoppiamento eccitazione-contrazione1-4. Questo approccio ha fornito conoscenze senza precedenti sull'elettrofisiologia normale e anormale e, soprattutto, sulla relazione bidirezionale tra Vm e Ca2+ intracellulare. Tuttavia, la mappatura ottica del Ca2+ intracellulare con indicatori fluorescenti ad alta affinità (come Rhod-2 e Fluo-4) riporta solo i cambiamenti di massa nel Ca2+ intracellulare e non è in grado di distinguere se questi cambiamenti sono dovuti al flusso, al rilascio e alla ricaptazione del Ca2+ transmembrana nei depositi intracellulari o, nella maggior parte dei casi, a una combinazione di entrambi. Inoltre, gli indicatori di Ca2+ ad alta affinità hanno una cinetica on-off lenta e potrebbero non riportare con precisione rapidi cambiamenti nella concentrazione di Ca2+ 5.

Ogni potenziale d'azione innesca un aumento del Ca2+ intracellulare, noto come transitorio intracellulare del Ca2+ (CaT). Nel cuore dei mammiferi, circa il 70-90% del CaT totale è dovuto al rilascio di Ca2+ dal reticolo sarcoplasmatico (SR) attraverso l'apertura dei recettori della rianodina (RyR)6. All'interno della SR, circa la metà del Ca2+ totale è legato alla calsequestrina (CSQ) e ad altri tamponi intra-SR7, che svolgono un ruolo importante nell'omeostasi del Ca2+ SR8,9. La quantità di SR Ca2+ libera determina la forza trainante per il rilascio di SR Ca2+ e il gating di RyR, e quindi ha un impatto significativo sul CaT intracellulare. Inoltre, alterazioni nel rilascio o nella ricaptazione di SR Ca2+ possono, a loro volta, avere un impatto su Vm attraverso lo scambio elettrogenico Na+-Ca2+, che può avere conseguenze aritmogene. Pertanto, oltre al CaT, il monitoraggio del Ca2+ libero può fornire importanti informazioni sulla disfunzione contrattile ed elettrofisiologica.

Negli ultimi anni, i ricercatori hanno fatto progressi significativi nel monitoraggio del Ca2+ SR nei miociti cardiaci isolati e da un'unica posizione sul cuore intatto. Uno di questi metodi richiede rapidi impulsi di caffeina per aprire i RyR e il contenuto di SR Ca2+ viene quindi dedotto o calcolato dall'aumento immediato di Ca2+10 intracellulare. Un altro approccio intrigante utilizza indicatori di Ca2+ a bassa affinità, come Fluo-5N11 o Mag-Fluo412, che si legano al Ca2+ SR libero. Questi indicatori hanno costanti di dissociazione (Kd) nell'intervallo 10 – 400 μM e quindi mostrano una fluorescenza minima nel citosol rispetto al lume SR, dove la concentrazione di Ca2+ ([Ca2+]SR) è nell'intervallo millimolare. Utilizzando indicatori di Ca2+ a bassa affinità, sono stati studiati diversi aspetti del ciclo del Ca2+ SR a livello del miocita isolato, tra cui il rilascio frazionario di Ca2+ e i meccanismi delle alternanze di Ca2+ 13,14. Tuttavia, al fine di comprendere appieno la natura eterogenea del ciclo SR Ca2+ nel cuore intatto e il ruolo di SR Ca2+ nei fenomeni aritmici spazialmente distinti, sono necessari metodi per l'imaging di SR Ca2+ attraverso la superficie epicardica del cuore intatto15.

Questo articolo descrive la metodologia per la doppia mappatura ottica di SR libero Ca2+ e Vm nel cuore di coniglio perfuso con Langendorff intatto con l'indicatore Ca2+ a bassa affinità Fluo-5N. Oltre a rivelare le caratteristiche della SR Ca2+ spazialmente attraverso la superficie epicardica del cuore, questo approccio ha il vantaggio del monitoraggio simultaneo di Vm, consentendo indagini sulla relazione bidirezionale tra Vm e SR Ca2+.

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Protocollo

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Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Animale dell'Università di California, Davis, e aderito alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicato dal National Institutes of Health.

1. Preparazione

  1. Preparare due (25X) le scorte concentrati di soluzione Tyrode modificato in anticipo e conservare a 4 ° C: (1) Stock I (in mm: NaCl 3205, CaCl 2 32.5, KCl 117,5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl 2 26.25) e (2) Stock II (in mM: NaHCO3 500).
    1. Appena preparare la soluzione di 2 L Tyrode della seguente composizione (in mM): NaCl 128,2, CaCl 2 1,3, KCl 4,7, MgCl 2 1.05, NaH 2 PO 4 1.19, NaHCO3 20 e glucosio 11,1 combinando 1840 ml di acqua deionizzata (DI) acqua, 80 ml Stock I, 80 ml di Fotografico II, e 4 g di glucosio. Non miscelare direttamente I Stock e della II; aggiungere ilm 1.840 ml DI per evitare la precipitazione.
  2. Preparare soluzione di riserva della eccitazione-contrazione disaccoppiatore blebbistatin a 10 mg / ml in anidra di-methylsulfoxide (DMSO) in anticipo e conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
  3. Preparare soluzioni di coloranti fluorescenti: (1) RH237 tensione sensibili dye (1 mg / ml in DMSO) e (2) Indicatore di affinità calcio Fluo-5N AM (2 mg / ml in DMSO) secondo le raccomandazioni del fabbricante. Utilizzare immediatamente i preparativi per evitare la decomposizione, con conseguente perdita di capacità di carico.
  4. Prime il ricircolo sistema di perfusione Langendorff con ossigenata (95% O 2, 2 5% di CO) soluzione Tyrode. Regolare il flusso di O 2 / CO 2 per mantenere il pH della soluzione di Tyrode a 7,4 ± 0,05. Utilizzare un filtro a rete in filo di nylon tessuto (dimensione dei pori: 11 micron) per filtrare continuamente il perfusato.
    1. Prime il sistema di perfusione a temperatura ambiente, come la successiva loading di Fluo-5N AM viene eseguita a temperatura ambiente. Per Fluo-5N AM caricamento, utilizzare un piccolo volume di ricircolo perfusato (~ 150 ml). Dopo colorante carico, utilizzare un volume maggiore di perfusato (1 - 2 L, vedere Figura 1C).
  5. Accendere il sistema di acquisizione dati e di preparare per il monitoraggio continuo di ECG e pressione di perfusione. Preparare il sistema di pressione di monitoraggio: collegare un trasduttore di pressione alla linea di perfusione e monitorare la pressione di perfusione con un amplificatore transbridge. Regolare la pressione di perfusione basale a 0 mmHg quando il cuore non è collegato al sistema di perfusione.
  6. Allineare le telecamere di mappatura ottica per garantire l'allineamento spaziale tra il V m e SR Ca 2 + segnali.
    1. In primo luogo, mettere a fuoco le telecamere posizionando un sovrano o di un oggetto con il testo nel piatto perfusione. Girare le telecamere di mapping in una modalità di visualizzazione dal vivo e regolare la messa a fuoco fino a quando il testo è nitido e chiaro. Acquisire un'immagine singolo fotogramma da ogni telecamera.
    2. Sovrapposizionequeste immagini e regolare la trasparenza dell'immagine superiore in modo che entrambe le immagini sono visibili. Il testo delle immagini dovrebbe sovrapporsi esattamente. Se non perfettamente allineati, regolare l'angolo dello specchio dicroico o la posizione di ciascuna telecamera fino a quando le due immagini vengono allineate.

2. la raccolta, Perfusione, e Dye-caricamento di Rabbit Heart

  1. Fissare il coniglio in un dispositivo di immobilizzazione di coniglio approvato. Profondamente anestetizzare tramite iniezione endovenosa (vena marginale dell'orecchio) di sodio pentobarbital (50 mg / kg) ed eparina (1000 IU).
    1. Quando viene visualizzato il coniglio mancanza di riflessi nocicettivi, fare una incisione cutanea mediana per esporre lo sterno e costole. Tagliare lo sterno con blunt punta forbici chirurgiche dal xifoidea al manubrio. Fare attenzione a non danneggiare il cuore durante l'apertura dello sterno. Stendere le costole per esporre il cuore.
    2. Accise rapidamente l'intero blocco cuore-polmone per rapidamente tagliando tutte le navi e tessuto connettivo. Immediatamente posizionare il blocco cuore-polmone in soluzione Tyrode ghiacciata.
  2. Individuare l'aorta per perfusione retrograda. Tagliare l'aorta ascendente prossimale solo per i tre rami dell'arco aortico. Incannulare l'aorta di una cannula 8 G connesso al sistema di perfusione. Usare un pezzo di USP sutura di seta 0 per fissare l'aorta sulla cannula.
  3. Sezionare con cura la trachea, polmoni, e il grasso epicardico dal cuore. Con una pinza taglienti e forbici dissezione, localizzare la valvola mitrale e accuratamente danneggiare o rimuovere un foglio per prevenire la congestione soluzione nel ventricolo sinistro.
  4. Immergere il cuore nella camera di perfusione di vetro rivestito orizzontalmente con la superficie anteriore del cuore rivolto verso l'alto per l'imaging. Fissare la cannula di un pezzo di Sylgard con perni a forma di U sul fondo del piatto di silicio per impedire il movimento del cuore durante la mappatura (Figura 1D). Se lo si desidera, inserire un piccolo perno insetto all'apice del cuore per STAbilization.
  5. Posizione elettrocardiogramma (ECG) elettrodi nel bagno sul lato destro e sinistro del cuore. Immergere completamente gli elettrodi nel bagno e assicurarsi che non sono in contatto con la superficie del cuore di fornire un ECG volume analogo condotto ad una configurazione che piombo. Verifica di un lead normale che ECG morfologia. Regolare il flusso (25 - 35 ml / min) per garantire che la pressione aortica è mantenuta a 60 - 70 mmHg.
  6. Spegnere le luci della stanza e aggiungere ,3-0,6 ml di soluzione madre blebbistatin (passo 1.2) al perfusato (concentrazione finale 10-20 micron).
    1. Spegnere luci della stanza per evitare photoinactivation di blebbistatin. Se necessario, una piccola riflettore o proiettore possono essere utilizzati per fornire l'illuminazione di operazione.
      Nota: blebbistatin è un inibitore ATPasi miosina e un disaccoppiatore eccitazione-contrazione. Perché Fluo-5N di carico richiede estesi (60 min) RT (ipotermia) le condizioni (vedi i punti 2.8 - 2.10), la produzione di energia cardiaco può essere compromessa. Therefore, l'aggiunta di blebbistatin nella prima perfusato per tingere di carico può ridurre la domanda di energia 16 ed eliminare gli artefatti da movimento durante le successive registrazioni ottiche 17.
  7. Quando la contrazione del cuore ha cessato (10 - 15 min, verificato sulla registrazione pressione aortica), passare al sistema di ricircolo perfusione piccolo volume (vedi punto 1.4.1).
  8. Preparare e caricare la soluzione di carico Fluo-5N AM: Aggiungere 0,25 ml di Fluo-5N AM soluzione madre (passo 1,3) a 0,25 ml caldo del 20% F127 Pluronic. Aggiungere 0,5 ml di soluzione calda Tyrode al composto, mescolare bene e aggiungere al sistema di ricircolo perfusione piccoli volumi.
  9. Monitorare continuamente pressione di perfusione e ECG e regolare il flusso, se necessario. Dye caricamento dura circa 1 ora a temperatura ambiente. 45 minuti dopo il caricamento è iniziato, accendere il bagno di acqua circolante per iniziare il riscaldamento del sistema di perfusione e perfusato a 37 ° C.
  10. Dopo 60 min di Fluo-5N AM caricamento, SWItch la perfusione per il volume del sistema di ricircolo perfusione più grande (vedi punto 1.4).
  11. Diluire 50 ml di soluzione colorante sensibile RH237 magazzino tensione (passo 1.3) in 1 ml di soluzione calda di Tyrode e aggiungere lentamente (sopra ~ 5 min) a una porta di iniezione prossimale alla cannula.

3. mappatura ottica

  1. Durante i momenti finali di colorante carico, posizionare il cuore e mettere a fuoco le telecamere di mappatura ottica per garantire campo appropriato della vista per l'esperimento.
  2. Se lo si desidera, posizionare un elettrodo di stimolazione bipolare sulla superficie epicardica del cuore per la stimolazione.
  3. Posizionare una custodia di plastica o di vetro sulla superficie della camera di perfusione per ridurre artefatti da movimento sulla superficie del liquido che può essere presente a causa di ricircolo del perfusato.
    Nota: In alternativa un vetrino, utilizzare una plastica di copertura pulito 50 millimetri Petri piatto.
  4. Focalizzare le guide di luce per illuminare uniformemente la superficie del cuore con eluce xcitation. Utilizzare diodi emettitori di luce blu (LED) fonti di luce e filtrare ulteriormente la luce con un 475-495 filtro passa-banda nm (Figura 1A).
  5. Raccogliere fluorescenza emessa con un macroscope e due complementari metallo-ossido-semiconduttore (CMOS) telecamere mappatura ottica. Dividere la luce emessa con uno specchio dicroico a 545 nm.
    1. -Pass filtro lungo la lunghezza d'onda più lunga porzione, contenente il segnale V m, a 700 nm. Filtro passa-banda della lunghezza d'onda più corta porzione, contenente il segnale SR Ca 2+, da 502 - 534 nm (Figura 1A). Impostare la frequenza di acquisizione dati ottici a 0,5 - 1 kHz.
  6. Per ogni registrazione ottica, prima di avviare il protocollo di stimolazione desiderata, accendere la luce di eccitazione, e raccogliere 1-4 sec di dati. Se lo si desidera, sincronizzare i protocolli di stimolazione e acquisizione dati.
    Nota: Non è possibile ricaricare il Fluo-5N AM, quindi il rapporto segnale-rumore (SNR) si decrease tutto l'esperimento a causa di perdite dal tingere SR. Limitare protocollo sperimentale per 1-2 ore per garantire elevati valori di SNR.
  7. Dopo l'esperimento, lavare il sistema di perfusione nella sequenza di acqua deionizzata, 70% alcool reagente, e di nuovo con acqua deionizzata.
  8. Filtro ogni insieme di dati con un filtro gaussiano spaziale (raggio 3 pixel) utilizzando i pacchetti software disponibili in commercio secondo il protocollo del produttore.
  9. Se necessario, spazialmente allineare il V m e SR Ca 2+ insiemi di dati. Come al punto 1.6, sovrapporre le immagini da ogni telecamera e verificare che le strutture anatomiche del cuore (es., Vascolare coronarico, bordi di atri o ventricoli) o altri oggetti nel campo visivo (ad esempio, la cannula, elettrodi di stimolazione) esattamente sovrapposizione. In caso contrario, l'allineamento spaziale delle serie di dati è necessario.
  10. Spostare l'immagine in alto trasparente si ottiene X e Y-direzione fino sovrapposizione esatta, prendendo nota del numero di pixell'immagine deve essere spostata in ciascuna direzione. L'intero insieme di dati corrispondente all'immagine superiore (o V mo SR Ca 2+) deve quindi essere spostata dal numero determinato di pixel in ogni direzione per assicurare un allineamento preciso tra V m e SR Ca 2+ set di dati.

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Risultati

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La figura 1A mostra un diagramma schematico della configurazione ottica per la doppia V m e SR Ca 2+ mappatura. Con questa configurazione, vi è la completa separazione spettrale del Vm e SR Ca 2 + segnali (Figura 1B). Lo schema del sistema di perfusione a doppio loop usato per Fluo-5N colorante carico è illustrato nella Figura 1C. Figura 1D mostra l'orientamento orizzontale del cuore nel piatto perfusione. Rap...

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Discussione

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Le chiavi del successo Fluo-5N colorante di caricamento sono configurazione ricircolo perfusione piccolo volume, che consente una elevata concentrazione Fluo-5N, senza la necessità di grandi quantità di colorante, la lunghezza del tempo di caricamento (1 ora), ed eseguire il caricamento a RT. Se il caricamento viene eseguito a temperature fisiologiche, attività enzimatica cellulare rapidamente scinde il tag -AM quando il colorante attraversa la membrana cellulare, intrappolando le molecole di colorante nel citosol e non...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (R01 HL 111600) e dall'American Heart Association (12SDG9010015).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NaClFisher ScientificS271-1Componente della soluzione di Tyrode
CaCl2 (2H2O)Fisher ScientificC79-500Componente della soluzione di Tyrode
KClFisher ScientificS217-500Componente della soluzione di Tyrode
MgCl2 (6H2O)Fisher ScientificM33-500Componente della soluzione di Tyrode
NaH2PO4 (H2O)Fisher ScientificS369-500Componente della soluzione di Tyrode
NaHCO3Fisher ScientificS233-3Componente della soluzione di Tyrode
D-GlucosioFisher ScientificD16-1Componente della soluzione di Tyrode
95% O2 5% CO2AirGascarbogenPer l'ossigenazione e il pH della soluzione di Tyrode
BlebbistatinTocris Bioscience1760Disaccoppiatore di eccitazione-contrazione
RH237Biotium61018Colorante sensibile alla tensione
Fluo-5N AMInvitrogenF-26915Indicatore Ca2+ a bassa affinità; Alternativa: Invitrogen F-14204; Il caricamento deve essere eseguito a temperatura ambiente
Pluronic F127Biotium59004Per il caricamento dell'indicatore Ca2+; Riscaldare fino a quando la soluzione è limpida prima dell'uso
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma-AldrichD2650Per sciogliere la blebbistatina e i coloranti
FiltroEMD MilliporeNY110470011 μ m filtro in linea
Trasduttore di pressioneWPIBLPR2Per misurare la pressione di perfusione
Trasduttore Transbridge AmplificatoreWPISYS-TBM4MPer la trasduzione/amplificazione del segnale di pressione; PowerLab può essere utilizzato anche con strumenti BioAmp PowerLab
26Tappropriatiper la registrazione continua di segnali di pressione ed ECG
THTMacroscope SciMediaConfigurazione ottica macroscopica. Dettagli: obiettivo 0,63X (NA = 0,31), obiettivo a condensazione 2X, campo visivo risultante = 3,1 cm x 3,1 cm, profondità di campo = ~ 1,5 mm
MiCam Ultima-L CMOSSciMediaTelecamere per mappatura ottica
Spot LED di precisioneSorgente luminosa LEDMightexPLS-0470-030-15-S

Riferimenti

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