Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

Sommario

Questo manoscritto fornisce una procedura passo-passo per la derivazione e il mantenimento di cheratinociti umani da capelli strappati e la successiva generazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) prive di integrazione da vettori episomiali.

Abstract

I recenti progressi nella riprogrammazione ci permettono di trasformare le cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). La modellazione della malattia utilizzando hiPSC paziente-specifiche consente lo studio del meccanismo alla base della patogenesi, fornendo anche una piattaforma per lo sviluppo di screening farmacologico in vitro e terapia genica per migliorare le opzioni di trattamento. Il potenziale promettente delle hiPSC per la medicina rigenerativa è evidente anche dal numero crescente di pubblicazioni (>7000) sulle iPSC negli ultimi anni. Vari tipi di cellule provenienti da lignaggi distinti sono stati utilizzati con successo per la generazione di hiPSC, inclusi fibroblasti cutanei, cellule ematopoietiche e cheratinociti epidermici. Mentre le biopsie cutanee e la raccolta del sangue vengono eseguite di routine in molti laboratori come fonte di cellule somatiche per la generazione di hiPSC, la raccolta e la successiva derivazione dei cheratinociti dei capelli sono meno comunemente utilizzate. I cheratinociti derivati dai capelli rappresentano un approccio non invasivo per ottenere campioni di cellule dai pazienti. Qui descriviamo un metodo semplice e non invasivo per la derivazione di cheratinociti da capelli strappati. Forniamo anche istruzioni per il mantenimento dei cheratinociti e la successiva riprogrammazione per generare hiPSC senza integrazione utilizzando vettori episomiali.

Introduzione

La scoperta di umani cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) ha rivoluzionato il campo della medicina rigenerativa, che fornisce un metodo fattibile per la generazione di cellule staminali paziente-specifici ^1-3. hiPSCs sono stati generati con successo da vari tipi di cellule somatiche, inclusi i fibroblasti, cellule ematopoietiche ^{4,5 6,7,} cellule epiteliali renali di urina ⁸ e cheratinociti ^9,10. Fino ad oggi, i fibroblasti della pelle e cellule ematopoietiche rappresentano le fonti di cellule più comunemente usati per la generazione iPSCs paziente-specifici. Probabilmente, questo è dovuto al fatto che le biopsie cutanee e raccolta del sangue sono procedure mediche di routine e grandi biobanche di sangue o di pelle campioni di pazienti sono stati stabiliti in molti paesi.

A differenza di cellule del sangue e fibroblasti cutanei che richiedono metodi di estrazione invasivi, cheratinociti rappresentano un tipo di cellula facilmente accessibile per la generazione hiPSC. Keratinocytes sono cellule epiteliali ricchi di cheratina che formano la barriera epidermica esterno della pelle e si trovano anche in unghie e capelli ^11. In particolare, cheratinociti possono essere trovati sulla guaina esterna della radice (ORS) dei follicoli piliferi, uno strato cellulare esterno che copriva il fusto del capello insieme con la guaina interna della radice (IRS) celle ^(12, figura 1). Come la raccolta dei capelli è una procedura semplice che non richiede l'assistenza di personale medico, si prevede la possibilità per i pazienti di recuperare ed inviare i propri campioni di capelli ai laboratori, il che faciliterà enormemente la raccolta dei campioni dei pazienti per la generazione hiPSC. Cheratinociti epidermici hanno una maggiore efficienza riprogrammazione e cinetica riprogrammazione più veloci rispetto ai fibroblasti, aggiungendo i vantaggi di utilizzare cheratinociti come le cellule di partenza per hiPSC generazione ^9,13. Inoltre, hiPSCs può essere generato anche utilizzando altre popolazioni di cellule all'interno del follicolo pilifero,comprese le cellule della papilla dermica situate alla base del ^14,15 follicolo pilifero.

Precedenti rapporti di generazione IPSC utilizzando cellule dei capelli derivate utilizzano spesso metodi di riprogrammazione retrovirali o basati ^{lentivirali-9,14,15.} Tuttavia, questi metodi virali introducono integrazione genomica indesiderabile dei transgeni esteri durante la riprogrammazione. In confronto, l'uso di vettori episomiale rappresenta un metodo di riprogrammazione fattibile, non virale per generare iPSCs senza integrazione ^4. Abbiamo già messo a punto un metodo semplice, economico e non virale per riprogrammare efficientemente cheratinociti in hiPSCs utilizzando vettori episomiale ^13. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la generazione di hiPSCs cheratinociti derivate, compresa la derivazione di cheratinociti da capelli strappato, espansione e manutenzione dei cheratinociti e successiva riprogrammazione per generare hiPSCs.

Protocollo

La raccolta del campione di capelli umani da individui richiede l'approvazione etica dal comitato etico della ricerca umana nelle istituzioni ospitanti e deve essere fatto in conformità con le linee guida istituzionali.

1. Isolamento dei cheratinociti da capelli a pizzico

1. Disgelo matrice extracellulare soluzione (ECM) (cioè, Matrigel) su ghiaccio O / N.
2. Utilizzando puntali delle pipette pre-refrigerati, aggiungere 200 ml soluzione ECM per 12 ml di acqua refrigerata a medio DMEM / F12. Coat un 12-pozzetti con 1 ml di soluzione di ECM diluita in ciascun pozzetto. Incubare la piastra O / N rivestito a 37 ° C. Lavare la piastra ricoperta di pre-riscaldato DMEM / F12 medio prima dell'uso.
3. Raccogliere i capelli umani primaria dalla testa del soggetto posizionando le dita vicino alla radice dei capelli e spennare i capelli in un movimento veloce e regolare. Controllare per confermare che ogni capelli raccolti contiene un follicolo pilifero intatta e determinare la fase di crescita delle Nazioni Unite capellider un microscopio da dissezione (Figura 1).
   1. Raccogliere 5-10 peli anagen da ogni individuo per estrarre cheratinociti. Processo pizzicato peli più presto possibile garantire la corretta derivazione dei cheratinociti.
      Nota: La Figura 1 illustra la morfologia di capelli in diverse fasi del ciclo di crescita. Capelli anagen è in fase di crescita, con uno strato esterno visibile dell'epitelio circonda la lunghezza dei capelli, noto come ORS. D'altra parte, i capelli telogen rappresenta capelli nella fase di riposo e non ha un ORS visibile, ma ha una chiara palla di cellule che ricoprono la radice dei capelli, noto come il rigonfiamento telogen.
4. Porre i campioni di capelli in una capsula petri contenente 10 ml di antibiotico Mix per lavare per 5 min a temperatura ambiente.
5. Utilizzando forbici e pinze sterilizzate, tagliare eccessiva fusto del capello, lasciando un frammento di capelli con un follicolo pilifero intatto e dintorni 0,5-1 cm di fusto del capello.
6. Attentamente TRAnsfer frammento 1 capelli in ciascun pozzetto della piastra ECM rivestite con pinze.
7. Con una pipetta 1 ml, aggiungere circa 3 gocce di Knockout siero sostituzione (KSR) medio (~ 100-200 mL) ai campioni di capelli.
   Nota: Mantenere i frammenti di capelli a stretto contatto con la superficie della piastra per consentire l'attaccamento e la successiva escrescenza cheratinociti. L'aggiunta eccessiva della carta in questa fase può provoca i frammenti di capelli di galleggiare e diminuisce il rischio di attacco di capelli di successo.
8. Incubare i campioni di capelli in un incubatore a 37 ° con il 5% di CO ₂ e consentire i follicoli dei capelli per fissare O / N. Il giorno dopo, aggiungere delicatamente altri 3 gocce di KSR media (~ 100-200 ml) per mantenere i campioni di capelli umidi.
9. Osservare i campioni di capelli ogni giorno per confermare che i follicoli dei capelli hanno attaccato con successo. Generalmente attaccamento dei follicoli dei capelli è evidente entro 1-3 giorni. Capelli spessi sono di solito più facili da montare rispetto a peli fini, come peli sottili hanno una maggioretendenza a galleggiare che ostacolano il processo di attaccamento.
   1. Una volta che i capelli sono attaccato alla piastra rivestita, aggiungere 500 ml di KSR mezzo al pozzo. Prestare particolare attenzione quando si aggiunge il mezzo come campioni di capelli potrebbero non essere montato saldamente. Da questo punto, cambiare supporto ogni 2 giorni.
      Nota: escrescenze cheratinociti devono essere visibili dalla regione ORS del frammento capelli dopo 3-7 giorni (Figura 2A-B). Lasciare i cheratinociti a crescere fino a 14 giorni prima passaging le cellule come descritto nella sezione successiva.

2. Manutenzione e Passaging dei cheratinociti

1. Pre-coat un 6-pozzetti utilizzando il kit Coating Matrix. Aggiungere 680 pl di mezzo di diluizione dal kit a ciascun pozzetto, seguito da 6,8 ml di soluzione di rivestimento Matrix. Agitare la piastra per assicurare una distribuzione uniforme della soluzione di rivestimento Matrix sulla piastra.
2. Il lamierino rivestito per incubare per 30 minuti a RT. Rimuoverela soluzione di rivestimento Matrix prima placcatura dei cheratinociti.
3. Dissociarsi cheratinociti in una sospensione di cellule singole con 500 ml di 0,25% tripsina per pozzetto per 2-5 minuti a 37 ° C. Disattivare la tripsina con 500 ml di mezzo contenente siero (ad esempio, siero fetale bovino (FBS) medium) e raccogliere in una provetta sterile da 15 ml. Rimuovere il frammento capelli con pinze sterilizzate.
4. Determinare il numero di cellule raccolte utilizzando un emocitometro.
5. Centrifugare le cellule per 3 min a 200 x g. Lavare le cellule con PBS e centrifugazione ripetere. Aspirare il PBS e risospendere il pellet cellulare in fresco medio dei cheratinociti.
6. Piatto giù 4 × 10 ⁴ cheratinociti in un pozzetto della piastra ECM rivestite in presenza di cheratinociti media. Mantenere cheratinociti in un incubatore a 37 ° con il 5% di CO ₂ (Figura 2C). Modificare i media ogni giorno e di passaggio celle quando la cultura è ~ 80% confluenti, WHIch può richiedere circa 2-7 giorni a seconda del numero di passaggio e la proliferazione tasso dei cheratinociti. I cheratinociti derivati ​​dovrebbero essere estesi per generare scorte congelate sufficienti utilizzando metodi di crioconservazione lento congelamento standard di ^16.
   Nota: Le condizioni di coltura descritte supportano l'espansione della popolazione omogenea dei cheratinociti con la tipica morfologia ciottoli (Figura 2C). Di tanto in tanto, qualche cheratinociti differenziati, con grande e piatta morfologia e hanno perso potenziale replicativo, possono essere osservati in cultura. Caratterizzazione dei cheratinociti può essere eseguita mediante immunocolorazione utilizzando anticorpi contro citocheratina 14 come descritto in precedenza ^17. Linee cellulari di cheratinociti Fondata dovrebbero essere testati per micoplasma dopo 1-3 passaggi utilizzando il kit disponibile in commercio.

3. Generazione di hiPSCs da cheratinociti Utilizzando episomiale Vettori

1. Pre-coat un 6-pozzetti con0,1% di gelatina (2 ml / pozzetto). Consentire la gelatina per rivestire per almeno 20 minuti a temperatura ambiente.
2. Per esperimento riprogrammazione, uso cheratinociti non oltre il passaggio 6. Dissociate cheratinociti in una sospensione di cellule singole con 1 ml di 0,25% tripsina per bene per 2-5 minuti a 37 ° C. Inattivare tripsina con 1 ml di supporti contenenti siero (ad esempio, FBS media) e raccogliere in una provetta da 15 ml.
3. Celle di centrifugazione per 3 min a 200 xg e risospendere le cellule in cheratinociti media. Piastra 1 × 10 ⁵ -1.5 × 10 ⁵ cheratinociti per pozzetto in una piastra O / N gelatinizzato.
4. Il giorno successivo (giorno 0), controllare la piastra per garantire cellule sono il 50-60% confluenti.
   Nota: Se cheratinociti sono meno di ~ 50% confluenti potrebbero non crescono bene dopo la trasfezione.
5. Il giorno 0, effettuare trasfezione dei vettori episomiale riprogrammazione sui cheratinociti, utilizzando un rapporto di 8 microlitri trasfezione reagente 2 ug di DNA plasmidico totale.
   1. Prendete 0,5 mg per ciascuno dei 4 plasmidi (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) e diluire in 100 ml di media Serum ridotta (per esempio, OPTI-MEM).
      Nota: Il plasmide pCXLE-eGFP è utilizzato per monitorare l'efficienza di trasfezione di cheratinociti e non è necessaria per la riprogrammazione successo.
   2. Aggiungere 8 ml di reagente di trasfezione di DNA diluito. Mescolare muovendo il tubo. Lasciare la miscela di reazione DNA riposare indisturbati a temperatura ambiente per 15 min.
   3. Sostituire il supporto dei cheratinociti con terreno fresco.
   4. Aggiungere delicatamente la miscela di reazione del DNA di coltura di cheratinociti e incubare a 37 ° C incubatore con 5% di CO ₂ per 4 ore.
      Nota: non è consigliabile eseguire prolungata trasfezione O / N nei cheratinociti in quanto presentano bassa sopravvivenza dopo la trasfezione.
   5. Dopo 4 ore dopo la trasfezione, sostituire il mezzo di cheratinociti con terreno fresco.
6. Il giorno 1 (1 giorno post-transfection), cambiare il mezzo cheratinociti e verificare l'efficienza di trasfezione stimando la percentuale di cellule positive eGFP sotto un microscopio a fluorescenza. Tipicamente> 60-70% efficienza di trasfezione si osserva per cheratinociti primari che utilizzano questo protocollo.
7. Il giorno 2, ripetere trasfezione come descritto al punto 3.5. Due trasfezioni consecutivi sarebbero tipicamente raggiungere il> 90% efficienza di trasfezione. Coltura di cheratinociti solito raggiunge la confluenza prima della fine del secondo trasfezione.
   1. Preparare un piatto 10 centimetri di topo alimentatore fibroblasti embrionali (MEF) per ogni reazione riprogrammazione. Preparare alimentatori MEF mitoticamente inattivati ​​come descritto in precedenza ^18.
   2. Pre-coat un piatto 10 centimetri con 5 ml di 0,1% di gelatina per almeno 20 min. Tavola 4 × 10 ⁶ MEF mitoticamente inattivato per 10 cm piatto in FBS medio. Permettono alle cellule di stabilirsi e di allegare O / N in un incubatore a 37 ° con il 5% di CO _2.
8. Il giorno 3, harconferire cheratinociti con 0,25% tripsina come descritto al punto 3.2 e 3.3. Risospendere cheratinociti in KSR medio e piastra 90% dei cheratinociti da 1 bene di un 6-pozzetti in un piatto alimentatore MEF 10 centimetri con KSR media.
9. Dal 4 ° giorno in poi, cambia il mezzo KSR ogni giorno.
   1. In alternativa, dopo il giorno 18, sostituire terreno di coltura ogni due giorni.
      Nota: cheratinociti non-riprogrammato cesseranno di proliferare, mentre le colonie hiPSC con contorno definito che assomigliano cellule staminali embrionali umane (hESC) emergeranno dal giorno 14-21.
10. Isolare colonie hiPSC da dissezione manuale dal giorno 21 in poi. Evitare colonie hiPSC che sono strettamente raggruppati insieme e solo raccolgono le colonie hiPSC che sono nettamente separati dagli altri.
    Nota: le colonie hiPSC possono essere presi in precedenza, ma la colonia con confini definiti potrebbero non essere evidente in precedenti momenti viste le ridotte dimensioni della colonia. Efficienze Riprogrammazione possono variare tra diffcheratinociti di erenti paziente, ed è influenzato anche da altri fattori, quali il numero di passaggio o il tasso di proliferazione dei cheratinociti.
    1. Per la dissezione manuale di colonie hiPSC, utilizzare un ago 26G per tagliare colonie hiPSC sotto un microscopio da dissezione. Tagliare una colonia hiPSC in piccoli pezzi intorno a 300-600 micron di lunghezza. Trasferire i pezzi da una colonia hiPSC in una nuova piastra alimentatore MEF (2,5 × 10 ⁴ MEF / cm ²⁾ per stabilire una linea clonale di hiPSCs. Inizialmente, la cultura ogni linea clonale hiPSC in un pozzetto di una piastra a 12 o coltura di organi e piatti, quindi espandere a 6 formato pozzetti.
    2. Mantenere linee clonali stabilite di hiPSCs in KSR medio su alimentatori MEF. Una volta che la cultura raggiungere il 70 - 80% di confluenza con le colonie hiPSC ~ 1,5 millimetri di diametro, hiPSCs passaggio utilizzando metodi standard enzimatici passaging (Accutase, dispasi o Collagenase IV) secondo le istruzioni del produttore.
11. Caratterizzare stabilito linea hiPSCs per confermare la pluripotenza e la loro capacità di differenziarsi in cellule rappresentante dei tre foglietti embrionali in vitro e / o in vivo ^13,19. Inoltre, le linee hiPSC routine test stabilite per micoplasma utilizzando kit disponibili in commercio per garantire che siano privi di agenti patogeni. Ordinariamente monitorare la stabilità del genoma di linee hiPSC da cariotipo o numero di copie variazione basata su array (CNV) analisi.

Risultati

I capelli passa attraverso 3 diverse fasi del ciclo di sviluppo: anagen (fase di crescita), catagen (la fase di regressione) e telogen (fase di riposo) il ^20,21. Il follicolo pilifero anagen contiene più strati di epitelio; questi strati comprendono i ORS, IRS e il fusto del capello (Figura 1). Capelli Anagen alla fine subisce la transizione alla fase catagen, che è caratterizzato da apoptosi delle ORS e alla conclusione della differenziazione fusto del capello. Infine, la transizione capelli...

Discussione

Generazione di hiPSCs paziente-specifici offre un approccio unico per lo studio patogenesi nei tipi di cellule malate in vitro, e fornisce anche una piattaforma per lo screening di stupefacenti per identificare nuove molecole in grado di salvare i fenotipi di malattia. Questo approccio di modellazione malattia utilizzando hiPSCs ha dato risultati promettenti per una varietà di malattie, tra cui la sindrome del QT lungo, malattia di Huntington, il morbo di Parkinson e la sclerosi laterale amiotrofica ^22.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mix di antibiotici:
250 ng/ml di amfotericina antimicotica B	Sigma	A2942-20ml	La miscela di antibiotici è composta da PBS.
1X Penicillina/Streptomicina	Invitrogen	15140-122
PBS (-)	Invitrogen	14190-144
Knockout Serum Replacement (KSR) medio:			Il terreno KSR viene filtrato utilizzando Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) prima dell'uso. Il bFGF viene aggiunto fresco al terreno prima dell'uso.
20% di sostituzione del siero knockout (KSR)	Invitrogen	10828-028
DMEM/F12 con glutamax	Invitrogen	10565-042
1&volte; MEM aminoacido non essenziale	Invitrogen	11140-050
0,5 volte; Penicillina/Streptomicina	Invitrogen	15140-122
0,1 mM β-mercaptoetanolo	Invitrogen	21985
bFGF (10 ng/ml, aggiunto fresco)	Millipore	GF003
Terreno per cheratinociti:
EpiLife con 60  µ M	Calcio Invitrogeno	M-EPI-500-CA
1&volte; Integratore per la crescita dei cheratinociti umani (HKGS)	Invitrogen	S-001-5
Siero fetale bovino (FBS) medio:			Il terreno FBS viene filtrato utilizzando Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) prima dell'uso.
10% siero fetale bovino (FBS)	Invitrogen	26140079
DMEM	Invitrogen	11995-073
0,5x Penicillina/Streptomicina	Invitrogen	15140-122
2 mM L-glutammina	Invitrogen	25030
0,25% tripsina-EDTA	Matrice
		354234	Aliquot Matrigel stock e stoccaggio a -80° C seguenti costruttori' . La concentrazione madre di Matrigel varia leggermente da lotto a lotto (~9mg/ml). Si consiglia di utilizzare 200µ l Matrigel per il rivestimento di una piastra a 12 pozzetti (~150µ g/pozzo).
Kit matrice di rivestimento	Plasmidi Invitrogen	R-011-K
:			Si noti che pCXLE-eGFP viene utilizzato solo per il monitoraggio dell'efficienza di trasfezione e non è necessario per la riprogrammazione.
-                  pCXLE-eGFP	Addgene	27082
-                  pCXLE-hOct3/4-shP53F	Addgene	27077
-                  pCXLE-hSK	Addgene	27078
-                  pCXLE-hUL	Addgene	27080
Reagente di trasfezione Fugene HD	Promega	E231B
Gelatina (da pelle suina)	Sigma	G1890	Preparare lo 0,1% di gelatina in acqua distillata. Autoclave prima dell'uso.
Terreno sierico ridotto: OPTI-MEM	Invitrogen	31985062
Accutase	Sigma	A6964-100ml
		fibroblasti embrionali di topo (MEF)	MEF può essere inattivato dal trattamento con mitomicina C o dall'irradiazione come descritto in precedenza 16.
Ago 26G	Terumo	NN2613R
piastra a 6 pozzetti (trattamento con coltura tissutale)	BD Biosciences	353046
piastra a 12 pozzetti (trattamento con coltura tissutale)	BD Biosciences	353043
piastra da 10 cm (trattamento con coltura tissutale)	BD Biosciences	353003
Dispase	Invitrogen	17105-041	Utilizzo a 10 mg/ml
Collagenasi IV	Invitrogen	17104-019	Utilizzare a 1 mg/ml
di anticorpo TRA-160	Millipore	MAB4360	Utilizzare a 5 µ g/ml
OCT4 anticorpo	Santa Cruz	SC-5279	Utilizzare a 5 µ g/ml
NANOG anticorpo	R& D Systems	AF1997	Utilizzo a 10 &; micro; g/ml
Kit di rilevamento MycoAlert	Lonza	LT07-418