Questo manoscritto fornisce una procedura passo-passo per la derivazione e il mantenimento di cheratinociti umani da capelli strappati e la successiva generazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) prive di integrazione da vettori episomiali.
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Articolo metodologico
Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati da cheratinociti
In questo articolo
Sommario
Abstract
I recenti progressi nella riprogrammazione ci permettono di trasformare le cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). La modellazione della malattia utilizzando hiPSC paziente-specifiche consente lo studio del meccanismo alla base della patogenesi, fornendo anche una piattaforma per lo sviluppo di screening farmacologico in vitro e terapia genica per migliorare le opzioni di trattamento. Il potenziale promettente delle hiPSC per la medicina rigenerativa è evidente anche dal numero crescente di pubblicazioni (>7000) sulle iPSC negli ultimi anni. Vari tipi di cellule provenienti da lignaggi distinti sono stati utilizzati con successo per la generazione di hiPSC, inclusi fibroblasti cutanei, cellule ematopoietiche e cheratinociti epidermici. Mentre le biopsie cutanee e la raccolta del sangue vengono eseguite di routine in molti laboratori come fonte di cellule somatiche per la generazione di hiPSC, la raccolta e la successiva derivazione dei cheratinociti dei capelli sono meno comunemente utilizzate. I cheratinociti derivati dai capelli rappresentano un approccio non invasivo per ottenere campioni di cellule dai pazienti. Qui descriviamo un metodo semplice e non invasivo per la derivazione di cheratinociti da capelli strappati. Forniamo anche istruzioni per il mantenimento dei cheratinociti e la successiva riprogrammazione per generare hiPSC senza integrazione utilizzando vettori episomiali.
Introduzione
La scoperta di umani cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) ha rivoluzionato il campo della medicina rigenerativa, che fornisce un metodo fattibile per la generazione di cellule staminali paziente-specifici 1-3. hiPSCs sono stati generati con successo da vari tipi di cellule somatiche, inclusi i fibroblasti, cellule ematopoietiche 4,5 6,7, cellule epiteliali renali di urina 8 e cheratinociti 9,10. Fino ad oggi, i fibroblasti della pelle e cellule ematopoietiche rappresentano le fonti di cellule più comunemente usati per la generazione iPSCs paziente-specifici. Probabilmente, questo è dovuto al fatto che le biopsie ....
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Protocollo
La raccolta del campione di capelli umani da individui richiede l'approvazione etica dal comitato etico della ricerca umana nelle istituzioni ospitanti e deve essere fatto in conformità con le linee guida istituzionali.
1. Isolamento dei cheratinociti da capelli a pizzico
- Disgelo matrice extracellulare soluzione (ECM) (cioè, Matrigel) su ghiaccio O / N.
- Utilizzando puntali delle pipette pre-refrigerati, aggiungere 200 ml soluzione ECM per 12 ml di acqua refrigerata a medio DMEM / F12. Coat un 12-pozzetti con 1 ml di soluzione di ECM diluita in ciascun pozzetto. Incubare la piastra O / N rivestito a 37 ° C....
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Risultati
I capelli passa attraverso 3 diverse fasi del ciclo di sviluppo: anagen (fase di crescita), catagen (la fase di regressione) e telogen (fase di riposo) il 20,21. Il follicolo pilifero anagen contiene più strati di epitelio; questi strati comprendono i ORS, IRS e il fusto del capello (Figura 1). Capelli Anagen alla fine subisce la transizione alla fase catagen, che è caratterizzato da apoptosi delle ORS e alla conclusione della differenziazione fusto del capello. Infine, la transizione capelli.......
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Discussione
Generazione di hiPSCs paziente-specifici offre un approccio unico per lo studio patogenesi nei tipi di cellule malate in vitro, e fornisce anche una piattaforma per lo screening di stupefacenti per identificare nuove molecole in grado di salvare i fenotipi di malattia. Questo approccio di modellazione malattia utilizzando hiPSCs ha dato risultati promettenti per una varietà di malattie, tra cui la sindrome del QT lungo, malattia di Huntington, il morbo di Parkinson e la sclerosi laterale amiotrofica 22.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Harene Ranjithakumaran e Stacey Jackson per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), dell'Università di Melbourne (R.C.B. Wong), di Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) e dell'Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Borsa di studio del Consiglio australiano della ricerca (A. Pébay, FT140100047), borsa di studio della Cranbourne Foundation (R.C.B. Wong); finanziamenti intramurali da parte del National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) e supporto operativo ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mix di antibiotici: | |||
| 250 ng/ml di amfotericina antimicotica B | Sigma | A2942-20ml | La miscela di antibiotici è composta da PBS. |
| 1X Penicillina/Streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) medio: | Il terreno KSR viene filtrato utilizzando Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) prima dell'uso. Il bFGF viene aggiunto fresco al terreno prima dell'uso. | ||
| 20% di sostituzione del siero knockout (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| DMEM/F12 con glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
| 1&volte; MEM aminoacido non essenziale | Invitrogen | 11140-050 | |
| 0,5 volte; Penicillina/Streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0,1 mM β-mercaptoetanolo | Invitrogen | 21985 | |
| bFGF (10 ng/ml, aggiunto fresco) | Millipore | GF003 | |
| Terreno per cheratinociti: | |||
| EpiLife con 60 µ M | Calcio Invitrogeno | M-EPI-500-CA | |
| 1&volte; Integratore per la crescita dei cheratinociti umani (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
| Siero fetale bovino (FBS) medio: | Il terreno FBS viene filtrato utilizzando Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) prima dell'uso. | ||
| 10% siero fetale bovino (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| 0,5x Penicillina/Streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2 mM L-glutammina | Invitrogen | 25030 | |
| 0,25% tripsina-EDTA | Matrice | ||
| 354234 | Aliquot Matrigel stock e stoccaggio a -80° C seguenti costruttori' . La concentrazione madre di Matrigel varia leggermente da lotto a lotto (~9mg/ml). Si consiglia di utilizzare 200µ l Matrigel per il rivestimento di una piastra a 12 pozzetti (~150µ g/pozzo). | ||
| Kit matrice di rivestimento | Plasmidi Invitrogen | R-011-K | |
| : | Si noti che pCXLE-eGFP viene utilizzato solo per il monitoraggio dell'efficienza di trasfezione e non è necessario per la riprogrammazione. | ||
| - pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
| - pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
| - pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| - pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| Reagente di trasfezione Fugene HD | Promega | E231B | |
| Gelatina (da pelle suina) | Sigma | G1890 | Preparare lo 0,1% di gelatina in acqua distillata. Autoclave prima dell'uso. |
| Terreno sierico ridotto: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
| fibroblasti embrionali di topo (MEF) | MEF può essere inattivato dal trattamento con mitomicina C o dall'irradiazione come descritto in precedenza 16. | ||
| Ago 26G | Terumo | NN2613R | |
| piastra a 6 pozzetti (trattamento con coltura tissutale) | BD Biosciences | 353046 | |
| piastra a 12 pozzetti (trattamento con coltura tissutale) | BD Biosciences | 353043 | |
| piastra da 10 cm (trattamento con coltura tissutale) | BD Biosciences | 353003 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Utilizzo a 10 mg/ml |
| Collagenasi IV | Invitrogen | 17104-019 | Utilizzare a 1 mg/ml |
| di anticorpo TRA-160 | Millipore | MAB4360 | Utilizzare a 5 µ g/ml |
| OCT4 anticorpo | Santa Cruz | SC-5279 | Utilizzare a 5 µ g/ml |
| NANOG anticorpo | R& D Systems | AF1997 | Utilizzo a 10 &; micro; g/ml |
| Kit di rilevamento MycoAlert | Lonza | LT07-418 |
Riferimenti
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human....
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Ristampe e permessi
