Valutazione della perigenitale Sensibilità e prostatica Mast attivazione delle cellule in un modello murino di Neonatale separazione materna

Sommario

Stiamo misurando la sensibilità e l'albero di attivazione perigenitale cella meccanico nella prostata maschile C57BL / 6 topi che ha subito un paradigma di stress primi anni di vita - la separazione materna neonatale, al fine di indurre un modello preclinico di sindrome da dolore pelvico / cronico prostatite cronica.

Abstract

Prostatite cronica / sindrome da dolore pelvico cronico (CP / CPPS) ha una prevalenza una tantum del 14% ed è la diagnosi urologica più comune per gli uomini di età inferiore ai 50 anni, ma è la malattia dolore pelvico cronico meno compresi e studiati. Un sottoinsieme significativo di pazienti con la relazione del dolore cronico pelvico avendo sperimentato presto lo stress della vita o di abuso, che può notevolmente influenzare il funzionamento e la regolamentazione del (HPA) dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene. L'attivazione dei mastociti, che ha dimostrato di aumentare sia nelle urine e ha espresso secrezioni prostatiche di CP pazienti / CPPS, è parzialmente regolato dall'attivazione valle dell'asse HPA. Neonatale separazione materna (NMS) è stato utilizzato per oltre due decenni a studiare i risultati di stress primi anni di vita in modelli di roditori, compresi i cambiamenti di HPA e la sensibilità viscerale. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di NMS come modello preclinico di CP / CPPS in maschi C57BL / 6 topi. Descriviamo la metodologiaper l'esecuzione di NMS, valutando perigenitale allodinia meccanica, ed evidenza istologica di attivazione dei mastociti. Inoltre forniamo la prova che presto lo stress psicologico può avere effetti di lunga durata sul sistema urogenitale maschile in topi.

Introduzione

Dolore pelvico cronico, non è di per sé una malattia, ma piuttosto un termine associato con il dolore in corso spontaneo e / o evocata vissuta dai pazienti con diagnosi di sindrome dell'intestino irritabile (IBS), cistite interstiziale / sindrome della vescica dolorosa (IC / PBS), vulvodinia, o prostatite cronica / sindrome da dolore pelvico cronico (CP / CPPS). Queste sindromi sono spesso coesistenti e condividere molte caratteristiche che non hanno patologia associata o identificati eziologia, anche se disfunzioni all'interno del sistema immunitario, sistema nervoso centrale e del sistema nervoso periferico ha dimostrato di contribuire al mantenimento e la ....

Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono conformi alle linee guida NIH in conformità con le linee guida indicate dalla University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee.

1. neonatale materna Separation (NMS)

1. Monitorare le dighe in gravidanza al giorno per le nascite lettiera.
   Nota: Il giorno la lettiera è nato è considerato P0.
2. Il P1, rimuovere la diga dalla gabbia di casa e mettere in un contenitore secondario pulito.
3. Strofinare una manciata di assestamento tra le mani pulite guantate per mantenere il profumo della gabbia di casa.
4. Aggiungere un....

Risultati

I topi che hanno subito NMS ha mostrato la prova del comportamento indicativa di CP / CPPS. Quando la prova con una serie graduata di monofilamenti von Frey, a 8 settimane di età topi NMS (n = 4) visualizzato perigenitale allodinia meccanica rispetto alle controparti ingenui (n = 5, figura 2). Ciò è evidenziato come una riduzione significativa (p <0.01; test t) del limite meccanico recesso che ha suscitato una risposta comportamentale positiva, iscritto a scatto veloce o salto in risposta al.......

Discussione

Questo protocollo prevede una metodologia per l'utilizzo di stress neonatale, sotto forma di NMS, per indurre sintomatologia indicativa di CP / CPPS nei topi maschi adulti. Da adulti, i topi NMS mostrano significativo allodinia meccanica perigenitale, così come prova della degranulazione dei mastociti nel tessuto della prostata. L'uso di NMS è un nuovo approccio allo sviluppo di un modello preclinico di CP / CPPS in quanto riproduce lo stress primi anni di vita che viene spesso segnalato dai pazienti con dolore .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Topi femmina C57BL/6 in gravidanza	Charles River	027	femmine incinte cronometrate o non cronometrate devono essere monitorate quotidianamente per il parto interno.
Becher(s)(s)i(s) di vetro da 2 L	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Ogni cucciolata NMS sarà tenuta nello stesso becher per tutto il periodo di separazione di 21 giorni.
Incubatore ad aria forzata VWR, base	VWR International	414005-124	L'incubatrice deve essere tenuta a 33 gradi; C e 50% di umidità.
Valutatore sensoriale per test tattile, kit da 20 (Estesiometro Semmes-Weinstein Von Frey per la valutazione del tatto)	Stoelting	58011	Per la valutazione della sensibilità perigenitale devono essere utilizzati i seguenti monofilamenti: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g e 4,74 g.
Recinto per animali (12 topi 6 ratti)	IITC	435	Assicurati di posizionare un oggetto pesante sopra i singoli recinti per animali in acrilico per evitare che i topi scappino.
Supporto in rete per topi e ratti (12 topi, 6 ratti)	IITC	410	Posizionare il supporto su un piano d'appoggio stabile per un comodo accesso.
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich	P5493	Diluire il materiale da 10x PBS a 1x PBS.
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148	Una soluzione di paraformaldeide al 4% è necessaria per perfondere intracardicamente i topi e il tessuto postfisso in preparazione alla colorazione dei mastociti.
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect tessuto fisso in soluzione di saccarosio al 30% a 4° C durante la notte.
Eptano	Sigma-Aldrich	Raffreddare l'eptano su ghiaccio secco per congelare i tessuti.
Cryomold standard	VWR International	4557	Per aiutare a congelare il tessuto prostatico prima del sezionamento del criostato
Composto OCT Tissue-Tek	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Blu di toluidina O	Sigma-Aldrich	198161	certificato dalla Biological Stain Commission. Adatto per l'uso come colorante metacromatico per mastociti.
Etanolo, assoluto (200 prove)	Fisher Scientific	BP2818-4	Grado di biologia molecolare, Fisher Bioreagenti; saranno necessarie soluzioni al 95% e al 100% per disidratare le criosezioni colorate prima della visualizzazione dei mastociti.
cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S9888	deve essere preparata fresca prima di colorare le criosezioni.
Provette da centrifuga sterili GeneMate da 50 ml	Provette monouso BioExpress	C-3394	utilizzate per miscelare elementi blu di toulidina o vetrini per immersione in 1xPBS.
Piatto di colorazione Coplin per 10 vetrini, con coperchio in vetro smerigliato	Fisher Scientific	08-815	Può contenere fino a 10 vetrini standard da 3 x 1 in. (75 x 25 mm) scorre schiena contro schiena. Utilizzare piatti separati per la soluzione di lavoro Toluidina Blue, 95% EtOH, 100% EtOH e xilene.
Xileni (Istologici)	Fisher Scientific	X3P	Una volta disidratato, il tessuto viene purificato con xilene.
Scatole per vetrini per microscopio, scatole	VWR International	82003	possono essere utilizzate per lo stoccaggio e il trasporto di vetrini.
Fisherbrand Scatola per vetrini per microscopio	Fisher Scientific	22-363-400	Queste scatole per vetrini sono in genere abbastanza piccole da poter essere inserite all'interno di un criostato.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol è un mezzo di montaggio tradizionale.
Mezzo di montaggio, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Il supporto di montaggio fissa saldamente il vetrino coprioggetti al vetrino.
Occhiali Micro Cover, rettangolari, n. 1	VWR International	48393-106	Un vetrino coprioggetti viene posizionato sul tessuto disidratato e pulito per proteggere il campione.
Microscopio ottico	Nikon		Il microscopio automatizzato avanzato per la ricerca Eclipse 90i, utilizzato dal nostro laboratorio, è stato interrotto e sostituito Eclipse Ni-E.