Generazione di cancro alla prostata del paziente Derivato modelli di xenotrapianto di cellule tumorali circolanti

Sommario

Questo manoscritto descrive in dettaglio un metodo utilizzato per generare xenotrapianti derivati da pazienti affetti da cancro alla prostata (PDX) da cellule tumorali circolanti (CTC). La generazione di modelli PDX da CTC fornisce un modello sperimentale alternativo per studiare il cancro alla prostata; il tumore più comunemente diagnosticato e una frequente causa di morte per cancro negli uomini.

Abstract

I modelli di xenotrapianto derivati da pazienti (PDX) stanno guadagnando popolarità nella ricerca sul cancro e vengono utilizzati per la valutazione preclinica dei farmaci, l'identificazione di biomarcatori, gli studi biologici e le strategie di medicina personalizzata. Le cellule tumorali circolanti (CTC) svolgono un ruolo critico nelle metastasi tumorali e sono state isolate da pazienti con diversi tipi di tumore. Recentemente, le CTC sono state utilizzate per generare modelli sperimentali PDX di cancro al seno e alla prostata. Questo manoscritto descrive in dettaglio il metodo per la generazione di modelli PDX di cancro alla prostata da CTC sviluppati dal nostro gruppo. I vantaggi di questo metodo rispetto ai modelli PDX convenzionali includono l'indipendenza dalla raccolta chirurgica dei campioni e la generazione di modelli sperimentali in vari stadi della malattia. La centrifugazione in gradiente di densità seguita da lisi dei globuli rossi e deplezione con citometria a flusso di cellule mononucleate CD45 positive viene utilizzata per arricchire le CTC da campioni di sangue periferico raccolti da pazienti con malattia metastatica. Le CTC vengono quindi iniettate in topi immunocompromessi; Gli xenotrapianti generati successivamente possono essere utilizzati per studi funzionali o raccolti per la caratterizzazione molecolare. Il limite principale di questo metodo è il metodo di selezione negativa utilizzato per l'arricchimento CTC. Nonostante questa limitazione, la generazione di modelli PDX da CTC fornisce un nuovo modello sperimentale da applicare alla ricerca sul cancro alla prostata.

Introduzione

Paziente xenotrapianti derivati ​​sono modelli sperimentali sempre più popolari utilizzati per la ricerca sul cancro. Essi possono essere utilizzati per la caratterizzazione di biomarcatori e percorsi biologici, valutazione preclinica di efficacia dei farmaci, e la creazione di avatar per terapie antitumorali personalizzate ^1,2. In precedenza, altri gruppi di ricerca hanno sviluppato modelli PDX o impiantando o iniettando sospensioni di cellule tumorali singole o espianti intero tumore in topi immunocompromessi ^1. Questi PDX modelli richiedono raccolta chirurgica del tumore solido fresco, ascite maligna o versamento pleurico da un paziente sottoposto ad un intervento chirurgico che è sia costoso e espone il paziente ad un aumentato rischio di morbilità iatrogena.

Un recente sviluppo significativo nella ricerca sul cancro è stato il rilevamento, l'isolamento e la caratterizzazione di cellule tumorali circolanti. Queste cellule tumorali sfuggono dalla massa tumorale primaria e in circolodove giocano un ruolo critico nella metastasi e recidive, la causa più comune di cancro legato mortalità ^3. La valutazione e la caratterizzazione di CTC da diversi tipi di tumori solidi hanno fornito informazioni cliniche per la diagnosi, la prognosi e il monitoraggio malattia residua ^3. Una varietà di approcci attualmente utilizzati basandosi su entrambe le proprietà fisiche, espressione di marcatori o caratteristiche funzionali di CTC può essere utilizzata per isolare efficacemente CTC ^4. Esistenti macroscala metodi di isolamento CTC includono gradiente di densità centrifugazione, filtrazione fisica con pori del filtro e la separazione contro molecole di superficie. Le metodologie di isolamento CTC più utilizzati sono basati sulla cattura a base di anticorpi di CTC. Sia selezione positiva e negativa di marcatori di superficie cellulare può essere impiegato per isolare CTC dal sangue periferico. Selezione positiva per CTC nella circolazione periferica utilizza comunemente marcatori epiteliali (ad esempio, EpCAM), che unre espresso sulle CTC, ma le cellule non ematopoietiche. Lo svantaggio di questo metodo è che CTCs con potenziale metastatico sono spesso sottoposti epiteliali-to-mesenchymal transizione (EMT), che downregulates marcatori di superficie epiteliali ^3. Per isolare CTC con potenziale metastatico, una metodologia di selezione negativa che impiega il marcatore di superficie ematopoietiche, CD45, per esaurire la popolazione normale di cellule di leucociti può essere usato ^5.

Il cancro alla prostata è il tumore più comunemente diagnosticato e una delle principali cause di decessi correlati al cancro negli uomini ^6. I meccanismi di progressione del tumore e l'aggressività sono state comprese e quindi la generazione e caratterizzazione di modelli sperimentali che ricapitolano l'eterogeneità molecolare del cancro alla prostata sono di notevole interesse. Modelli PDX di carcinoma della prostata sono stati generato in precedenza da attecchimento delle cellule del cancro alla prostata umano in immunocomtopi promesso ^7,8. Tuttavia, la generazione di tali modelli è stata ostacolata dal tasso attecchimento basso di cancro alla prostata in topi immunocompromessi, che viene principalmente attribuito alla natura indolente della malattia. Recentemente, CTC sono stati utilizzati per generare il cancro al seno ^9, il cancro del polmone ^{10 e} il cancro alla prostata ^{11 modelli} PDX. Questi studi proof-of-concept introdotto la possibilità di generare modelli PDX indipendente dalla necessità di raccolta dei campioni chirurgici. In questo articolo si descrive in dettaglio un metodo per la generazione di questo modello sperimentale romanzo.

Protocollo

Questo protocollo è stato condotto presso il nostro istituto con l'approvazione del comitato etico della ricerca istituzionale ed è in conformità con tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano.

1. Raccolta di sangue periferico di pazienti affetti da cancro alla prostata avanzato

Nota: Selezionare i pazienti con carcinoma della prostata metastatico. Ottenere il consenso scritto del paziente e registrare le caratteristiche cliniche dei pazienti, tra cui l'età di isolamento e la chemioterapia precedente e trattamenti ormonali. I pazienti con malattia metastatica saranno potenzialmente avere più alta concentrazione di CTC nel sangue periferico.

1. Raccogliere i campioni di sangue dopo consenso informato e sotto un appropriato Institutional Review Consiglio ha approvato il protocollo. Indossare guanti in lattice e un camice da laboratorio durante tutta la procedura.
2. Collegare 25 G farfalla ago e tubo alla porta aghi. Utilizzare un tampone imbevuto di alcool per pulire un'area divena periferica tra il bicipite ed avambraccio, quindi applicare laccio emostatico al braccio del paziente.
3. Inserire l'ago a farfalla nella vena antecubitale e spingere il tubo di raccolta del sangue in porta aghi per avviare la raccolta. Raccogliere circa 10 ml di sangue in provette per il prelievo che contengono acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per prevenire la coagulazione.
4. Rimuovere ago a farfalla da paziente e applicare pressione con garza sterile su sito di puntura della vena per 1 min. Sito Coprire con una benda sterile.

2. Isolamento di cellule mononucleate

Nota: Il sangue raccolto dal passaggio 1 conterrà cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) (ad esempio, linfociti e monociti) oltre ai CTC mononucleari.

1. Pipettare sangue intero in 50 ml tubo conico in polistirene con un 5 ml pipetta sierologica e aggiungere Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS) in un rapporto 1: 1. Delicatamente miscela pipetta per omogeneizzare.
2. Aggiungere 15 ml di una soluzione preparati commercialmente (Ficoll-Paque) per separare componenti del sangue da bassa velocità di centrifugazione in gradiente di densità in una provetta conica da 50 ml in polistirolo vuoto.
3. Delicatamente pipetta sangue intero e la miscela di HBSS, dal punto 2.1, nel tubo di polistirolo dal punto 2.2, in modo da formare strato superiore distinta. Set pipetta di valore più basso per ridurre al minimo la miscelazione di soluzioni, questo garantirà la separazione efficiente.
4. Centrifugare a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente (25 ° C). Impostare la decelerazione a valore più basso per evitare la miscelazione di soluzioni dopo la separazione. L'accelerazione può essere impostato su qualsiasi velocità.
5. Dopo centrifugazione, identificare la banda bianco-grigio sottile strato PBMC e CTCs sandwich tra plasma sulla soluzione superiore e la separazione sul fondo della provetta.
6. Raccogliere le cellule della striscia bianco-grigio al punto 2.5 in una provetta da 50 ml in polistirolo con una pipetta di plastica trasferimento.
7. Aggiungi HBSS a 50 ml tubo conico in polistirene con PBMC e CTC ecentrifuge nuovamente a 400 xg per 10 min a RT lavare.
8. Decantare pellet liquido e risospendere in 50 ml di HBSS e centrifugare di nuovo a 400 xg per 3 minuti a temperatura ambiente per lavare.
9. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet rimanente con 5 ml di globuli rossi Lysis buffer e incubare la soluzione per 5 minuti a temperatura ambiente.
10. Rimuovere il globulo rosso tampone di lisi per centrifugazione a 400 xg per 3 minuti a temperatura ambiente.
11. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS 1x supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) per bloccare prima di colorazione degli anticorpi.

3. Cellule mononucleate colorazione con CD45-FITC anticorpi per fluorescenza cellulare Attivato (FACS) Ordinamento

1. Quantificare il numero di (Trypan Blue-negativo) cellule vitali (dal punto 2.11) utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzati. Preparare un 1 x 10 ^{6 cellule} / ml sospensione (in PBS 1x con il 10% FBS) e posizionarlo sul ghiaccio per 1 ora.
2. Distribuire il quantificatosospensione cellulare dal passo precedente in due tubi. Etichettare le provette come il controllo e CD45 colorazione.
3. Nella provetta di controllo, aggiungere IgG1κ-FITC (2,5 mcg / ml) alla diluizione di 1: 250. Nel tubo colorazione CD45, CD45 FITC aggiungere (2,5 mcg / ml) anticorpo primario coniugato alla diluizione di 1: 250 e incubare le sospensioni cellulari in ghiaccio per 30 min. Etichettatura antigene CD45 è utilizzato per escludere le cellule ematopoietiche.
4. Centrifugare le cellule a 400 xg per 3 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
5. Lavare le cellule due volte, sospendendo ogni pellet con 1 x PBS sterile supplementato con 10% FBS seguita da centrifugazione a 400 xg per 3 min a 4 ° C.
6. Risospendere le cellule in una soluzione di PBS contenente 1x 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ad una concentrazione di 10 ug / ml 1 ml.
7. Filtrare la soluzione finale attraverso tappi colino 35 micron in 12 millimetri tubi in polistirolo x 75 mm.

4. Isolamento dei prostata CTC perFACS

Nota: Utilizzare un citofluorimetro per raccogliere in tempo reale CTC negativi CD45.

1. Controlli di compensazione SET utilizzando cellule dal tubo etichettato, "Control".
2. Creare cancelli che escludono detriti e gruppi di cellule utilizzando opportuni parametri previsionali scatter e side-scatter.
3. Stabilire le porte FITC utilizzando le sospensioni di cellule dal tubo etichettato, "CD45-FITC."
4. Vitali (DAPI-negativo), le cellule cancello utilizzando il Pacific Blue-Un canale.
5. Raccogliere popolazione negativa CD45 in una sterile tubo da 15 ml in polistirolo contenente 2 ml di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 integrato con il 10% FBS.
6. Centrifugare la sospensione di cellule tumorali della prostata filtrate a 400 xg per 3 min, quindi risospendere il pellet in 200 - 500 ml di RPMI supplementato con 10% FBS.

5. L'iniezione di CTC in topi e il monitoraggio dei xenotrapianto crescita

Nota:Condurre tutte le procedure animali in conformità con i protocolli approvati dal comitato di cura degli animali istituzionale. Questo protocollo è stato condotto presso la nostra istituzione, in virtù di un uso specifico protocollo animale approvato dal nostro Comitato Animal Care in conformità e il rispetto di tutte le pertinenti normative e istituzionali agenzie, regolamenti e linee guida.

1. Mescolare la prostata sospensione cellulare tumorale filtrate con matrice extracellulare in un rapporto 1: 1 e posto sul ghiaccio.
2. Anestetizzare topo prima dell'impianto sottocutaneo in una camera di alimentazione 5% (v / v) isoflurano inalato in 1 L / min di ossigeno. Assicurare anestesia appropriata controllando per la perdita dei riflessi della cornea e punta nel topo.
3. Utilizzando un ago G 25 e una siringa da 1 ml, iniettare 250 ml di cellule tumorali della prostata e della matrice extracellulare sospensione cellulare per via sottocutanea in entrambi i fianchi superiori di 8-10 settimane vecchio mouse immunodeficienti maschile. Iniettare 250 microlitri indipendentemente dalla concentrazione di CTC come il volume di iniezione è l'iValore mportante. Amministrazione massima SQ nel topo non è superiore a 1 ml.  
4. Monitorare topi eseguendo la palpazione settimanale di siti di iniezione del mouse per la crescita della densità nodulari sottocutanei e misurando topi peso due volte a settimana.
5. Euthanize topi di anidride carbonica asfissia seguita da dislocazione cervicale e raccolta sottocutaneo prostata umano xenotrapianti tumorali quando la dimensione del tumore è più di 0,5 cm e meno di 1 cm di diametro per assicurare tessuto tumorale sufficiente per analisi molecolari e di passaggio seriale. Euthanize topi con segni di sofferenza o di perdita di peso del 15%, nonostante nessun tumore è palpabile.

Risultati

Questo protocollo porterà alla generazione di modelli PDX da isolati CD45 prostata negativo CTC cancro. Sulla base del metodo di selezione negativa utilizzata nel nostro protocollo è necessario escludere le cellule morte mediante colorazione DAPI. La percentuale di cellule CD45 negative rilevata mediante citometria di flusso è variabile e dipende dal carico tumorale del paziente (Figura 1A). Immunofluorescenza di cellule CD45 e non ordinati utilizzando DAPI (per identificare nuclei cellulari) rivela cel...

Discussione

Questo manoscritto descrive un metodo per la generazione di cancro della prostata modelli PDX da CTC. L'uso di CTC per la generazione di PDX modelli ha diversi vantaggi potenziali importanti rispetto ai metodi esistenti. Innanzitutto, raccolta accessibile delle CTC dal sangue periferico consente la generazione di modelli sperimentali dallo stesso paziente a diversi stadi della malattia. In secondo luogo, la raccolta di sangue rappresenta un metodo sicuro ed economico per isolare le cellule tumoral...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillina Streptomicina	Gibco Life Technologies	15140-122
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µ m Cell Strainer	BD Falcon	352340
Provetta conica in polistirene da 50 ml	Crystalgen	23-2263
Tampone per lisi di globuli rossi	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
Provette in polistirene da 12 mm x 75 mm con tappo per filtro cellulare	BD Falcon		Provette per
la raccolta del sangue alla lavanda 352235 BD Vacutainer con EDTA
BD Set per la raccolta del sangue alato con ago di ritrazione a pulsante Calibro
BD Vacutainer Porta
Laccio emostatico
Guanti
in lattice o non in latticetamponi imbevuti di
2 x 2 garze
Benda
ago
siringa

23aghi monousoin lattice monousoalcoldi cotoneadesivada 25 G da 1 ml