Thermal Imaging per studiare lo stress in modo non invasivo in Uccelli sfrenato

Sommario

Vi è la necessità di una valutazione non invasiva di stress. Questo documento descrive un semplice protocollo utilizzando immagini termiche per rilevare una risposta significativa a temperatura eye-regione in cinciarelle selvatici per un fattore di stress acuto da lieve.

Abstract

Stress, un concetto centrale nella biologia, descrive una serie di risposte di emergenza alle sfide. Tra le altre risposte, lo stress porta ad un cambiamento nel flusso di sangue che si traduce in un netto afflusso di sangue agli organi principali e un aumento della temperatura interna. Questo ipertermia indotta da stress viene usato per valutare lo stress. Tuttavia, la misurazione della temperatura nucleo è invasiva. Poiché il flusso di sangue viene reindirizzato al nucleo, la periferia del corpo può raffreddare. Questo documento descrive un protocollo in cui la temperatura corporea periferica viene misurata in modo non invasivo in cinciarelle selvatici (Cyanistes caeruleus) utilizzando termografia a infrarossi. Nel campo abbiamo creato un set-up portando gli uccelli ad una posizione ideale di fronte alla telecamera utilizzando una casella esca. La fotocamera scatta una breve registrazione video termico dell'uccello indisturbata prima di applicare un fattore di stress lieve (chiusura della scatola e quindi catturare l'uccello), e la risposta del uccello di essere intrappolati viene registrato. La pelle nuda degli occhi-regione è ilcaldo area dell'immagine. Questo permette un'estrazione automatica della temperatura massima occhio-regione da ogni frame dell'immagine, seguito da ulteriori fasi di manuale filtraggio dei dati eliminando le fonti più comuni di errori (sfocatura di movimento, lampeggiante). Questo protocollo prevede una serie storica di temperatura occhio-regione con una risoluzione temporale fine che ci permette di studiare le dinamiche della risposta allo stress in modo non invasivo. Ulteriore lavoro deve dimostrare l'utilità del metodo per valutare lo stress, per esempio per verificare se la risposta temperatura eye-regione è proporzionale alla forza del fattore stressante. Se questo può essere confermata, si fornirà un metodo alternativo valido di valutazione dello stress negli animali e sarà utile per una vasta gamma di ricercatori provenienti da ecologisti, biologi della conservazione, fisiologi ai ricercatori di benessere degli animali.

Introduzione

Lo stress è un concetto centrale in biologia, descrivendo la risposta di emergenza di un organismo in risposta ad una sfida ambientale tentativo di ripristinare omeostasi ^1,2. Sotto stress, di glucosio nel sangue, gli acidi grassi ei livelli di aminoacidi, la frequenza cardiaca, frequenza respiratoria e il ritmo metabolico tutti aumentare, e il sangue è deviato dalla periferia verso gli organi centrali ^2. Questo modello generico di cambiamenti fisiologici innesca l'animale per essere in grado di rispondere rapidamente e in modo adattivo ad una serie di sfide sociali e fisiologici. Pur riconoscendo e comprendere lo stress è al centro sia della pura e applicata la ricerca su animali, per valutare lo stress negli animali sfrenato rimane una sfida.

Un marcatore fisiologico diffusa di stress è un aumento dei livelli circolanti di ormoni glucocorticoidi, come il cortisolo e corticosterone ^1,2. Una grande forza di questo approccio è che le loro concentrazioni aumentano in proporzione al fattore di stress di intensità, consentendo lo stress da quantificare. Tuttavia, i glucocorticoidi non sono ormoni "stress" di per sé, ma mobilizzatori di riserve di energia ^2. Come tali livelli glucocorticoidi cambiano anche con fabbisogno energetico, l'ora del giorno, l'età e lo stato riproduttivo ^3,4, così come in risposta a situazioni apparentemente positivi, come l'accoppiamento opportunità ^5. Livelli di glucocorticoidi, di conseguenza, devono essere interpretati con cautela e all'interno di un contesto. Misurare la risposta dei glucocorticoidi a stress acuto ha anche alcune limitazioni. Un fattore di stress acuto innesca una risposta dinamica di aumentare inizialmente i livelli di glucocorticoidi e successivamente tornare a un livello base ^1,2. Campioni glucocorticoidi sono in genere ottenuti invasivo, dal prelievo di sangue, che è un fattore di stress di per sé e quindi può influenzare i livelli di glucocorticoidi misurati ^6. Inoltre i livelli di glucocorticoidi possono essere misurati solo in uno o pochissimi tempo points, che non può catturare variazione nei livelli di picco e tempi di risposta o durata, limitando la nostra capacità di esaminare il cambiamento nel tempo della risposta allo stress dinamico all'interno individui. I metodi non invasivi di campionamento ormoni, come da feci ^7, capelli o piume ^8, misurano i livelli di glucocorticoidi medi rilevati durante un arco temporale più lungo, di giorni o mesi, anche se utile per studiare i fattori di stress cronico, non sono applicabili allo studio di stress acuto . Come anche i metodi più affermati offrono solo una prospettiva limitata variazione di stress acuto tra gli individui vi è la necessità di una metodologia alternativa a misure di stress fisiologico.

Come la risposta allo stress comporta una serie di effetti fisiologici ci sono altri candidati che potrebbero indicare lo stress. Tra gli altri, simpatia mediata canali vasocostrizione sangue dalla periferia al centro del corpo. Questa concentrazione di sangue e quindi di calore, insieme a varie formes di termogenesi indotta da stress, riscalda il cuore ^9. Come tale, il riscaldamento centrale, chiamato ipertermia indotta da stress (SIH) è stato anche utilizzato come marker di stress acuto nella ricerca farmaceutica ^10. SIH tipicamente aumenta la temperatura corporea da 0,5-1,5 ° C entro 10-15 minuti di un fattore di stress acuta ^10. Si tratta di un fenomeno relativamente ben documentato che un fattore di stress sperimentale comunemente applicato di cattura e gestione di un animale può aumentare la temperatura interna del corpo in una serie di mammiferi e uccelli ^{11 - 17.} È importante sottolineare che, SIH correlato con altri indicatori stabiliti di stress, come la frequenza cardiaca ^18, i livelli di glucocorticoidi ¹⁹ e il comportamento ^20,21. E come i livelli di glucocorticoidi, la temperatura interna è stato linearmente legati allo stress livello in alcune specie ^22. Tuttavia, come con prelievo di sangue, la misurazione della temperatura interna è invasiva in sé, che richiede l'inserimento or impiantazione di una sonda ^10. Temperatura interna di base aumenta gradualmente ogni volta in cui la manipolazione o la sonda inserimento stressanti deve essere ripetuto ^23. Recenti sviluppi in apparecchio di controllo della temperatura che permettono l'accesso ai dati in remoto possono fornire una soluzione, almeno per grandi animali ^24.

Entro lo stesso meccanismo che genera SIH, però, sorge un altro potenziale marker di stress: la vasocostrizione periferica che si muove il sangue, e con essa calore, al nucleo raffredda contemporaneamente la pelle ^17. A differenza di temperatura interna, temperatura cutanea può essere misurata completamente non invasivo, per termografia a raggi infrarossi (IRT). IRT converte la radiazione infrarossa emessa dalla superficie di un oggetto in temperatura ^25. Come la superficie di un animale ha in genere poche zone nude da cui la temperatura della pelle può essere derivato direttamente, si richiede l'accesso a pelle naturalmente esposta (ad esempio, area intorno tlui occhio) o la creazione di una patch nudo dalla rifilatura pelo o piume. Accesso fornito in una zona adatta esposta della pelle e l'animale può essere mantenuto nel campo visivo della telecamera, telecamere IRT possono essere utilizzati per raccogliere misure in continuo della temperatura cutanea remoto, eventualmente permettendo la risposta di temperatura completa essere filmato e confrontati tra individui . Mentre è già stato dimostrato nei polli che affiorano temperatura risponde acuti di stress ^26, la novità di questo studio è che misura la temperatura corporea superficiale di animali selvatici in una risoluzione più fine temporale rispetto agli studi precedenti e mostra anche che il calo della temperatura cutanea attesi possono essere rilevato nel campo in cui la temperatura, l'umidità e tempo sono variabili. Lo scopo di questo lavoro è quello di descrivere la metodologia necessaria per misurare la temperatura della pelle di un animale senza vincoli con la termografia. Usiamo cattura per indurre uno stress acuto da lieve a vita libera cince (Cyanistes caeruleus, Linnaeus 1758 ) e descrivere come catturare le immagini adatte, analizzare le immagini ed elaborare i dati per produrre curve di risposta di temperatura rispetto al tempo che dimostrano un significativo raffreddamento della temperatura cutanea degli uccelli in risposta al fattore di stress mite. Questo può fornire un metodo alternativo valido per valutare lo stress negli animali selvatici in cattività e utili per una vasta gamma di ricercatori provenienti da ecologisti, i biologi della conservazione e fisiologi per i ricercatori di benessere degli animali.

Lo studio è stato condotto nel periodo tra il 17 ^dicembre 2013 e il 4 ^gennaio 2014, una quercia foresta decidua presso il Centro Scozzese per l'ecologia e l'ambiente naturale (SCENA) (Quercus spp.), Università di Glasgow a riva orientale di Loch Lomond, centro-occidentale della Scozia (56.13 ° N, 4.13 ° W). Il protocollo prevede tre passaggi principali: (1) Impostazione di condizioni adatte in base alle quali per catturare immagini termiche da un animale ruspante, (2) applying un fattore di stress acuto durante l'assunzione di un video termico, e (3) l'estrazione e l'elaborazione dei dati dalle immagini termiche che poi possono essere utilizzati per caratterizzare la risposta dell'animale per il fattore di stress acuto. Nel nostro caso abbiamo attirato un-vita libera passeriforme, la cinciarella ad una scatola di alimentazione (riprese set-up), dove sono state ottimizzate le condizioni per l'acquisizione di immagini termiche, e poi applicato uno stress cattura chiudendo la scatola di alimentazione in remoto quando l'uccello era dentro . La descrizione di acquisizione di immagini termiche e l'estrazione dei dati è specifico per l'attrezzatura che abbiamo usato, e può variare tra i sistemi di imaging termico. Il trattamento dei dati è descritta utilizzando un software open-source.

Protocollo

Etica Dichiarazione:

Il lavoro ha coinvolto un metodo di cattura di routine di vita libera piccoli passeriformi approvati dalla British Trust for Ornithology e il protocollo di acquisizione suscitando uno stress lieve l'uccello è stato effettuato sulla base di titoli UK Home Office.

1. Set-up per le riprese

1. Creare una ripresa di set-up in cui gli uccelli sono incoraggiati a posizionarsi davanti alla macchina da presa (Figura 1). L'uccello entra nel set-up attraverso un foro in una parete di estremità e ha accesso al cibo vicino alla parete opposta.
2. Per abituare gli uccelli al set-up, forniscono un alimento adatto (ad esempio, noccioline) presso l'alimentatore per diverse settimane prima della registrazione. Oltre disposizione del cibo, lasciare indisturbati il ​​set-up. Durante questo periodo, posizionare un treppiede prova davanti dell'alimentatore per consentire agli uccelli abituare anche alla telecamera.
3. Il giorno di registrazione, ridurre il availabilità di noccioline nel set-up rimuovendo tutti cibo rimanente dall'alimentatore e sostituendolo con il cibo contenuto in un contenitore trasparente con solo un piccolo foro al centro sulla parte superiore attraverso la quale gli uccelli possono accedere al cibo. Posizionare questo contenitore al centro della gabbia all'estremità opposta al foro di entrata.
4. Inserire un piccolo quadrato di nastro isolante nero di emissività nota a quella del tegumento naturale in uno degli angoli della maglia della scatola in modo che appaia in tutte le immagini. Attaccare il nastro isolante nero per una termocoppia collegata ad un logger di temperatura che registra la temperatura del nastro isolante nero con una risoluzione di 0,1 ° C ogni 1 sec.
5. Posizionare la termocamera a 50 cm dal centro della trappola scatola in modo che tutto il dialogo si inserisce all'interno del campo della telecamera, e uccelli che si nutrono dal contenitore chiaro sarà posizionato nella zona della fotocamera di messa a fuoco. Collegare la fotocamera a un computer portatile, impostare la fotocamera per registrare immagini a una media di 7,5 fotogrammi al secondo (con un timestamp), e inviare le immagini sul disco rigido del computer portatile per essere salvati lì.
6. Fissare una linea di pesca alla porta rotante del set-up e stenderla ad una posizione in cui lo sperimentatore è nascosto alla vista degli uccelli, ma il set-up può ancora osservare - circa 20 m dal set-up.

2. Risposta riprese d'Uccello di un Acuto da Stress lieve

1. Una volta che un uccello entra nel box di alimentazione, lasciare l'uccello indisturbato nel box per circa 5 secondi.
2. Tirare la linea di pesca dopo l'uccello aveva speso circa 5 secondi nella casella per chiudere la finestra di alimentazione. Assicurarsi che l'uccello è ancora in fondo della scatola al fine di minimizzare il rischio di lesioni per l'uccello.
3. Immediatamente avvicinare la scatola di alimentazione e stare immobile dietro la telecamera per circa 3 minuti. Quindi recuperare l'uccello dalla scatola e lasciarlo andare.

"> 3. Estrazione di Eye-regione della temperatura da immagini termiche

1. Estratto massima temperatura da ogni frame. Nota: La temperatura massima è stata praticamente sempre registrato dalla regione intorno all'occhio, delimitato dalla pelle esposta dell'anello periophthalmic (figura 2), ed è qui di seguito indicata come temperatura eye-regione.
   1. Nel Thermal Imaging Analysis Software tasto destro del mouse sull'immagine, 'aggiungere' una nuova trama per la massima dell'immagine. Quindi, fate clic destro sulla trama che esporta i dati (temperatura occhio-regione e la volta che il telaio è stato preso) in un file CSV.
2. Eliminare dal file CSV tutte le linee di fotogrammi in cui l'occhio-zona dell'uccello non era visibile.
3. Tracciare temperatura massima contro il tempo in ^R 27, punti identificare manualmente dove sbalzi di temperatura> 0,2 ° C tra due letture successive quando la membrana nittitante è stato tirato sopra l'occhio (lampeggiante) e punti con bassi valori outside la gamma di temperatura corporea per gli uccelli ²⁸ (vale a dire, quando l'occhio-regione era visibile ma offuscata attraverso la proposta di più fotogrammi) e poi rimuovere le linee interessate dal file di dati CSV prodotta durante la fase 3.1.
4. Misurare la temperatura ambiente.
   1. Scaricare i dati (ora e temperatura logger) dal registratore di temperatura su un computer e l'esportazione in un foglio di calcolo.
   2. Per ottenere la temperatura ambiente da l'immagine termica, in Termografia Analysis Software disegnare un quadrato sopra il nastro isolante nero che copriva la sonda di data logger di temperatura, quindi fare clic destro sulla piazza e selezionare 'aggiungere nuova trama' per la temperatura media della piazza.
   3. Quindi, fate clic destro che trama, per esportare i dati (ora e temperatura IRT) in un file CSV. Unire le serie storiche di due temperatura risultante per logger di temperatura e corrispondente immagine termica per tempo in un foglio di calcolo.
5. Corretto eye-regione temperare contro temperatura ambiente. Esportare il foglio di calcolo creato nel punto 3.4 nel file CSV corrispondente per tempo. Per ogni temperatura eye-regione conservato aggiungere la differenza tra il logger temperatura e dei valori di temperatura di imaging termico-derivato (logger temperatura - Temp IRT) misurato allo stesso tempo.
6. Effettuare automatico di filtro per rimuovere i valori bassi meno accurati occhio-regione di temperatura utilizzando l'algoritmo di ricerca di punta (vedi file di codice supplementare) per estrarre i più alti (e quindi più precisi), punti i dati automaticamente.
   Nota: L'algoritmo di ricerca di punta riorganizza i dati di temperatura in un vettore con una definita dall'utente larghezza (arco), raccomandato spanna = 3, estrarre il valore centrale di righe in cui i numeri di entrambi i lati sono più bassi, cioè, i picchi.
7. Utilizzare l'interpolazione lineare per chiudere i vuoti lasciati da sequenze quando nessun picco è stato estratto, e quando l'occhio-regione non era visibile. Utilizzare il comando na.approx (zoo pacchetto v1.7-11 in R ²⁷⁾ invia un singolo valore di temperatura al secondo per ciascun individuo.
8. Nel file di dati CVS, aggiungere un valore di 0,2 per ogni temperatura eye-regione per correggere l'effetto di prendere le immagini attraverso una maglia.
   Nota: I test hanno dimostrato che quando un corpo nero, riscaldato, sul ravvicinamento temperatura media del corpo di uccello del ~ 41 ° C nella sua fase attiva ^28, è stato ripreso attraverso la finestra a maglie con le stesse dimensioni delle maglie ed usati per girare il film di set-up, le temperature registrate dal la termocamera in zone non oscurate da i fili erano di 0,2 ° C inferiore a quella dei valori ottenuti senza la maglia intervenire (differenza media = -0.2 ° C ± 0.085 deviazione standard, n = 30, intervallo di temperatura di corpo nero = 41,6-42,5 ° C).
   Nota: Questo è il fattore di correzione specifico alle condizioni in questo studio e può variare con strumento fare, e il tipo e la larghezza della maglia tra l'animale e la telecamera, e in ogni situazione deve essere stabilito per la spcondizioni di studio ecific.
9. Dalle temperature occhio-regione massimi registrati da prima casella è stata chiusa selezionare il valore più alto, che costituiranno la base della temperatura occhio-zona dell'uccello indisturbata. Aggiungere questa linea di base temperatura eye-regione come una nuova colonna per il file CVS (baseline). Quindi sottrarre il valore di base di ogni trattenuto valore massimo eye-regione di temperatura, generando una nuova colonna nel file di dati CVS.
   Nota: Questo nuovo valore ora esprimere la risposta del uccello di stress acuto mite come deviazione dalla sua temperatura basale indisturbata.
10. Tracciare le deviazioni di temperatura massima occhio-regione dalla linea di fondo di temperatura occhio-regione di tutti gli individui da dopo la trappola è stata chiusa con il ggplot di comando (pacchetto ggplot2 v1.0.0 in R ^27). Generare bootstrap 95% intervallo di confidenza utilizzando l'mean_cl_boot opzione (pacchetto ggplot2 v1.0.0 in R ^27). Per i dettagli consultare il file di codice supplementare.

Risultati

I risultati di 9 cinciarelle vita libera vengono presentati che illustrano le informazioni che possono essere ottenute da immagini termiche e dimostrare che il segnale previsto di stress nella temperatura occhio-regione d'uccello può essere rilevato in animali liberi respiro. Ogni uccello è stato girato per una media di 5,1 ± 0,9 sec (n = 9) davanti alla scatola 'porta era chiusa. Questo ha permesso il calcolo di eye-regione la temperatura del uccello indisturbata (temperatura basale) a cui si può riferire tutte le misure successive. Nei test condotti su 20 sec Video termica clip di indisturbati cince arrivo e alimentazione di un sifone (n = 9 uccelli diversi da quelli utilizzati per l'applicazione di un fattore di stress lieve), correlazioni di r> 0,7 sono risultati esistere tra la massima temperatura eye-regione registrata durante i primi 5 sec, e la massima registrata nella prima 10, 15 e 20 secondi (Figura 3). Questo è stato interpretato come indicazione che il massimo value registrato nelle prime pochi secondi dopo l'ingresso trappola era rappresentativo del livello a lungo termine, e la temperatura occhio-regione medio durante circa 5 secondi immediatamente precedenti la chiusura di dialogo sono stati utilizzati come valore di base. Le tette blu in questo campione ha avuto una linea di base temperatura media eye-regione di 38.4 ± 0.5 ° C (media ± SE) e variava 35,8-39,9 ° C (n = 9). Una volta che l'uccello alimentato per 5 secondi per consentire il calcolo della temperatura eye-regione basale, la porta è stata chiusa scatola dallo sperimentatore. Tutti i volatili notato la chiusura della scatola, come evidenziato dai loro voli fuga tentativi.

Alla chiusura della trappola, la temperatura occhio regione è sceso rapidamente e ha raggiunto una temperatura minima eye-regione ~ 1,3 ° C sotto la temperatura basale dopo ~ 10 sec (Figura 4). Figura 4 mostra la curva composita basata sulla massima oculare temperatura regione di tutti i nove individui la media per ogni secondo. Come ili tempi e la grandezza dell'occhio regione goccia di temperatura varia tra individui le maschere curva composita la reale portata della risposta di temperatura. L'abbassamento della temperatura media calcolata per ogni individuo è separatamente 2,0 ± 0,2 ° C e il punto più basso è raggiunto dopo 9.4 ± 2.8 sec (media ± SE). Da allora in poi, la temperatura occhio-regione è tornata gradualmente ai basale temperatura occhio-regione sul seguente 2-3 minuti, ma non abbastanza raggiungere la linea di base entro la fine del processo.

Figura 1. L'arena riprese. Il set-up nel campo è stato progettato per attirare gli uccelli al campo di vista della telecamera in cui potrebbe essere applicato un fattore di stress acuto mite, utilizzando una scatola di alimentazione. Il set-up consisteva di un 25 da 14 cm e 16,5 cm di altezza box costruiti in compensato, con un pannello frontale di rete metallica zincata con un'apertura size di 1 da 2,5 centimetri. La rete permette radiazione infrarossa che passa attraverso, rendendo possibile filmare uccelli, mentre all'interno del set-up. Maglia metallica è stato scelto, come vetro e molte plastiche non trasmettono la radiazione infrarossa. Un foro di diametro 60 mm è stato tagliato in parete terminale sinistra per consentire uccello entrare nel set-up e accedere al cibo posto all'estremità destra della casella. Una sonda logger per temperatura a sandwich tra due quadrati di nastro isolante nero (indicata dalla freccia nera) è collegato al alto a destra del pannello anteriore per registrare una temperatura di riferimento. Il fattore di stress acuto da lieve viene applicata al uccello in profondità di chiusura della scatola. Tirando una linea di pesca collegato a una porta rotante al foro di entrata accettati lo sperimentatore per chiudere la scatola quando un uccello si trova all'interno. La termocamera set davanti alla trappola registra l'intera sequenza degli eventi. Cliccate qui per vedere una versione più grande of questa figura.

Figura 2. termica Immagine di un Tit blu. La maggior parte del corpo di un passeriforme è ben isolata dalle piume (o, in misura minore da scaglie gamba), ma la pelle intorno agli occhi è esposto e irradia più calore in circostanze normali, ed è circondati da tegumento più fredda o di sfondo. Questo è mostrato in questa immagine termica dal colore giallo (più alta temperatura) intorno all'occhio, l'arancio, colore rosso, viola e blu significano le temperature più fredde e più fredde. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. ripetibilità della temperatura basale o misurativer diversi periodi di tempo. I coefficienti di correlazione tra la temperatura massima registrata nel primo 1-8 sec di una clip e 'medio dei massimi' all'interno 0.5º del valore più alto registrato per la prima 10, 15 e 20 sec di Clip (rappresentata da linee rosse, blu e verde, rispettivamente). Tutte le clip erano 20 sec durata (n = 9). Durante l'analisi iniziale utilizzando un set di dati più grandi, un certo numero di «mezzi di massimi" sono stati calcolati da solo 1 valore, e ha dato lo stesso valore per rho attraverso tutti i confronti. Queste clip sono stati rimossi dalle analisi, lasciando solo quelle in cui mezzi sono stati calcolati da più di 3 misurazioni. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Rispostadella temperatura eye-regione trapping. C'è un segnale molto chiaro e pronunciata dalla cattura riflette nel cambiamento di temperatura eye-regione nel tempo. Per confrontare tra gli individui che variano nella loro temperatura basale, residuo temperatura eye-regione, come la differenza di temperatura attuale e di base di quella persona, viene tracciata sull'asse verticale. Questo in funzione del tempo con la chiusura della trappola impostato come 0 e l'uccello rimosso dalla trappola dopo 3 min. La linea rossa indica la temperatura media residua e la fascia grigia rappresenta l'intervallo di confidenza del 95%. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Lo scopo di questo lavoro è quello di descrivere la metodologia necessaria per misurare le variazioni nella temperatura della pelle di un animale a vita libera in risposta a un fattore di stress acuto. Questo studio ha dimostrato che rapidi cambiamenti di temperatura cutanea associata con una risposta di stress acuto in uccelli selvatici possono essere catturati in modo non invasivo con IRT. Questa procedura ha coinvolto cinque fasi importanti (1) Disegno di campo appropriato set-up utilizzando un sistema di immagini termiche estremamente portatile, (2) la misurazione della temperatura basale, (3) l'applicazione di un fattore di stress lieve coinvolge catturare l'uccello nel set-up, (4) post hoc automatizzato campionamento di (5) calibrazione dei dati di temperatura estratti temperatura occhio-regione e. La metodologia qui descritta è stata applicata alla cattura di tette blu selvatici. Temperature occhio-regione di base di rappresentanza potrebbero essere catturati in meno di 5 secondi. Il tempo stimato di registrare un uccello in campo era di circa 1 ora, con un'ulteriore ora necessaria al trattamento della3 min sequenza video termico.

Raccolta di buoni dati sulla temperatura della pelle di un animale richiede immagini termiche di elevata qualità. Le termocamere solo differiscono fondamentalmente dalle telecamere luce visibile in termini di lunghezza d'onda della radiazione elettromagnetica che rilevano, e, quindi, molti dei concetti che si applicano nella fotografia (ad esempio, campo di visione, profondità di campo) si applicano anche in termografia. Come comunemente praticata da fotografi naturalisti, qualsiasi posizione che un visite animale prevedibile, dove naturali (ad esempio, siti di nidificazione) o artificiali (ad esempio, alimentatori), potrebbero essere utilizzati per la raccolta di immagini termiche. Attirare gli animali alla fotocamera, piuttosto che tentare di seguirli se il loro habitat ha il vantaggio di permettere a noi di impostare la fotocamera in anticipo, di raccogliere immagini di alta qualità con il minimo disturbo, non appena l'animale entra in vista. Tuttavia, con questo approccio, è di vitale importanza per esaminare o conto degli effetti dellequel contesto specifico della misura su stress o la temperatura della pelle. Ad esempio, qui, gli uccelli sono stati misurati in un contesto di alimentazione, e il cibo è stato utilizzato per attirare attivamente cinciarelle nel set-up. La ricerca sui polli suggerisce che esperienze positive acuti, come l'anticipazione e il consumo di una ricompensa alimentare in un processo di apprendimento associativo può temperatura occhio anche più bassa ^29. In quanto tale, "livelli di base" di individui che entrano in questo particolare set up possono essere influenzate dall'associazione di questo atto con la ricompensa. Questa possibilità garantisce ulteriori indagini, ma se presente, ci si aspetterebbe per migliorare il calo rispetto ai livelli basali già osservato. Inoltre, la termogenesi si verifica con la digestione del cibo, anche se gli effetti specifici di cibo consumato durante la misurazione della linea di base non si prevede di elevare in modo significativo la temperatura all'interno del periodo di 3 minuti cattura ^30.

Questa limitazione considerato, che misura tutti gli animali connello stesso contesto è anche una grande forza di questo approccio. I risultati rappresentativi hanno dimostrato che c'era una grande variazione di temperatura occhio-regione tra gli individui prima che è stato applicato il fattore di stress acuto (basale temperatura occhio-regione). La variazione di temperatura oculistica di base (coefficiente di variazione = 3,9%) potrebbe essere in parte causa di un errore di misura o di un vero riflesso di tra-le differenze individuali. Il periodo la fotocamera IRT temperatura del nastro isolante nero ha registrato più di 5 secondi quando la temperatura del nastro non è cambiata, il coefficiente medio di variazione è 0,26% (range 0,08% al 0,59%). Sebbene errore di misura è probabile che sia più grande in un uccello spostandolo tuttavia indica che la maggior parte di questa variazione in temperatura basale eye-regione è davvero tra individui. La nozione di relativamente piccolo errore di misura sugli uccelli in movimento è ulteriormente supportata dalla elevata ripetibilità della temperatura eye-regione oltre 20 secondi durante le misurazioni di base ( Figura 3). Controllando per il contesto, possiamo assicurare che tutti gli uccelli sono stati impegnati nella stessa attività. Possiamo anche ridurre i contributi ambientali al momento della misurazione a tra-individuale variazione di temperatura della pelle, per esempio, facendo in modo che la località è protetto da radiazione incidente confondimento che, per la termografia, portare ad una sovrastima della temperatura superficiale degli animali . Questo può essere fatto con il lavoro in ombra o tonalità strategicamente, incluse plastiche più trasparenti che bloccano lunghezza d'onda infrarossi. Il protocollo presentato qui mostra un semplice set-up che potrebbe facilmente essere applicato alla situazione di svernamento cinciarelle. La cinciarella è stato filmato mentre in una scatola di alimentazione con un tetto solido che evita l'esposizione alla luce solare diretta. Questo set-up potrebbe essere applicato anche a molti altri passeriformi che regolarmente vengono a alimentatori artificiali in determinati periodi dell'anno. Come cinciarelle sono relativamente piccoli animali,bisogno di essere girato di close-up per catturare un buon livello di dettaglio. Come nel caso di macchine fotografiche, di avvicinarsi al soggetto - sia in termini di distanza effettiva, e l'ingrandimento - riduce drasticamente la profondità di campo. Per ottenere gli uccelli più grandi possibile nel campo visivo richiesto loro riprese dalla minima distanza focale della fotocamera, che in questo caso era 500 mm e profondità di campo ridotta a 40 mm. Pertanto, tutte le caratteristiche delle riprese set-up devono essere progettati per incoraggiare gli animali per mostrare la loro testa nella zona relativamente ristretta di forte attenzione della telecamera particolare utilizzata.

In risposta a un fattore di stress lieve acuta consolidata per un animale che ci aspettavamo rapidi cambiamenti nel modello di flusso di sangue, dalla periferia al centro tramite vasocostrizione simpatia mediata che riduce la temperatura della pelle ^17. La regione periorbitale è stata scelta come questo ha fornito l'unica regione del corpo che era non isolato ed è Associato con una ricca rete Interlacciati di piccoli vasi sanguigni, il ophthalmicum rete che può influenzare la perdita di calore dall'occhio ^31. Il frame rate veloce della tecnica filmare termico è stato in grado di mostrare un calo della temperatura occhio-regione di circa 2 ° C in 10 secondi, seguito da un successivo aumento della temperatura entro 0,5 ° C del valore basale nel raggio di 3 min. Anche se il raffreddamento periferico in risposta allo stress mite è stato registrato in precedenza a circa 1 min intervalli di ^{17,26, 32,} la tecnica qui ha dimostrato che il massimo calo della temperatura può essere estremamente rapida. Con risoluzione temporale minore è la grandezza di questo effetto può essere perso. Questo può essere importante quando si confrontano differenze nella risposta allo stress di individui differenti. La ri-riscaldamento degli uccelli dopo il rapido 'lotta o fuga' di risposta non ha fatto ritorno a livello di base come l'uccello è rimasto all'interno della casella che indica che l'uccello è rimasto fisiologicamente sottolineato. Gli uccelli erano rilasciod dal set-up sperimentale dopo arbitrariamente scelto un cut-off di circa 3 minuti per minimizzare il periodo di contenzione di un animale a vita libera. Tuttavia, in futuro, gli studi può essere necessario più tempo per registrare la risposta della temperatura completa fino a occhio-zona della temperatura degli animali è tornato al livello di base, se logisticamente possibile.

Questo nuovo protocollo coinvolge una serie di immagini raccolte prima e dopo l'evento stressante è stato applicato consente ora studio dettagliato della dinamica della risposta a stress acuto, e il confronto dei diversi punti temporali tra singoli animali. Ripetendo questo processo negli individui oltre diverse stagioni o condizioni ambientali possono permettere gli effetti dell'ambiente sulla linea di base o della temperatura post-acuta della pelle lo stress da districati, come una possibile via in valutazione dello stress cronico pure. .

Temperatura della pelle di un uccello dipende non solo sulla produzione di calore metabolico eil flusso di sangue ma anche sullo scambio di calore dalla radiazione solare, velocità del vento e bagnare ^25. Questo preclude vento e l'umidità dalle registrazioni termografiche accurate. La temperatura di eye-regione registrata da una termocamera può a volte sia da sottovalutare (errore negativo) o sovrastimato (errore positivo). Sostanziale errore positivo richiederebbe apporto di energia, ma questo è stato evitato l'uccello nella casella di alimentazione essendo al riparo dal sole. Un'altra fonte di errore positivo incluso quando l'uccello sbatté le palpebre. Occasionalmente l'uccello tira brevemente sua membrana nittitante sull'occhio regione e come viene memorizzato internamente ad una temperatura vicina a quella del nucleo del corpo, lampeggiante dà una lettura anomala alta temperatura quando ricopre il bulbo oculare. Questo è, tuttavia, facilmente rilevabile in quanto lascia una firma molto marcata e il telaio interessata può essere rimosso. La ragione principale per un errore in meno nei nostri archivi è sfocatura di movimento. Qualsiasi movimento troppo rapido per essere catturato sharply per il frame rate della telecamera confonde i dati acquisiti dal piccolo caldo occhio-regione dell'immagine con quella della circostante area di fresco (sfocatura di movimento), con un conseguente sottostima della temperatura eye-regione. Così, dopo la rimozione di errori positivi questo rende la temperatura massima misurata dall'occhio-regione la misurazione più accurata e un filtraggio automatico utilizzando il comando funzione picchi rimuove i valori più bassi meno probabile delle temperature massime eye-regione.

Inoltre, come radiazione infrarossa viene assorbita dal vapore acqueo, temperatura superficie registrata saranno influenzati dall'umidità relativa dell'ambiente. Questo può essere spiegato inserendo la temperatura dell'aria, l'umidità relativa e la distanza di opporsi in Termografia analitico software di analisi. Tuttavia, un approccio più preciso ed efficiente (come qui intrapresa) è quello di includere un corpo di riferimento della temperatura ed emissività nota nel campo visivo. Nel nostro caso questo eraun quadrato di nastro isolante nero con una emissività di 0,97, che è approssimativamente equivalente a quella del tegumento naturali ^33. Ciò consente di calibrare la temperatura eye-regione utilizzando la differenza tra i valori di temperatura di imaging derivato reali e termiche misurati per il nastro isolante. La temperatura superficiale del corpo nero può quindi essere utilizzato per calibrare le immagini ininterrottamente per tutto il periodo di misurazione.

Grazie ai progressi tecnologici nello sviluppo delle telecamere termiche possono ora essere distribuito come piccole telecamere leggere in grado di raccogliere molti fotogrammi al secondo per periodi di tempo prolungati. Anche se la termografia è una tecnica ampiamente utilizzato nella ricerca aviario ^25, le dimensioni e la spesa di termocamere ad infrarossi hanno limitato il suo utilizzo in natura. In questo studio il sistema era altamente portatile, costa circa. £ 6000 e ha fornito video ad alta risoluzione termica in grado di catturare in modo non invasivo te precisodati mperature da animali a vita libera, senza la necessità di gestire uccelli. La registrazione su più fotogrammi al secondo consente di effettuare misure di serie temporali alta risoluzione di temperatura periferica e quindi offre la possibilità di esplorare la dinamica della risposta allo stress acuto. Questo è difficile da ottenere con il campione glucocorticoidi convenzionale che viene limitata dal numero di campioni che possono essere adottate entro un periodo di tempo. Qui abbiamo estratto una serie storica di temperatura occhio-regione con un intervallo di 1 sec, che è stato sufficiente a dimostrare l'occhio-regione risposta di temperatura a un fattore di stress acuto (cattura), ma più alta risoluzione temporale sarebbe anche possibile. L'accumulo di un gran numero di immagini, tuttavia, richiede un certo livello di automazione nella estrazione di informazioni dalle immagini. Il protocollo descrive un semplice processo semi-automatico per estrarre la temperatura massima di ciascuna immagine. Siamo stati in grado di fare questo, come la regione di interesse, l'occhio-region, era sempre il punto più caldo nell'immagine. Analisi potrebbe essere più problematico se le regioni di interesse sono più complessi e possono richiedere software di riconoscimento del modello progettato su misura (per esempio, ^34). In questo studio è stato richiesto un po 'di filtraggio manuale per le situazioni in cui la temperatura occhio-regione era sovra o sotto-stimati ma questi erano facilmente individuabili, ma naturalmente ulteriore automazione è auspicabile. Le misure di raffreddamento periferico stress-induced by imaging termico offre una preziosa aggiunta alle altre misure fisiologiche di stress e l'aspetto non invasiva di questa tecnica è molto vantaggioso per ulteriori studi su animali in cattività e selvatici.

Catturare la risposta allo stress completo, termografia infrarossa chiaramente ha un grande potenziale come strumento per la valutazione dello stress. Per diventare un'alternativa non invasiva per ormonale stabilito e fondamentali test di temperatura, però, sarà necessario cross-validate tra queste misure edeterminare se la temperatura cutanea mostra la stessa proporzionalità con intensità di stress, cioè, il grado di risposta temperatura cutanea può riflettere la forza del fattore di stress. La ricerca futura dovrebbe affrontare anche se la temperatura della pelle cattura stress cronico. Mentre SIH in risposta ad un fattore di stress acuto dovrebbe essere transitorio, l'esposizione a fattori di stress acuto ricorrente fisiche o psicologiche in grado di generare aumento cronico nel nucleo temperatura corporea ^35,36. Sia vasocostrizione corso contribuisce a questa elevazione nucleo non è stato testato in modo esplicito. Tuttavia, gli studi correlativi sugli esseri umani che soffrono di malattie legate allo stress cronico fanno mostrare le temperature delle dita ridotte ^37. Un attributo finale per esplorare è valenza: la capacità di distinguere positivo da eventi negativi. Dosaggi ormonali non possono distinguere valenza ^5, con livelli di glucocorticoidi che appaiono in modo da riflettere il livello di eccitazione piuttosto che lo stress in particolare. Ricerca sul pettine temperamentoatura in polli domestici esposte a stimoli avversi e positivi suggeriscono temperatura cutanea può essere allo stesso modo simile a eccitazione generale ^22,29. Tuttavia, negli esseri umani, diversi stati emotivi suscitano cambiamenti regionali specifici nella temperatura della pelle, per esempio il riscaldamento e il raffreddamento periorbitale guancia quando sorpreso ^38, ma nel complesso una diminuzione della temperatura cutanea quando ridere ^39. Il confronto tra le diverse regioni possono ancora rivelare lo stato emotivo. Utilizzando le raccomandazioni previste nel presente documento, sarà possibile affrontare tutte queste domande, e convalidare temperatura della pelle come marcatore non invasivo di stress.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Termocamera	FLIR	A65 (f=25 mm)	Compatta (106 x 40 x 43 mm) e a basso costo
Software di analisi delle immagini termiche	FLIR	ResearchIR v3.4	Consente la registrazione video termica ad alta velocità e l'analisi dei modelli termici
Registratore	di temperatura Gemini Data Logger	Tinytag Talk 2 TK-4023-PK	Monitor da -40 a +125 ° C utilizzando la sonda di temperatura in dotazione