Articolo metodologico

Studiare la Stechiometria di Epidermal Growth Factor Receptor in cellule intatte con correlativa Microscopia

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DOI:

10.3791/53186

⸱

11 settembre 2015

 , 
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, University of Saarland

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'etichettatura del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) sulle cellule di fibroblasti COS7 e la successiva microscopia ottica ed elettronica correlativa di cellule intere allo stato idratato. L'etichetta conteneva punti quantici fluorescenti. Il protocollo può essere utilizzato per studiare la stechiometria dell'EGFR a livello di singola molecola.

Abstract

Questo protocollo descrive l'etichettatura del fattore di crescita epidermico (EGFR) su cellule di fibroblasti COS7, e la successiva microscopia a fluorescenza correlativa e la scansione ambientale microscopia elettronica (ESEM) di cellule intere in stato idratato. Punti quantici fluorescenti (QDs) sono stati accoppiati EGFR mediante un protocollo di etichettatura due fasi, fornendo una proteina etichettatura efficiente e preciso, evitando etichetta indotta raggruppamento del recettore. Microscopia a fluorescenza ha fornito immagini panoramica delle posizioni cellulari del EGFR. Il rivelatore microscopia elettronica a trasmissione scansione (STEM) è stato utilizzato per rilevare le etichette QD con una risoluzione nanometrica. Le immagini risultanti forniscono dati di correlazione della distribuzione EGFR cellulare e la stechiometria a livello molecolare unica nel contesto naturale della cellula intatta idratato. Immagini ESEM-STEM ha rivelato il recettore di essere presente come monomero, come omodimero, e in piccoli gruppi. Etichettatura con due QDs differenti,cioè, uno che emette a 655 nm ea 800 rivelato risultati caratteristici simili.

Introduzione

Un nuovo approccio è stato introdotto di recente, di cellule intere di immagine con proteine ​​marcate allo stato liquido utilizzando STEM 1-3, o microscopia a fluorescenza correlativa e STEM 4-7. Questa metodologia è in grado di studiare la distribuzione spaziale delle proteine ​​di membrana e complessi proteici compresa la loro stechiometria a livello di singola molecola nelle membrane plasmatiche intatte cellule intere. Qui, descriviamo un protocollo che coinvolge un'etichettatura specifica in due fasi di proteine ​​recettori con punti quantici (QD fluorescenti) 8, e microscopia ottica correlativa e ESEM-STEM. Come esempio, abbiamo studiato l'EGFR, una proteina di membrana che appartiene alla superfamiglia di proteine ​​chinasi. In seguito al legame ligando, il recettore attiva e quindi forma un dimero con un'altra EGFR attivato; la successiva cascata di segnali guida la proliferazione delle cellule 9. Le mutazioni che portano alla espressione di EGFR anormale o attività svolgono un ruolo centrale in molti tipi di cancro 10. Studying la disposizione spaziale di questo recettore di membrana in cellule intere fornisce importanti informazioni contestuali sulla sua funzione ed eventuali modifiche della stessa 11-14. Ma resta difficile da sondare la distribuzione dei monomeri, dimeri EGFR, e cluster direttamente su una (sotto) livello cellulare con metodi di microscopia biochemical- o tradizionali 15. Il nostro metodo è in grado di visualizzare EGFRs con una risoluzione spaziale di alcuni nanometri tale che le posizioni di proteine ​​in un complesso può essere determinato. Soprattutto, le informazioni ottenute sulla distribuzione stechiometrico riferisce alla situazione nativo della proteina nella cellula intatta.

Al fine di ottenere una breve distanza tra l'etichetta e il recettore, EGFR è stato marcato direttamente tramite il suo ligando EGF, utilizzando un legame biotina-streptavidina ad un QD. Questa etichetta può essere rilevato sia con la microscopia fluorescence- ed elettronica. Abbiamo usato questa etichetta per l'imaging correlativo cellule COS7 inliquido racchiuso in una camera di microfluidica precedenza 1,16,17. Tuttavia, a causa di un multiplo di streptavidina molecole per QD, tale etichetta può indurre il clustering recettore, portando ad una bassa efficienza di etichettatura o esperimenti piuttosto costose, e non è possibile concludere sulla stechiometria della proteina in esame. Etichetta indotta raggruppamento recettore può essere evitata del tutto impiegando la procedura di etichettatura due fasi qui presentato, causando una sonda biotinilata comprendente EGF per cui solo uno streptavidina-quantum dot (STR-QD) è accoppiato. Le cellule vengono incubate con EGF biotinilato, e poi fissate. Il passo fissaggio determina il punto di tempo in cui i processi di proteine ​​vengono arrestati (a seconda della velocità di fissaggio). STR-QD viene applicato successivamente come secondo passo del protocollo di etichettatura. Clustering non avviene dal movimento della membrana dinamica delle proteine ​​è ostacolata volta le proteine ​​sono fissi. Inoltre, la soluzione STR-QD, che è ilpiù costoso componente dell'esperimento, può essere applicato in una bassa concentrazione ottimale, e questa seconda fase di etichettatura non è tempo cruciale, cioè, il QD può essere accoppiato in alcuni minuti.

Per studiare la stechiometria di EGFR come distribuito in cellule intere, campioni cellulari sono stati preparati su microchip di silicio 18. Dopo aver applicato l'etichettatura QD in due fasi, e la registrazione delle immagini microscopia a fluorescenza, le cellule sono state lavate con acqua pura, e ripreso in stato idratato utilizzando ESEM-STEM 19. Le immagini risultanti correlative forniscono informazioni sulla distribuzione EGFR cellulare e la stechiometria nel loro contesto naturale delle cellule idratate. Un metodo simile è stato utilizzato per studiare le proteine ​​HER2 nelle cellule del cancro al seno in un recente studio 7.

Protocollo

1. Preparazione di etichettatura e di fissaggio Reagenti

  1. Preparare tampone etichettatura (BSA-GEL-PBS) con tampone fosfato autoclavato, pH 7.4 (PBS). Supplemento con 1% di BSA (albumina bovina frazione V, senza biotina) e 0,2% di gelatina (GEL, da acqua fredda pelle di pesce) e vortex / agitare bene.
    Nota: può essere conservato per ~ 5 giorni a 4 ° C.
  2. Preparare tampone di lavaggio (BSA-PBS) da tampone fosfato autoclavato, pH 7.4. Supplemento con BSA 1% e vortice / agitare bene. Nota: può essere conservato per ~ 5 giorni a 4 ° C.
  3. Preparare 50 mM tampone borato (BB) da 200 mm di magazzino soluzione di acido borico, pH regolato a 8,3 con 200 mm tetraborato di sodio. Nota: può essere conservato per ~ 12 mesi a 4 ° C.
  4. Preparare 0,1 M tampone cacodilato (CB) da 0,2 M di sodio cacodilato soluzione madre, pH regolato a 7.4, integrato con 0,1 M di saccarosio.
    Nota: soluzione madre Aperto può essere conservata per ~ 5 giorni a 4 ° C.
  5. Preparare 0,1 M glicina in PBS (GLY-PBS).
    Nota: può essere conservato per ~ 2 mesi a 4 ° C.
  6. Preparare 3% paraformaldeide in CB (3% PFA) da appena fatta o aperto fiala del 16% PFA, soluzione madre, grado EM.
    Nota: soluzione madre Aperto può essere conservata per ~ 5 giorni a 4 ° C.
  7. Preparare 2% glutaraldeide in CB (2% GA) da appena fatto (o aperto fiala di) 25% soluzione madre GA, grado EM.
    Nota: soluzione madre Aperto può essere conservata per ~ 5 giorni a 4 ° C.
  8. Preparare la soluzione di etichettatura 300 nm EGF-biotina
    1. Diluire soluzione madre 6 micron EGF-biotina in BSA-GEL-PBS, utilizzare un volume di 100-200 ml per microchip. Utilizzare in pochi ore.
  9. Preparare 10 soluzione di etichettatura nM STR-QD
    1. Centrifugare la soluzione di riserva streptavidina-QD per 4 min a 8.000 xg, prendere surnatante e diluire 1:10 in BB. Diversi tipi di QD possono essere utilizzati, per esempio, QD655 o QD800. Diluire a concentrazione finale in BSA-GEL-PBS, utilizzare 75-100 ml per microchip. Utilizzare entroqualche ora.

2. Preparazione di nitruro di silicio membrana Microchip

  1. Pulire un vetrino da microscopio, usati per la microscopia ottica, con una camera panno pulito e cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) etanolo.
  2. In un banco di lavoro flusso d'aria laminare con basso contenuto di polvere, aprire un diametro Petri piatto 100 mm, e gettare il vetro del microscopio pulito nel piatto; lasciare il piatto aperto.
  3. Con pinzette pulite, preferibilmente rivestiti con fibra di carbonio o altro rivestimento, prendere 4-10 microchip con sottili (50 nm) membrane nitruro di silicio, uno dopo l'altro, dalla loro scatola immagazzinaggio e sopra il vetrino. Afferrare i microchip delicatamente ai lati e non toccare il lato fragile superiore, composta da membrana di nitruro di silicio sottile. Fare molta attenzione a tenere sempre il lato della membrana e non toccarlo.
    Nota: I microchip devono essere rettangolare e hanno bordi piani perpendicolari al loro nitruro di silicio rivestitofaccia, in modo da poter essere afferrati facilmente.
  4. Chiudere il coperchio della capsula di Petri e portarlo ad una cappa aspirante. Ottenere un nuovo tessuto camera pulita e depositarla accanto alla capsula di Petri. Preparare due bicchieri di vetro pulite 200 ml riempiendo uno con 50-70 ml di acetone, e l'altra con un volume analogo di etanolo, sia di grado HPLC. Trasferire i microchip dal vetrino prima sul tessuto stanza pulita.
  5. Dal tessuto, trasferire microchip uno per uno nel primo bicchiere con acetone per rimuovere lo strato di resist protettivo. Attendere 2 min, mentre si muove delicatamente il becher alcune volte per assicurare che i microchip sono ben risciacquati.
  6. Trasferire i microchip direttamente nel bicchiere con etanolo, senza farli asciugare. Aspetta 2 min. Poi il trasferimento il bicchiere al banco da lavoro flusso d'aria laminare. Ottenere un nuovo tessuto stanza pulita.
  7. Trasferire i chip sul tessuto e lasciarli asciugare per qualche minuto. Trasferire i microchip sul vetrino nella scatola di Petri, chiudere il piatto,e portarlo al filtro plasma.
  8. Depositare il vetrino con i microchip nel pulitore plasma. Eseguire un programma di pulizia 5 min a rendere la superficie della membrana idrofila nitruro di silicio.
    Nota: le impostazioni applicate Adatto per il nostro pulitore plasma: 70 mTorr, il flusso di gas di 11,5 sccm per O 2 e 35.0 SCCM per Ar, 50 W di destinazione della deviazione radio frequenza (RF), 5 W gamma RF e max. riflessa RF.
  9. Mettere il vetrino con il microchip di nuovo nel capsula di Petri, e chiudere il coperchio. Fare attenzione a mantenere i microchip sterili da ora in poi.
  10. Esaminare le superfici vetrate dei microchip sotto un microscopio ottico per eventuali rotture della membrana o restanti particelle di sporco.
  11. Portare la capsula di Petri al banco da lavoro flusso d'aria laminare.
  12. Posizionare le seguenti voci nel workbench flusso d'aria laminare: tubi / flaconi contenenti sterilizzate 0,01% poli-L-lisina soluzione (. PLL, Peso Mol 150.000-300.000, sterile filtrato, e colture cellulari testati), HPLCacqua di grado, di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero bovino fetale, DMEM senza siero, un nuovo tessuto stanza pulita, una piastra da 24 pozzetti sterili (a 12-pozzetti può anche essere usato), sterile 96- pozzetti, puntali sterili, una pipetta, e piatta, punta arrotondata, pinzette.
  13. Prendere la piastra di 24 pozzetti, e riempire un pozzo con PLL, e due pozzi con acqua per HPLC, utilizzano un ca. volume di 1 ml per pozzetto. Prendere la piastra a 96 pozzetti e riempire per ogni microchip due pozzi con siero integrate DMEM e un pozzetto con DMEM senza siero, utilizzare un ca. volume di 200 microlitri per pozzetto.
  14. D'ora in uso pinzetta con punte sterili per gestire i microchip. Realizzare questo, per esempio, brevemente fiammatura e successivo raffreddamento le punte delle pinzette.
  15. Prima di trasferire i microchip del vetrino sul tessuto stanza pulita.
    Dal tessuto, trasferire fino a sei microchip nel PLL-riempita bene, incubare i microchip per 5 min.
    None: Per un esperimento con più microchip, riempire pozzi aggiuntivi nel 24-pozzetti.
  16. Successivamente sciacquare i microchip mettendoli, uno per uno, nel primo pozzo riempito di acqua, e da lì nella seconda acqua-riempita bene. Non lasciare i microchip in acqua più di circa un minuto per evitare la rimozione di PLL.
  17. Infine metterli singolarmente nei pozzetti DMEM-riempite della piastra a 96 pozzetti. Conservare la piastra a 96 pozzetti in CO 2 incubatore fino alla preparazione della sospensione cellulare.

3. Preparazione di cellule su Microchip

  1. Eseguire una subcultura di cellule COS7 per preparare una sospensione cellulare con una concentrazione di circa. 5 × 10 5 cellule / ml. Assicurarsi che le cellule sono mono-disperse.
  2. Prendere la piastra a 96 pozzetti con i microchip e aggiungere uno goccia di sospensione cellulare per ogni microchip. Attendere 5 min.
  3. Cominciare ad esaminare le aree della finestra dei microchip con un microscopio invertito a CHOose il momento giusto per il trasferimento in un nuovo pozzo con DMEM senza siero.
    Nota: Una buona densità di cellule è realizzato con una cella per circa 2.500 micron 2 zona, corrispondente a 24 cellule COS7 su una dimensione di finestra di 150 x 400 micron. Densità di cellule superiori hanno il rischio di ostacolare appiattimento massima delle cellule. Essere consapevoli del fatto che, dopo una cella si è depositato giù sulla membrana SIN, ha bisogno di 3-5 minuti per sviluppare abbastanza aderenza per resistere galleggiante al largo durante il trasferimento nel nuovo bene.
  4. Trasferire microchip all'altro bene quando cellule sufficiente hanno aderito sulla finestra. Mantenere i microchip sempre con le celle rivolte verso l'alto e evitare di toccare questo lato.
  5. Dopo il trasferimento, riesaminare ogni finestra microchip. Se troppe cellule sono state lavate via e il numero di cellule rimanenti è insufficiente, ri-triturare la sospensione cellulare (per rompere grumi di cellule di nuova formazione) e ripetere i passaggi 3,1-3,5.
  6. Quando tutti i microchip trasferiti hanno abbastanzaaderendo cellule sui propri settori delle finestre, trasferire i chip nell'ultima bene con DMEM senza siero. Posizionare la piastra a 96 pozzetti di nuovo nel incubatore CO 2 e lasciare che le cellule recuperare e appiattirsi per diversi hr, migliore O / N.

4. EGFR Etichettatura, Fissazione, e microscopia a fluorescenza

  1. Per i passaggi seguenti, utilizzare un 96 pozzetti e un 24-pozzetti. Pre-riempimento di pozzi con le rispettive soluzioni, e utilizzare una riga o colonna per microchip. La piastra ben 24- viene usato sotto la cappa per le fasi di fissazione con CB, PFA e GA. Trasferire sempre microchip con le celle rivolte verso l'alto e di evitare qualsiasi commovente di questo lato.
  2. Risciacquare microchip ponendo i microchip in un pozzo con fresca BSA-GEL-PBS, poi posto 96 pozzetti in incubatore a 37 ° C per 5 min.
  3. Incubare con 300 soluzione EGF-biotina nM per 3 min a 37 ° C. Poiché le cellule inizieranno endocitosi di EGFR EGF marcato procedere il più velocemente possibile a step 4.4.
  4. Lavare 3 volte con PBS, e 1 volta con CB (ora la piastra a 96 pozzetti è di nuovo a RT).
  5. Incubare nel 3% PFA per 10 min.
  6. Risciacquare chip 1 volta con CB, e 3 volte con PBS.
  7. Incubare in GLY-PBS per 2 minuti, sciacquare 2 volte con 1 volta PBS.
  8. Incubare a 10 nM STR-QD per 10 min.
  9. Lavare 4 volte con BSA-PBS.
  10. Immergere un microchip in una piastra da 35 mm con fondo di vetro pre-riempite con BSA-PBS a temperatura ambiente.
  11. Acquisire contrasto di interferenza differenziale (DIC) immagini e le immagini di fluorescenza di cellule QD-etichettati.
    1. Utilizzare un obiettivo aereo 40X per le immagini con gli elenchi dei cellule marcate con QD655. Utilizzare un obiettivo ad immersione (per esempio, 63X) per consentire la raccolta più efficiente della luce fluorescenza emessa; questo è particolarmente necessario quando l'imaging cellule marcate con QD800.
    2. Utilizzare un cubo filtro che espone i QD alla luce di fluorescenza di eccitazione tra 340 e 380 nm, e permette la raccolta di luce emessa sopra 420 nm suitavolo per la maggior parte dei QD (filtro cubo A in questo caso).
    3. Ridurre al minimo l'intensità della luce per evitare la luce troppo intensa che potrebbe danneggiare il campione. Impostare il tempo di esposizione di almeno 300 msec, in modo che i segnali di tutti QD vengono catturati, notando che la fluorescenza di QD ha un comportamento lampeggiante.
    4. Regolare l'intensità della luce, e l'amplificazione di fornire immagini luminose senza rumore immagine visibile, riducendo al minimo l'intensità della luce.
      Nota: In alternativa, il tempo di esposizione più breve può essere utilizzata se serie di immagini sono prese dalla stessa regione. Queste serie può essere elaborato per produrre un'immagine massima sporgenza, portando a media e quindi la riduzione del rumore dell'immagine risultante.
  12. Posizionare il microchip ripreso posteriore (cellule verso l'alto) in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti pieni di BSA-PBS.
  13. Sciacquare microchip 1 volte in CB.
  14. Incubare a 2% GA per 10 min.
  15. Risciacquare 1 volta CB, e 3 volte con PBS-BSA.
  16. Conservare microchip fino ESEM imaging, in BSA-PBS pozzi pre-riempita di una nuova piastra a 96 pozzetti. Per ogni microchip riempire una fila di quattro pozzi con acqua HPLC.
    Nota: I campioni possono essere conservati a 4 ° C per diverse settimane, tuttavia, i migliori risultati si ottengono quando la serie completa di imaging viene eseguita entro due giorni. QD lentamente iniziare a staccarsi dal campione, non è pertanto raccomandato di aspettare più di 10 giorni prima di imaging ESEM è fatto.
    Nota: le immagini a fluorescenza vengono memorizzate per le analisi future. Le posizioni delle celle nelle immagini possono essere facilmente correlati con immagini di microscopia elettronica tramite localizzare gli angoli della finestra SiN e misurando le posizioni relative agli angoli.
    Nota: Si consiglia di stampare le immagini di fluorescenza di alta qualità e utilizzarli per scopi di orientamento durante la registrazione delle immagini ESEM.

5. Wet ESEM-STEM di cellule intere

  1. Preparare il ESEM per STEM bagnato
    1. Montare il gassoso secondario elettrone detector (GSED), e la fase di Peltier, contenente il rivelatore stelo (situato sotto il campione).
    2. Avviare il flusso di acqua di raffreddamento attraverso la fase, e impostare la temperatura a 3 ° C.
    3. Impostare la fase xy coordinate a zero, e regolare la distanza di lavoro di circa 6 mm.
  2. Durante la formazione immagine ESEM, tenere la piastra a 96 pozzetti con i microchip fresco, per esempio su elementi di raffreddamento congelati, in una scatola di polistirolo.
  3. Per il caricamento di un campione nella fase ESEM-STEM preraffreddato, prendere la piastra a 96 pozzetti dal contenitore di raffreddamento e posizionarlo vicino al palco ESEM aperto. Mettere un nuovo tessuto camera bianca accanto ad essa.
  4. Lavare rapidamente un microchip (con le cellule verso l'alto) immergendolo quattro volte, ogni volta per circa un secondo, in un pozzo pieno d'acqua HPLC.
  5. Tamponare il retro brevemente microchip sul tessuto stanza pulita e posizionare il microchip nella fase preraffreddato. Assicurarsi che le cellule rimangono bagnato, questo può esserericonosciuto da una superficie riflettente (essiccazione risultati in una superficie opaca).
  6. Bagnare la superficie del campione con 3 ml di acqua per HPLC raffreddato (fare attenzione a non toccare la superficie con la punta della pipetta), e fissare il campione in fase.
  7. Inserire tre ulteriori gocce d'acqua 3 microlitri sulla scena vicino al campione.
  8. Chiudere la camera del campione
  9. Spurgare la camera del campione dal ciclismo la pressione cinque volte tra 800 e 1.500 Pa. Terminare la ciclistica con 800 Pa.
  10. Portare il fascio di elettroni (30 kV) sul ed esaminare il campione sotto l'ingrandimento più basso con entrambi i rivelatori, cioè il GSED, e il rivelatore STEM per cercare la posizione della finestra microchip.
    Nota: se il livello dell'acqua è troppo spesso, la finestra potrebbe non essere visibile. In questo caso, iniziare ad abbassare la pressione di 760 Pa e attendere qualche minuto. La finestra diventa il primo visibile con il GSED.
  11. Posizionare la finestra della membrana peccato nel centro dell'immagine spostando il SPECIMit fase e ridurre la pressione a 750-720 Pa.
    Nota: Quando lo strato di acqua è abbastanza sottile, la finestra diventa anche visibile con il rivelatore stelo.
  12. Da ora l'uso sul segmento campo scuro del rilevatore STEM per registrare le immagini. In primo luogo, acquisire una o due immagini che mostrano tutte le celle l'intera area della finestra.
  13. Confrontare queste immagini ESEM con le immagini al microscopio luce, individuare i angoli della finestra SiN.
  14. Correlare le cornici di entrambe le modalità di microscopia coordinata confrontando l'ingrandimento, la rotazione, e possibile il mirroring. Individuare le stesse cellule in entrambe le immagini.
  15. Selezionare piccolissime particelle di sporco o una regione cella con piccole caratteristiche per regolare le impostazioni di imaging, come l'altezza eucentrica, perfettamente a fuoco e la correzione di lenti stigmatism. Operare a ingrandimento di almeno 50.000X, utilizzare una corrente di elettroni sonda circa 0,6 nA, un tempo di permanenza del pixel 30 ms, e una dimensione di immagine di 1024 x 884 pixel.
    Nota: altre impostazioni possono anche Be utilizzato finché si evita un aumento della dose di elettroni.
    Nota: Anche quando si lavora molto pulito, le superfici di chip saranno in pratica sempre contenere alcune particelle di sporco, perché il protocollo non viene eseguito in un ambiente sterile.
  16. Per registrare le immagini staminali da cellule QD marcato, fare riferimento alle immagini di fluorescenza e scegliere una cella di interesse.
    Nota: E 'meglio cominciare con un cellulare che mostra forti segnali QD.
  17. Registrare un'immagine panoramica STEM di questa cella.
  18. Vai a una regione periferica dove il confine cella è visibile e zoomare per raggiungere 50.000X ingrandimento.
  19. Registrazione di immagini che mostrano singoli QD, utilizzare tempi di sosta in pixel di 20-30 msec. Al fine di evitare danni da radiazioni, immagine ogni regione una sola volta con alto ingrandimento.
    Nota: Di solito, in questa fase sia, la messa a fuoco e la correzione del stigmatism, bisogno di qualche regolazione fine.
  20. Dopo la registrazione di un numero sufficiente di immagini ad alto ingrandimento, zoom-out, e acquaderno un'altra immagine panoramica STEM, raffigurante le regioni appena registrati con elevato ingrandimento come rettangoli scuri.
    Nota: queste immagini Panoramica saranno successivamente servirà per correlare le immagini ESEM e fluorescenza e per determinare la posizione esatta delle immagini ad alto ingrandimento all'interno del contesto cellulare.
  21. Procedere alla prossima cella di interesse, iniziare con un'immagine panoramica, registrare una serie di immagini ad alto ingrandimento, e terminare con un'immagine panoramica.
  22. Al termine di una sessione di imaging ESEM, aumentare la pressione di 850-900 Pa prima di iniziare a ventilare la camera.
    Nota: Questo aumento della pressione migliora la possibilità di recuperare il microchip con una superficie ancora bagnata; tuttavia, ciò non può sempre essere raggiunto. Un campione che non è mai stato essiccato può essere ripristinato in BSA-PBS e, se desiderato, una nuova inchiesta in ESEM in un momento successivo.

Risultati

Figura 1 e 2 mostrano immagini rappresentative di QD655 etichettato, EGFR di membrana visualizzate in intatti, COS-7 cellule completamente idratati. L'immagine DIC in figura 1 un dà l'impressione della topografia membrane delle cellule, e l'immagine di fluorescenza corrispondente nella Figura 1b mostra la distribuzione di EGFR dopo 3 min di EGF-biotina incubazione. Figura 1A e B sono ciascuno cuciti insieme da due le immagini registrate con un obiettivo di aria 40X. L'EGFR attivato EGF è distribuito su tutta la superficie cellulare. Nella maggior parte delle cellule un leggero miglioramento della fluorescenza (Figura 1B) può essere visto ai bordi delle celle, che indica un aumento locale verificarsi di EGFR 20. Esperimenti di controllo condotti utilizzando un protocollo simile verificati etichettatura specifico EGFR (dati non mostrati). Questi controlli inclusi: 1) una etichettatura controllo senza precedente incubazione della cells con EGF-biotina, cioè, solo incubazione con STR-QD, e 2) una incubazione con non biotinilato EGF e STR-QD.

Le tre celle contrassegnate con rettangoli sono stati ulteriormente studiati con ESEM-STEM. Le immagini ESEM-STEM rappresentati in Figura 1C - E mostrano bassi panoramiche ingrandimento di queste cellule. Queste immagini riflettono trasmissione cellule intere in stato idratato con uno strato sottile di acqua che risiedono sulla cella posta su un microchip di silicio con nitruro di silicio (SiN) finestra di visualizzazione. La camera a vuoto nel microscopio contenuta vapore acqueo, e l'equilibrio tra temperatura e pressione del campione è stato regolato per mantenere un sottile strato di liquido su cellule. Le singole cellule possono essere facilmente riconosciuti a causa della loro forma e posizione nella finestra membrane SiN. Le immagini ESEM-STEM a basso ingrandimento rivelano strutture fini, come filopodia, che si estende dal bordo cella verso le cellule vicine, e alcune struttureall'interno delle regioni cellulari più sottili. Regioni centrali cellulari spesse compreso nucleo appaiono bianchi in quanto la trasmissione attraverso il campione non è possibile per gli elettroni dell'energia utilizzata (30 keV).

Ad alta risoluzione le immagini ESEM-STEM sono stati registrati nelle regioni periferiche, più sottili. La risoluzione spaziale per ESEM-STEM di nanoparticelle nelle regioni sottili di cellule in uno strato liquido sottile è stato determinato in uno studio precedente 6 ammontare a 3 nm. Quattro immagini ad alta risoluzione mostrata in figura 2A - D sono stati registrati presso le posizioni dei piccoli rettangoli in Figura 1C - E. L'usato di ingrandimento è stato sufficiente a distinguere singoli QD, che appaiono, barre a forma di proiettile come luminose, ognuna destinata a un individuo EGFR. Il QD655 ha dimensioni tipiche di 6 x 14 nm 2.

Figura 2A (corrispondente all'area rettangolare indicata sulla cella in Figure 1C) mostra le etichette QD su una membrana di piega in diagonale che attraversa l'immagine. Questa struttura della membrana ha una densità maggiore di EGFR regioni membrana circostanti. In diverse località, due etichette erano a distanza ravvicinata. Due esempi con distanze di 20 e 24 nm, sono indicati con frecce. Queste coppie di etichette vengono interpretati come appartenenti a dimeri EGFR. Figura 2B mostra un esempio dal bordo di una cella (Figura 1D, bottone sinistro), monomeri EGFR e dimeri possono essere visti come bene. Figura 2C (Figura 1C, rettangolo destra) è stato registrato di una regione con un segnale di fluorescenza inferiore, cioè, una minore densità di EGFR. Tuttavia, EGFR è stato anche trovato qui in dimeri pure. Inoltre, due gruppi di 10 o 11 EGFRs erano presenti (vedi ellissi). La figura 2D mostra un altro esempio di una membrana piega (Figura 1E) con cluster più piccoli compresi 5-6 EGFRs, oltre a diversi monomerie dimeri.

Come esempio del tipo di informazioni che possono essere ottenute da questi dati, la coppia di correlazione funzione 21 g (x) è stata determinata per tutte le posizioni delle etichette in Figura 2. Si noti che questa analisi non è parte di questo protocollo e la procedura è stata descritta altrove 6,7. g (x) è una misura della probabilità di una particella si trovano entro una certa distanza radiale x da una particella di riferimento. g (x) = 1 rappresenta una distribuzione casuale, ed un valore maggiore è la prova per il clustering. Le posizioni di un totale di 210 etichette sono state rilevate automaticamente le quattro immagini di Figura 2A-D, e g (x) è stato calcolato utilizzando una dimensione bin di 5 nm e un filtro di livellamento con una larghezza di banda di 10 nm. La g (x) curva (figura 3) illustra una preferita QD distanza da centro a centro di 25 nm. EGFRs non sono dunque orientate casualmente ma una frazione significativa di essi risiede a questa distanza preferita. Da un approximatmodello molecolare e 6 (figura 3 riquadro) si stima che la distanza da centro a centro tra i QD e la tasca di legame EGF ammonta a ~ distanza 14 nm, e da centro a centro fra i due QD collegati ad un dimero EGFR a essere ~ 27 nm (questo valore può variare da pochi nanometri a causa della flessibilità del linker). La distanza label preferito è pertanto coerente con la distanza dell'etichetta prevista per il dimero EGFR all'interno della precisione del metodo. La g (x) curva è maggiore dell'unità a distanze fino a 300 nm, che indica la presenza di cluster, coerente con i dati. Questa analisi dimostra che la stechiometria del EGFR può essere studiato con il nostro metodo.

La figura 4 mostra un risultato simile a Figura 2, tranne che l'etichettatura è stata eseguita con EGF-QD800, e un obiettivo ad immersione 63X olio era usato per l'immagine di fluorescenza. Questi dati confermano che questi risultati tipici si trovano anche quandol'etichettatura EGFR è fatto con QD, che emettono nello spettro rosso vicino. figura 4A è l'immagine di fluorescenza di una cellula rappresentante, figura 4B mostra la stessa cella in modalità panoramica ESEM-STEM e la figura 4C è un ingrandimenti 150.000 x, registrato al confine membrana superiore della cella (vedi rettangolo in figura 4B). Simile alla figura 2A e D, le immagini catturano EGFR QD-marcato su una piega di membrana e mostra dei recettori monomerici, dimerici, e cluster. Si noti che l'elettrone nucleo denso QD appare più rotondo po 'più piccolo e di nuclei di QD che emette a 655 nm, in coerenza con la loro dimensione del nucleo ridotto di 22 ~ 5 nm.

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Figura 1. Correlativo DIC, fluorescenza e ESEM-STEM di EGF-QD655 etichettato EGFR in COS-7 completamente idratati celle rong>. (A) DIC immagine delle cellule cresciute sulla superficie vetrata membrana SiN, dando un'impressione topografica della membrana plasmatica. (B) immagine di fluorescenza che mostra le cellule sulla finestra membrana SiN situato in posizione centrale (segnato dal rettangolo tratteggiato). (C - E) Tre ESEM-STEM immagini a bassa ingrandenti da celle contrassegnate con rettangoli in A e B. Queste immagini Panoramica cellule servono per determinare la posizione precisa di immagini ad alta risoluzione successivamente registrati. La posizione di quattro immagini ad alta risoluzione (mostrato nella Figura 2A-D) sono contrassegnati con rettangoli bianchi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. ad alta risoluzione le immagini ESEM-STEM raffigurante membrana legato EGFR. (A) Micrografia a 75,000X ingrandimento della zona contrassegnata in figura 1B. Molti monomeri sono visibili. Diversi dimeri sono indicate con le frecce. (B) e (C) immagini acquisite a 50,000X ingrandimento di sinistra, destra, rispettivamente aree membrana contrassegnati nella Figura 1C. Grappoli di EGFR sono delineati. Immagine (D) registrato con 50,000X ingrandimento nella posizione segnato in figura 1D. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Pair funzione di correlazione g (x) in funzione della distanza radiale X determinato per l'inter-parti distanze CLE di tutti i 210 etichette identificati nella Figura 2A-D. Il picco a 25 nm indica che un QD distanza da centro a centro ha una probabilità molto più alta di verificarsi di casuale, per cui ag (x) = 1 indica una casualità. La linea tratteggiata è una guida per l'occhio che rappresenta g (x) di una distribuzione casuale. L'inserto mostra un modello molecolare di circa dimero EGFR con EGF legato e streptavidina rivestite QD collegati tramite biotina. I modelli di streptavidina, EGF e EGFR sono stati ottenuti da modelli CPK della 1stp (streptavidina), 1EGF (FEG), 1NQL, 2JWA, 1m17, strutture in Protein PDB Protein Databank, creato da Jmol Versione 1IVO e 2GS6 (EGFR) 12.2.15. Il modello di biotina è disegnato in RCSB Ligand Explorer versione 1.0. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. esemplare COS-7 cellule marcato con EGF-QD800 e ripreso con fluorescenza correlativa e ESEM-STEM. (A) immagine di fluorescenza, (B) basso Panoramica ingrandimento ESEM-STEM immagine. (C) l'immagine ad alta risoluzione registrato nella posizione del rettangolo in b a 150,000X ingrandimento. EGFR monomeri, dimeri, e cluster vengono rilevati simile all'etichettatura con EGF-QD655. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Studiando la distribuzione spaziale e stechiometria delle proteine ​​di membrana, quali l'EGFR, in cellule intere fornisce importanti informazioni contestuali sulla sua funzione ed eventuali modifiche thereof 11-14. Esso è impegnativo per studiare la distribuzione dei monomeri, dimeri e cluster direttamente a livello subcellulare mediante metodi biochimici comunemente usati, per cui la perdita di informazioni sulla localizzazione della proteina nella cellula o le differenze tra le cellule 15. L'etichettatura e microscopia metodi qui descritti permettono la visualizzazione di complessi proteici su una scala di lunghezza di pochi nanometri in modo che la sua stechiometria può essere studiato nell'ambito di singole cellule intatte 4-7. Questo non è possibile con (risoluzione super) microscopio ottico 23 in quanto la risoluzione non è sufficiente per distinguere molecole impegnati in un complesso proteico. Trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) è una tecnica di media insieme 24, e non necessariamente rilevare i dimeri ei cluster di ordine superiore come conseguenza del corto raggio del trasferimento di energia 25. Prossimità saggi legatura 26 realtà non misurano distanze e non sono quindi in grado di distinguere tra una regione cellulare ad alta densità di proteine, portando inevitabilmente ad un certo numero di prossimità rilevato da casualità, da una regione cellulare con una densità simile proteine, ma contenenti proteine complessi espositrici distanze distinte tra le etichette. L'elevata risoluzione richiesta per visualizzare i costituenti di complessi proteici è ottenuta mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Tuttavia, TEM convenzionale di cellule intere è limitato dal requisito di campioni sottili / affettatura attraverso la membrana plasmatica 27, o plasma membrana strappo o rottura off 28,29 conseguente pezzetti costituita fortuitamente su membrana sezioni. La membrana plasmatica non è quindi ripreso nel suo insieme, portando ad una mancanzadi forse cruciale informazioni contesto cellulare.

Altre sfide sperimentali per lo studio di proteine ​​stechiometria in cellule derivano da etichettatura proteine ​​applicata. Comunemente immunomarcatura utilizzato sopporta la difficoltà che uno-a-uno stechiometria tra ricettore e l'etichetta può essere raggiunto solo con una sonda monovalente; questo non è il caso quando sono richiesti anticorpi primari e secondari. Per ottenere informazioni sulla stechiometria proteine, è necessario che la sonda si lega unicamente per un epitopo sul recettore ed ha un sito di legame per una sonda a fluorescenza o un alto numero atomico nanoparticella sull'altro lato. In secondo luogo, la precisione ottenibile con l'anticorpo etichettatura è limitata a causa delle loro grandi dimensioni 30 al 30 nm, in modo che una discriminazione tra vicini singole proteine, omodimeri o cluster di grandi dimensioni non è fattibile, almeno per i recettori della famiglia EGFR. Molto più piccole etichette specifiche sono noti in letteratura e can essere applicata anche per l'etichettatura intracellulare 31 ma quelli non sono comunemente usati. La lunghezza di tutta l'etichetta (EGF-biotina-streptavidina-QD) è di una dimensione simile come EGFR, e sufficientemente piccolo da poter rilevare il dimero. Inoltre, la procedura di etichettatura in due fasi descritto evita etichettatura indotta recettore clustering.

Il nostro metodo non è molto difficile, non più di microscopia a fluorescenza di proteine ​​marcate. Tuttavia, un esperimento deve essere eseguito con grande attenzione, poiché il numero di passi e aggiunge un errore in uno dei passi può portare ad un fallimento completo nell'esperimento. Manipolazione dei microchip non è più noioso che la gestione delle reti di TEM, ma alcuni di formazione chip vuote è raccomandato. ESEM-stelo di cellule intere idrati è probabilmente l'aspetto più difficile, e richiede almeno un operatore esperto e diversi giorni di pratica per raggiungere una risoluzione di circa 3 nm come necessario per visualizzare i QD. Radiazioni digal'età del campione in esame presenta un rischio. La pressione e la temperatura devono essere attentamente sorvegliato per mantenere uno strato di acqua. Inoltre, lo spessore dello strato di acqua può variare tra le celle. Si consiglia di monitorare la presenza dello strato di acqua utilizzando il rivelatore di elettroni gassosa sopra il campione, come descritto altrove 6. Regioni cellulari dovrebbero essere ripreso solo una volta o due volte per evitare danni.

Un limite fondamentale del metodo è che informazioni ad alta risoluzione sulla ultrastruttura è assente. Altre tecniche, per esempio, crio TEM, sono necessari per studiare la struttura proteica, e l'ultrastruttura cellulare 15. In secondo luogo, studiando l'interazione dinamica di un multiplo di proteine ​​in cellule vive in microscopio time-lapse non è fattibile a causa dei danni da radiazioni, e richiede state-of-the-art di microscopia ottica 23. Attualmente, il nostro metodo non è in grado di determinare il livello assoluto di dimeri poiché lefficienza Abeling è nota, ma ci aspettiamo di aggiungere tali dati in futuro. E 'tuttavia possibile dire se sono presenti o meno dimeri. Dalla letteratura è noto che anche un'efficienza etichettatura circa il 15% è sufficiente a rilevare dimeri con significatività statistica sufficiente 32.

E 'facilmente possibile studiare altri recettori di membrana tramite il loro ligando, con frammenti Fab biotinilati di anticorpi specifici, o tramite altri piccoli linker 7 utilizzando il protocollo di etichettatura in due fasi descritto. Dal momento che abbiamo già dimostrato che due diversi colori (dimensioni) di QD può essere utilizzato, e l'etichettatura delle nanoparticelle d'oro è stato utilizzato nel lavoro precedente 6, sembra possibile etichettare più specie di proteine ​​nello stesso esperimento. La sfida chiave per lo studio della stechiometria di più specie proteiche è garantire un'efficienza etichettatura simile per entrambe le specie o almeno una normalizzazione della stechiometria relativa ottenuta sul rispettoive efficienze di etichettatura. Tuttavia, le due QDs diversi utilizzati in questo studio non sembrano differire molto dell'efficienza etichettatura (vedi figure 2 e 4). Il metodo descritto coinvolge etichettatura in due fasi con QD, e microscopia a fluorescenza correlativa e ESEM-STEM presenta un metodo praticabile per studiare la complessa interazione delle proteine ​​di membrana nelle membrane plasmatiche delle cellule intatte intere.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo E. Arzt per il suo supporto attraverso INM, M. Koch per l'aiuto con l'ESEM e DENS Solutions per aver fornito i microchip. Ricerca in parte sostenuta dal Concorso Leibniz 2013.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio a fluorescenza invertitaLeicaAF6000 + DMI6000B
ESEMFEI CompanyQuanta 400 FEG
DMEM (1x) + GlutaMax + glucosio + piruvatoGibco31966-021
DPBS (1x) - Cloruro di calcio - Cloruro di magnesioGibco14190-144
Siero fetale bovino, Performance Plus (FBS)Gibco16000-036
SpogliarellistaMediatech, Inc.25-056 Cl
Acqua, chromasolv Plus per HPLCSigma-Aldrich34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBSCarl Roth1058.1
Etanolo, Rotisolv HPLC gradoCarl RothP076.2
Frazione di albumina V, senza biotina (BSA)Carl RothO163.2
Gelatina, da pelle di pesce d'acqua freddaSigma-AldrichG7041-500G
GlycineCarl RothT873.1
Sonde molecolarifattore di crescita epidermicoE3477Biotina-XX coniugato (biotina EGF)
Teraborato di sodio decaidratoSigma-AldrichS9640-500G
Acido boricoSigma-AldrichB6768-500G
Qdot 655 streptavidina coniugatoSonde molecolari
Qdot 800 streptavidina coniugataSonde molecolariQ10173MP
Microchip di silicio con membrane in nitruro di silicio di 50 nm di spessore e dimensioni di 50 &; m x 0,40 mmSoluzioni DENSSu misura
delQ10121MP

Riferimenti

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