L'obiettivo di questo video è quello di dimostrare come eseguire l'estrazione del DNA automatizzato da inclusi in paraffina linee cellulari fissate in formalina (FFPE) di riferimento standard e delle gocce digitali PCR (ddPCR) analisi per individuare mutazioni rare in un ambiente clinico. Rilevamento mutazioni nei campioni FFPE dimostra l'utilità clinica di ddPCR in campioni FFPE.
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Articolo metodologico
Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard
In questo articolo
Sommario
Abstract
ddPCR è un metodo PCR altamente sensibile che utilizza un sistema di emulsione acqua-olio. Utilizzando un generatore di goccioline, un campione di acido nucleico estratto viene suddiviso in ~20.000 goccioline di acqua in olio di dimensioni nanometriche e l'amplificazione PCR avviene in singole goccioline. L'approccio della ddPCR consiste nell'identificare mutazioni di sequenza, alterazioni del numero di copie e selezionare riarrangiamenti strutturali che coinvolgono geni mirati. Qui, dimostriamo l'uso della ddPCR come potente tecnica per quantificare con precisione le rare mutazioni di BRAF V600E nelle linee cellulari standard di riferimento FFPE, che è utile per identificare gli individui con cancro. In conclusione, la tecnica ddPCR offre il potenziale per profilare con precisione le mutazioni rare specifiche in diversi geni in vari tipi di campioni FFPE.
Introduzione
L'accumulo di mutazioni genetiche nei principali geni regolatori altera programmazione cellula normale come la proliferazione cellulare, il differenziamento e la sopravvivenza, che porta al cancro 1. La chinasi RAS-RAF-MAP media le risposte cellulari ai segnali di crescita. Mutazioni BRAF oncogeno possono derivare da mutazioni del driver nel gene BRAF, che possono causare il BRAF oncoprotein a diventare iperattiva 2. Le mutazioni nel gene BRAF anche tradursi nella segnalazione a valle iperattiva tramite MEK e ERK 3, che, a sua volta, porta alla crescita eccessiva delle cellule e la proliferazione indipendentement....
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Protocollo
1. Estrazione del DNA da linee cellulari FFPE di riferimento standard
Nota: Per questa procedura, estrazione del DNA è stata effettuata da linee cellulari standard di riferimento FFPE (HD598, HD593, HD617, HD273 e di tipo selvatico (WT)) utilizzando il tessuto DNA Kit di isolamento FFPE come descritto nel protocollo di seguito. Estrazione del DNA automatizzato è stato ottenuto seguendo le istruzioni del produttore per l'estrazione del DNA totale.
- Utilizzando un microtomo e il blocco FFPE originale, preparare manualmente sezioni fresche prima di estrazione del DNA e analisi, secondo le procedure stabilite. Assicurarsi che l&....
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Risultati
Per la nostra analisi ddPCR, abbiamo studiato le linee di cellule normali di riferimento mutazione FFPE BRAFV600E. Il lettore droplet si connette a un software portatile di analisi dei dati del computer in esecuzione. Ogni singola goccia viene definita sulla base dell'ampiezza fluorescente come positivo o negativo. Il software fornito dal produttore permette anche un taglio definito dall'utente da immettere per definire la soglia tra le goccioline positivi e negativi. Il numero di goccioline positivi e .......
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Discussione
Qui, si evidenzia l'applicabilità di ddPCR e isolamento del DNA da campioni di linee cellulari normali di riferimento FFPE una specifica valutazione mutazione del gene. In questo studio, TPS DNA metodo di isolamento automatico viene utilizzato, che può essere facilmente adattato, automatizzato, e può ospitare fino a 48 campioni diversi contemporaneamente, consentendo per esperimenti su scala più ampia e bassa variabilità. Uno dei limiti di isolamento del DNA nel presente lavoro è che ogni campione FFPE è unico, e va.......
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Dichiarazioni
Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim e Young Kim Deug sono dipendenti di ABION CRO.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di ricerca e sviluppo per la società della Fondazione Nazionale delle Ricerche (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT & Future Pianificazione (Grant No. 2013M3C8A1075908).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD strumento | Siemens | 10701001 | Strumento automatizzato per l'isolamento del DNA |
| QX200 Generatore di gocce | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Lettore di gocce | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Macchina PCR convenzionale in grado di regolare | 621BR17718 | ||
| PX1 Sigillante per piastre PCR | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| Software QuantaSoft | Bio-Rad | ||
| VERSANT Reagenti per la preparazione dei tessuti Scatola 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Reagenti per la preparazione dei tessuti Scatola 1 | Suggerimenti Siemens | 10632399 | |
| CO-RE | |||
| ddPCR | |||
| Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | |
| Cartuccia DG8 a concentrazione 2X | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Olio generatore di goccioline | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Guarnizione | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Olio lettore di gocce | Bio-Rad | BR-186-3004 |
Riferimenti
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B.,
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Ristampe e permessi
