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Articolo metodologico

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

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DOI:

10.3791/53197

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10 ottobre 2015

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1Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, 2CNRS URA 2182 'Genes, synapses and cognition', Institut Pasteur, 3Human Genetics and Cognitive Functions, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Plateforme d' Imagerie Dynamique, Imagopole, CiTech, Institut Pasteur, 5Neuroplasticity and Therapeutics, CECS, I-STEM, AFM, Evry

In questo articolo

Sommario

Spine dendritiche di neuroni piramidali sono i siti di maggior sinapsi eccitatorie in mammiferi corteccia cerebrale. Il metodo descrive un'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale nei neuroni piramidali glutamatergici corticali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.

Abstract

Spine dendritiche sono piccole sporgenze che corrispondono ai compartimenti post-sinaptici di sinapsi eccitatorie nel sistema nervoso centrale. Essi sono distribuiti lungo i dendriti. La loro morfologia dipende in gran parte l'attività neuronale, e sono dinamici. Spine dendritiche esprimono i recettori glutamatergici (recettori AMPA e NMDA) sulla loro superficie e ai livelli di densità postsinaptiche. Ogni colonna vertebrale permette al neurone di controllare la propria attività statali e locali in modo indipendente. Morfologie della colonna vertebrale sono stati ampiamente studiati in cellule piramidali glutammatergici della corteccia cerebrale, utilizzando entrambi gli approcci in vivo e colture neuronali ottenute da tessuti di roditori. Condizioni neuropatologiche possono essere associate all'induzione colonna vertebrale alterata e maturazione, come mostrato in roditori neuroni in coltura e analisi quantitativa unidimensionale 1. Il presente studio descrive un protocollo per l'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale utilizzando cortic umanoAl neuroni derivati ​​da cellule staminali neurali (progenitrici fine corticali). Queste cellule sono state inizialmente ottenute da cellule staminali pluripotenti indotte. Questo protocollo permette l'analisi di morfologie della colonna vertebrale in periodi diversi della cultura, e con possibilità di confronto tra le cellule staminali pluripotenti indotte ottenuti da individui di controllo con quelli ottenuti da pazienti con malattie psichiatriche.

Introduzione

Spine dendritiche di neuroni piramidali corticali sono piccoli e sottili protuberanze che sono distribuiti lungo i dendriti basali e apicali di questi sottotipi neuronali in roditori, primati, e il cervello umano. Sono i luoghi di maggior sinapsi eccitatorie e visualizzare funzioni chiave nell'apprendimento e processi cognitivi. Le strutture dettagliate delle spine dendritiche umani sono stati tecnicamente studiati da microscopia elettronica 2. Tuttavia, tale approccio è che richiede tempo e rappresenta pesante carico di lavoro. Più recentemente, un tridimensionale (3D) ricostruzione della morfologia delle spine dendritiche è stata riportata nella corteccia cerebrale umana usando software specifico combinato a grandi analisi colonna 3 manuale.

Tecnologia verde proteina fluorescente (GFP) accoppiato ad immunofluorescenza rappresenta uno strumento preciso per l'identificazione della colonna vertebrale e la misurazione forma al microscopio a fluorescenza. Questo approccio può essere facilmente applicato a colture neuronali. However, i dati non sono stati riportati sull'analisi di maturazione della colonna vertebrale e della morfologia dei neuroni umani derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC).

L'obiettivo di questo studio è stato quello di descrivere un protocollo, che permette di spine dendritiche di imaging da colture di neuroni umani in vitro. Etichettatura GFP, microscopia confocale e analisi 3D con il modulo Filament Tracer di software Imaris sono stati utilizzati nel presente protocollo. Cultura passi che sono necessari per ottenere i neuroni glutamatergici corticali degli strati II-IV da cellule staminali neurali (NSC) sono anche brevemente descritto qui. L'intero protocollo per la produzione NSC umano è già stato pubblicato altrove 4.

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Protocollo

1. Cultura neuronale

Nota: riprogrammazione dei fibroblasti in cellule staminali pluripotenti, l'impegno per il lignaggio telencefalo dorsale, derivazione, amplificazione, e delle banche dei progenitori tardivi corticali (LCP) sono state descritte in Boissart et al 4. La differenziazione neuronale di cellule LCP-simile è stato effettuato anche secondo Boissart et al 4 con lievi modifiche. Sono state sviluppate altre procedure per la riprogrammazione diretta dei fibroblasti in cellule staminali pluripotenti indotte seguita dalla loro differenziazione in neuroni. Questo protocollo è stato mantenuto poiché consente la produzione selettiva di neuroni glutamatergici piramidali.

  1. Trattare 6 pozzetti piastre di coltura con vetrini con poli-ornitina (diluito a 1/6 in DPBS, concentrazione della 0,01%) O / N, seguita da tre lavaggi in DPBS. Quindi aggiungere laminina (concentrazione magazzino 1 mg / ml, diluito 500 volte in DPBS) per almeno 10 ore sotto cappa a flusso .
  2. Piatto e inviare NSC a bassa densità (50.000 cellule / cm 2) a 6 pozzetti piastre di coltura con vetrini in 3 ml di terreno di coltura costituito da DMEM / F12 (500 ml), 2 flaconi (5 ml) di N2 supplemento, 2 flaconi (10 ml ciascuna) di supplemento B27, 10 ml di Pen-streptomicina (Penicillina = 10.000 unità / ml e streptomicina = 10.000 unità / ml), 1 ml di 2-mercaptoetanolo (Soluzione madre: 50 mm) e laminina (1 / 500), senza fattori di crescita. PUNTO CRITICO: Eseguire questo passo con attenzione con l'aggiunta di cellule con movimenti lenti rotanti al fine di ridurre il clustering delle cellule.
  3. Rimuovere il terreno di coltura. Aggiungere mezzo N2B27 fresco contenente 2 mg / ml di soluzione laminina fresco per mantenere il neurone attaccato sui vetrini ed evitare grumi. Cambia il mezzo ogni 3 giorni. Mantenere un po 'del fluido rimanente (200 ml) prima di aggiungere mezzo fresco per evitare la cella da essiccazione. In alternativa, procedere rapidamente e modificare il volume totale (3 ml).
e_title "> 2. lentivirali trasduzione

Nota: vettori lentivirali GFP sono stati gentilmente forniti dal Dr. Uwe Maskos laboratorio presso l'Istituto Pasteur (Parigi) e preparati secondo il protocollo pubblicato 5. GFP è guidata dal promotore del mouse fosfoglicerato chinasi (PGK). Per questo studio, titolo virale è stato pari a 400 ng / ml (soluzione madre in PBS 1x).

  1. Trasdurre umane neuroni IPSC-derivati ​​in ogni fase di maturazione da particelle virali con l'aggiunta di 1 ml di soluzione madre contenente 40 ng di GFP vettori lentivirali per la cultura (ben 6 pozzetti) e incubare per 48 ore in terreno di coltura fresco. Nota: per questo protocollo, la durata dell'incubazione permette una buona etichettatura delle strutture della colonna vertebrale.

3. immunofluorescenza

Nota: Al fine di migliorare l'etichettatura di tutta la morfologia della colonna vertebrale, etichettatura immunofluorescenza è stata effettuata utilizzando un anticorpo anti-GFP in condizioni permeabilizzate.

  1. Togliere terreno di coltura e riparare cellule trasdotte su vetrini in paraformaldeide al 4% per 10 min a temperatura ambiente, poi lavare 3 volte in 1x PBS (10 minuti ciascuno).
  2. Coprioggetto immergere in PBS integrato con 0,05% Triton (100x) e il 10% siero di cavallo per 1 ora a temperatura ambiente, poi lavare 3 volte in 1x PBS.
  3. Aggiungere 100 pl di PBS 1x integrato con siero di cavallo 4% e anticorpo primario (1 / 1.000) sollevata contro GFP e diluito di un fattore di 1,000 su ciascun vetrino. Incubare in una scatola buia O / N a 4 ° C, quindi lavare 3 volte con PBS 1x.
  4. Diluire Alexa Fluor 488 coniugato anticorpo (1/200) in PBS integrato con 0,5% di Tween 20 e incubare per 1 ora a RT. Quindi lavare 3 volte in PBS 1x e montare coprioggetto su vetrini con mezzo di montaggio per la microscopia a fluorescenza.

4. spine dendritiche Imaging

  1. Eseguire confocale Imaging attraverso un microscopio confocale a scansione laser.
  2. Selezionare neuroni sani con una morfologia piramidaletrovare una dendritica pieno, e quantificare almeno 10 neuroni per condizione da esperimenti separati. Quantificare 60-100 micron per dendriti.
  3. Acquisire le immagini utilizzando un olio 40X NA = 1.3 obiettivo e una linea laser 488 nm per GFP di eccitazione, con una potenza di picco tipica a livello di campione di circa 20? W. Imposta la dimensione dei pixel circa 80 nm per assaggiare correttamente spine dendritiche.
    Nota: La successiva chiamata analisi per un'immagine in cui il rumore non compromette la corretta segmentazione dei dendriti e spine. Con le impostazioni di campionamento e di potenza spaziale di cui sopra, abbiamo osservato che un pixel di sosta a tempo di 3.15 ms è sufficiente per raccogliere abbastanza fotoni per costruire una tale immagine. Per campioni dim, la qualità dell'immagine può essere migliorata facendo la media da 2 a 4 scansioni. L'acquisizione di diverse piastrelle XY può essere necessario per coprire la regione di interesse, che poi deve essere cucita insieme prima della trasformazione.
  4. Per campionare l'intero volume neurone, acquisire un Z-stack, conZ spaziatura da 150 nm a 300 nm, producendo 20 a 30 fette Z.
    Nota: La risoluzione spaziale laterale realizzato con queste impostazioni è 234 nm e la risoluzione assiale è 591 nm. Il campionamento prescelto qui è adeguata, ma la risoluzione assiale è maggiore della dimensione minima delle spine da acquisire, l'analisi favorisce le spine che si estendono lateralmente da dendriti.

5. 3D Quantificazione di spine dendritiche

Nota: Le seguenti sezioni specificamente descrivono l'uso del software Imaris per l'analisi. Esistono implementazioni alternative, tra cui NeuronStudio 15 o Metamorph 8, che può fornire risultati simili.

Utilizzare le seguenti impostazioni chiave:

  1. Come una fase di pre-processing, utilizzare il filtraggio gaussiana attraverso i servizi di elaborazione delle immagini offerte dal software. Eseguire il filtraggio gaussiano via Elaborazione immagini> Smoocosa> Filtro gaussiana. Impostare la larghezza del filtro di essere uguale alla dimensione dei pixel in XY.
  2. Eseguire un tracciato semi-automatica dei dendriti, utilizzando il modulo Filament Tracer del software.
    1. Innanzitutto, stimare il diametro dendrite, utilizzando lo strumento distanza nella scheda Fetta del software.
    2. Nella scheda Surpass, fare clic sullo strumento filamenti. Per una migliore robustezza, questo protocollo si basa su di tracking semi-automatico; clicca su Skip creazione automatica. L'interfaccia del modulo ora sta mostrando la scheda Draw. Qui, seleziona AutoPath come metodo, Dendrite come tipo, e il diametro di ingresso dendrite stimato.
    3. Utilizzare la Selezionare la modalità del puntatore, trasformando il cursore in una scatola. Shift-pulsante destro del mouse sul punto di partenza dendriti. Nota: il software esegue calcoli iniziali.
    4. Spostare il puntatore lungo dendrite. Dal punto di partenza (rappresentareDE come una sfera blu), è mostrata una linea gialla che rappresenta il percorso dendrite più probabile. Shift-sinistra del mouse sul punto finale dendriti.
  3. Eseguire la spine di segmentazione automatica. Nota: Le spine sul dendrite tracciato si trovano automaticamente l'interfaccia del modulo.
    1. Nell'interfaccia del modulo, fare clic sulla scheda Creazione. Nel Ricostruisci casella di riepilogo, scegliere Rebuild Dendrite Diametro e selezionare la casella di dati Mastio. Quindi fare clic su Ricostruisci.
    2. Impostare la soglia in modo che il volume segmentato corrispondente al volume effettivo dendrite. Come un algoritmo, selezionare più breve distanza dal Mappa distanza. Fare clic sul pulsante Avanti.
    3. Determinare il più piccolo diametro della testa della colonna vertebrale e la lunghezza massima, sempre utilizzando lo strumento distanza nella scheda Fetta di software, per poi tornare alla scheda Surpass e immettere i parametri. Fo questo protocollo, i valori intorno a 200-300 nm per il diametro minimo e 4 micron per la lunghezza massima sono buoni punti di partenza. Non selezionare la casella Consenti Branch Spine. Fare clic sul pulsante Avanti.
    4. Regolare la soglia Punti di semi in modo che i punti blu rappresentano spine localizzano alle teste della colonna vertebrale reali. Fare clic sul pulsante Avanti. Nota: Il calcolo nucleo è fatto ora e può essere lungo.
  4. Classificare spine andando alla scheda Strumenti dell'interfaccia modulo. Clicca su Classifica Spine. Nell'interfaccia utente viene richiesto, assicurarsi che non vi sono quattro classi, definite dalla loro morfologia come segue: tozza: lunghezza <1 micron; Funghi: Lunghezza (colonna vertebrale)> 3 e la larghezza massima (testa)> significano larghezza (collo) x 2; Lungo e sottile: Media larghezza (testa) ≥ media larghezza (collo); Filopodia simile: Lunghezza ≤ 4 micron (senza testa).
    Nota: il moInterfaccia Dule genera quattro nuovi oggetti ad incandescenza contenenti i risultati della classificazione.
  5. Esportazione Dati statistici: su uno di questi quattro interfacce degli oggetti, vai alla scheda Statistiche.
    Clicca sui Esporta tutte le statistiche su File.
    Nota: Altri valori statistici possono essere esportati per dendriti (es., Lunghezza, area, diametro, profondità ramo, diramazione angolo, volume, ecc media.), E per spine (per esempio, rettilineità, zona di attacco, la lunghezza e il volume di distinta parti della colonna vertebrale, del diametro della colonna vertebrale, densità, ecc.)

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Risultati

Il presente studio descrive un protocollo standardizzato per la quantificazione della colonna vertebrale dei dendriti coltura di neuroni piramidali derivati ​​da IPSC. Questo protocollo permette l'analisi della colonna maturazione sui neuroni umani e la sua possibile confronto con la maturazione delle spine in colture neuronali roditore standard così come in vivo in modelli animali.

Figura 1A rappresenta uno schema delle varie fasi di coltura che permetton...

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Discussione

La quantificazione delle caratteristiche morfologiche di neuroni piramidali invocato il software. L'interfaccia Filament Tracer è stato utilizzato per la segmentazione dei neuroni e spine, e il modulo XT è stato utilizzato per l'analisi.

Per analizzare la precisione della nostra tecnica, in primo luogo abbiamo confrontato i parametri morfologici misurati (lunghezza, area e volume totale della colonna vertebrale se applicabile), con quelli pubblicati utilizzando ratto neuroni piramida...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dall'Institut Pasteur, dalla fondazione Bettencourt-Schueller, dal Centre National de la Recherche Scientifique, dall'Università Paris Diderot, dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), la Fondazione di beneficenza Conny-Maeva, la Fondazione Cognacq Jay, la Fondazione Orange e la Fondazione Fondamental. L.G. è supportato da una borsa di studio universitaria del Ministero della Salute. Ringraziamo l'aiuto di BitPlane, in particolare di Georgia Golfis, nella fase iniziale di questo lavoro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
D-PBS (1x), senza calcio, magnesio e fenolo rossoGibco/ Life Technologies14190169
Soluzione di poli-L-ornitina BioreagenteSigma AldrichP4957
Lamina di topoDutscher Dominique354232
N2 IntegratoreGibco/ Life Technologies17502048
B-27 senza vitamina A (50x)Gibco/ Life Technologies12587010
DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-IGibco/ Life Technologies31331028
Neurobasal Med SFMGibco/ Life Technologies21103049
2-mercaptoetanoloGibco/ Life Technologies31350-010
Penicillina-SteptomicinaGibco/ Life Technologies15140-122
GFP Siero di coniglio Anticorpo policlonaleGibco/ Life TechnologiesA-6455
Siero per cavalliGibco/ Life Technologies16050130
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit Gibco/ Life TechnologiesA11034
Anticorpo policlonale anti-betaIII tubulinaMilliporeAB9354
Coverglass 13 mmVWR631-0150
Reagente antisbiadimento Prolong Gold con DAPIGibco/ Life TechnologiesP36931
Tween(R) 20 Bioextra, liquido viscosoSigma Aldrich ChimieP7949
Triton X-100Sigma Aldrich ChimieX100-100ML
Fibroblasti umaniBiorepository della linea cellulare CoriellGM 4603 e GM 1869Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
Microscopio a scansione laser confocaleZeiss (Germania)LSM 700
Imaris SoftwareBitplane AG, Zurigoversione 6.4.0Sono necessari i moduli Filament Tracer e Imaris XT
Software Huygens SoftwareHuygens, SVI, Paesi BassiVersione ProOpzionale (per test di deconvoluzione)

Riferimenti

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