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Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

DOI:

10.3791/53197

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October 10th, 2015

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1Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, 2CNRS URA 2182 'Genes, synapses and cognition', Institut Pasteur, 3Human Genetics and Cognitive Functions, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Plateforme d' Imagerie Dynamique, Imagopole, CiTech, Institut Pasteur, 5Neuroplasticity and Therapeutics, CECS, I-STEM, AFM, Evry

In This Article

Summary

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Spine dendritiche di neuroni piramidali sono i siti di maggior sinapsi eccitatorie in mammiferi corteccia cerebrale. Il metodo descrive un'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale nei neuroni piramidali glutamatergici corticali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.

Abstract

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Spine dendritiche sono piccole sporgenze che corrispondono ai compartimenti post-sinaptici di sinapsi eccitatorie nel sistema nervoso centrale. Essi sono distribuiti lungo i dendriti. La loro morfologia dipende in gran parte l'attività neuronale, e sono dinamici. Spine dendritiche esprimono i recettori glutamatergici (recettori AMPA e NMDA) sulla loro superficie e ai livelli di densità postsinaptiche. Ogni colonna vertebrale permette al neurone di controllare la propria attività statali e locali in modo indipendente. Morfologie della colonna vertebrale sono stati ampiamente studiati in cellule piramidali glutammatergici della corteccia cerebrale, utilizzando entrambi gli approcci in vivo e colture neuronali ottenute da tessuti di roditori. Condizioni neuropatologiche possono essere associate all'induzione colonna vertebrale alterata e maturazione, come mostrato in roditori neuroni in coltura e analisi quantitativa unidimensionale 1. Il presente studio descrive un protocollo per l'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale utilizzando cortic umanoAl neuroni derivati ​​da cellule staminali neurali (progenitrici fine corticali). Queste cellule sono state inizialmente ottenute da cellule staminali pluripotenti indotte. Questo protocollo permette l'analisi di morfologie della colonna vertebrale in periodi diversi della cultura, e con possibilità di confronto tra le cellule staminali pluripotenti indotte ottenuti da individui di controllo con quelli ottenuti da pazienti con malattie psichiatriche.

Introduction

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Spine dendritiche di neuroni piramidali corticali sono piccoli e sottili protuberanze che sono distribuiti lungo i dendriti basali e apicali di questi sottotipi neuronali in roditori, primati, e il cervello umano. Sono i luoghi di maggior sinapsi eccitatorie e visualizzare funzioni chiave nell'apprendimento e processi cognitivi. Le strutture dettagliate delle spine dendritiche umani sono stati tecnicamente studiati da microscopia elettronica 2. Tuttavia, tale approccio è che richiede tempo e rappresenta pesante carico di lavoro. Più recentemente, un tridimensionale (3D) ricostruzione della morfologia delle spine dendritiche è stata riportata nella cort....

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Protocol

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1. Cultura neuronale

Nota: riprogrammazione dei fibroblasti in cellule staminali pluripotenti, l'impegno per il lignaggio telencefalo dorsale, derivazione, amplificazione, e delle banche dei progenitori tardivi corticali (LCP) sono state descritte in Boissart et al 4. La differenziazione neuronale di cellule LCP-simile è stato effettuato anche secondo Boissart et al 4 con lievi modifiche. Sono state sviluppate altre procedure per la riprogrammazione diretta dei fibroblasti in cellule staminali pluripotenti indotte seguita dalla loro differenziazione in neuroni. Questo protocollo è stato mantenuto ....

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Results

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Il presente studio descrive un protocollo standardizzato per la quantificazione della colonna vertebrale dei dendriti coltura di neuroni piramidali derivati ​​da IPSC. Questo protocollo permette l'analisi della colonna maturazione sui neuroni umani e la sua possibile confronto con la maturazione delle spine in colture neuronali roditore standard così come in vivo in modelli animali.

Figura 1A rappresenta uno schema delle varie fasi di coltura che permettono la produ.......

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Discussion

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La quantificazione delle caratteristiche morfologiche di neuroni piramidali invocato il software. L'interfaccia Filament Tracer è stato utilizzato per la segmentazione dei neuroni e spine, e il modulo XT è stato utilizzato per l'analisi.

Per analizzare la precisione della nostra tecnica, in primo luogo abbiamo confrontato i parametri morfologici misurati (lunghezza, area e volume totale della colonna vertebrale se applicabile), con quelli pubblicati utilizzando ratto neuroni piramida.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato finanziato dall'Institut Pasteur, dalla fondazione Bettencourt-Schueller, dal Centre National de la Recherche Scientifique, dall'Università Paris Diderot, dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), la Fondazione di beneficenza Conny-Maeva, la Fondazione Cognacq Jay, la Fondazione Orange e la Fondazione Fondamental. L.G. è supportato da una borsa di studio universitaria del Ministero della Salute. Ringraziamo l'aiuto di BitPlane, in particolare di Georgia Golfis, nella fase iniziale di questo lavoro.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
D-PBS (1x), senza calcio, magnesio e fenolo rossoGibco/ Life Technologies14190169
Soluzione di poli-L-ornitina BioreagenteSigma AldrichP4957
Lamina di topoDutscher Dominique354232
N2 IntegratoreGibco/ Life Technologies17502048
B-27 senza vitamina A (50x)Gibco/ Life Technologies12587010
DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-IGibco/ Life Technologies31331028
Neurobasal Med SFMGibco/ Life Technologies21103049
2-mercaptoetanoloGibco/ Life Technologies31350-010
Penicillina-SteptomicinaGibco/ Life Technologies15140-122
GFP Siero di coniglio Anticorpo policlonaleGibco/ Life TechnologiesA-6455
Siero per cavalliGibco/ Life Technologies16050130
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit Gibco/ Life TechnologiesA11034
Anticorpo policlonale anti-betaIII tubulinaMilliporeAB9354
Coverglass 13 mmVWR631-0150
Reagente antisbiadimento Prolong Gold con DAPIGibco/ Life TechnologiesP36931
Tween(R) 20 Bioextra, liquido viscosoSigma Aldrich ChimieP7949
Triton X-100Sigma Aldrich ChimieX100-100ML
Fibroblasti umaniBiorepository della linea cellulare CoriellGM 4603 e GM 1869Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
Microscopio a scansione laser confocaleZeiss (Germania)LSM 700
Imaris SoftwareBitplane AG, Zurigoversione 6.4.0Sono necessari i moduli Filament Tracer e Imaris XT
Software Huygens SoftwareHuygens, SVI, Paesi BassiVersione ProOpzionale (per test di deconvoluzione)

References

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  1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
  2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J.

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