A Novel cultura Modello pluripotenti staminali umane propagazione delle cellule su Gelatina in Media Placenta condizionata

Sommario

Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficiente per propagare le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) utilizzando solo terreni condizionati derivati dalla placenta umana in un piatto rivestito di gelatina senza ulteriori supplementazioni esogene o substrati sintetici specifici per hPSC.

Abstract

La propagazione di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in terreno condizionato derivato da cellule umane in condizioni di coltura senza alimentatore è stata di interesse. Tuttavia, non è stato sviluppato un metodo di propagazione ideale ex vivo ex vivo senza feeder per le hPSC; attualmente, ulteriori substrati esogeni, tra cui il fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF), un fattore principale che sostiene l'hPSC, vengono aggiunti a tutti i terreni di coltura e substrati sintetici come Matrigel o laminina vengono utilizzati in tutte le colture prive di alimentatore. Recentemente, il nostro gruppo ha sviluppato un protocollo semplice ed efficiente per la propagazione delle hPSC utilizzando solo terreni condizionati derivati dalla placenta umana su un piatto rivestito di gelatina senza supplementazione esogena aggiuntiva o substrati sintetici specifici per le hPSC. Questo protocollo non è stato riportato in precedenza e potrebbe consentire ai ricercatori di propagare le hPSC in modo efficiente in condizioni di coltura umanizzata. Inoltre, questo modello ovvia ai rischi di contaminazione da hPSC da parte di prodotti animali come virus o proteine sconosciute. Inoltre, questo sistema facilita la facile produzione di massa di hPSC utilizzando il rivestimento in gelatina, che è semplice da maneggiare, riducendo drasticamente i costi complessivi della manutenzione ex vivo dell'hPSC.

Introduzione

L'obiettivo di questo protocollo è la propagazione di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), comprese le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in condizioni completamente umanizzate ex vivo prive di feeder, senza richiedere ulteriori supplementazioni esogene e substrati sintetici. Ad oggi, lo sviluppo di modelli di coltura di hPSC ex vivo, che consentono l'introduzione di prodotti di coltura in clinica, è stata una delle principali preoccupazioni nella ricerca sulle cellule staminali. In particolare, è necessario affrontare due problemi critici. In primo luogo, è necessario un sistema di coltura ex vivo umanizzato per la propagazione delle hPSC che ovvi al rischio di contaminazione da prodotti cellulari animali. In secondo luogo, è necessario un modello di coltura senza alimentatore per facilitare la produzione di massa facile ed economica di hPSC. Per le applicazioni terapeutiche delle hPSC, è necessario identificare i fattori che ne regolano l'auto-rinnovamento e la differenziazione.

Poiché Xu et al. hanno inizialmente riportato la fattibilità dell'utilizzo di terreni condizionati (CM) derivati da fibroblasti embrionali di topo (MEF) per far crescere hESC su Matrigel¹, molti studi hanno esaminato metodi di propagazione ex vivo ottimali per hPSCs^2-4. Tuttavia, non è stato sviluppato un sistema di propagazione ideale di hPSC umanizzato ex vivo senza feeder perché i metodi attuali richiedono substrati esogeni aggiuntivi tra cui bFGF e insulina, noti fattori che sostengono l'hPSC, nei terreni di coltura^5-7. Inoltre, substrati sintetici come il Matrigel o la laminina sono utilizzati in tutte le colture prive di alimentatore.

Il razionale alla base dello sviluppo e dell'uso di questo protocollo si basa sui nostri studi precedenti che dimostrano che le cellule del corion della placenta umana supportano in modo eccellente la propagazione delle hPSC senza l'integrazione di bFGF^8-11. Questo protocollo presenta una serie di vantaggi, tra cui la sua semplicità di manipolazione e il suo rapporto costo-efficacia, ed è una coltura umanizzata quasi perfetta che consente la propagazione dell'hPSC senza substrati sintetici esogeni. L'applicazione del CM derivato dalla placenta umana (hPCCM) per le hPSC prevede 3 fasi. In primo luogo, le cellule del corion vengono isolate dalla placenta umana e coltivate. In secondo luogo, l'hPCCM è prodotto da cellule in coltura. In terzo luogo, le hPSC vengono coltivate utilizzando hPCCM e le loro caratteristiche sono confermate.

Questo protocollo faciliterà le applicazioni cliniche delle hPSC e gli studi sui meccanismi di proliferazione e attaccamento delle hPSC. In questo articolo, viene presentato il protocollo per la propagazione di hPSCs in hPCCM su un piatto rivestito di gelatina.

Protocollo

Etica dichiarazione: Lo studio è stato condotto placenta umana prospetticamente, con l'approvazione del Institutional Review Board per la ricerca umana della University Korea (AN09085-001). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in un Germ-Free Clean facility in camera presso il Medical Center Korea University. Il design e le procedure che utilizzano hPSCs sperimentale sono state approvate dal Institutional Review Board della Korea University Medical Center (AN12277-003).

1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti

1. Coat tutti i piatti della cultura con il 0,1% di gelatina. Salino Autoclave tampone fosfato (PBS) e pinze. Sterilizzare forbici chirurgiche, tubi microcentrifuga, e garze a 121 ° C sotto £ 15 psi per più di 15 min.
2. 0,25% tripsina-etilene ammina tetra-acetico preparati pre-riscaldato (tripsina-EDTA) e mezzi di pre-riscaldato cultura filtrato (DMEM) contenente siero bovino fetale 20% (FBS), 100 U / ml di penicillina, e 100 g / ml streptomycin prima di iniziare le procedure.

2. Isolamento delle cellule da placenta umana

1. Ottenere tessuto placentare, dopo il parto cesareo, da parte delle donne sane in gravidanza normale fase di aborto o terapeutico a 7-32 settimane di gestazione dopo aver ottenuto il consenso informato scritto.
2. Hanno lo specialista ostetrico placenta umana piastre coriali chirurgicamente separati (HPC) dalla placenta; incubare questi in 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C per 20 minuti, e poi lavare con 5 ml di PBS.
3. Isolare villi coriali da HPC con le forbici; Tritare i villi e lavarli tre volte con 1 ml di PBS. Dopo macinazione, posizionare i villi coriali in una provetta per microcentrifuga con un puntale; lavare i campioni con 500 microlitri di PBS pipettando su e giù, e centrifugare le provette per 120 xg per 3 min. Lavare tessuti due volte con 500 ml di terreno di coltura pre-riscaldata.
4. Cellule culturali in media su piastre di gelatina rivestite a 37 ° C, in 5% di CO ₂ , e sotto il 95% di umidità. Pre-coat tutti i piatti con lo 0,1% di gelatina per 1 ora a 37 ° C. Le colonie di cellule fibroblasto-simili formeranno e crescita aderente circa 5-7 giorni dopo l'inizio cultura nello stesso mezzo.
5. Sostituire il mezzo ogni 2-3 giorni fino al terzo passaggio. Durante la coltura, rimuovendo detriti cellulari galleggianti nel mezzo di coltura; crescita fibroblasti placentari si attaccheranno alla piastra. Coltivare le cellule di fibroblasti, come derivati ​​dal HPC fino al 10 ^° passaggio e poi li raccolgono per le culture hESC dopo tripsinizzazione e mitomicina-C (10 mg / ml) trattamento.
6. Prima di congelamento HPC come campioni azionari, utilizzare trascrizione inversa-polymerase chain reaction (RT-PCR) per confermare che HPC non sono contaminati da agenti patogeni che normalmente infettano la placenta, tra cui micoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginina, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,e M. capricolum) e le specie batteriche, Ureaplasma urealyticum, utilizzando un kit di rilevamento micoplasma.
   1. Seguire le istruzioni del produttore per effettuare RT-PCR, utilizzare tutte primer e miscele fornite nel kit. Utilizzare il surnatante delle cellule che sono state coltivate per 36 giorni per la rilevazione micoplasma. Aggiungere 3 ml di questi campioni per le miscele PCR ed eseguire la procedura 1 ^st PCR per 35 cicli, ciascuno costituito da 94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 2 min, e 72 ° C per 1 min.
   2. Aggiungere con cautela 0,5 ml di 1 ^° prodotto PCR alla miscela PCR ed eseguire la procedura 2 ^° PCR per 30 cicli usando le stesse condizioni di prima. Analizzare i prodotti amplificati di 1% gel di agarosio; applicare 10 ml di ogni del 1 ^° e 2 ^° prodotti di PCR per i gel.
7. Se HPC si trovano ad essere contaminati da agenti patogeni, eliminarliutilizzando una combinazione di antibiotici (BM-ciclina), seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere un nuovo terreno contenente 10 mg / ml di BM-ciclina 1 per 3 giorni, e poi trattare le cellule con 5 mg / ml BM-ciclina 2 per altri 4 giorni. Ripetere questo ciclo per due volte e quindi verificare la presenza di contaminazione da micoplasma di nuovo.

3. Cellule raccolta umana Placenta derivati ​​condizionata Media (hPCCM)

1. Dopo aver escluso contaminazione, trattare le cellule attaccate (85-90% di confluenza, (1,5 × 10 ⁷ cellule / fiasco) con mitomicina-C (10 ug / ml) per 2 ore e 30 minuti, e le cellule lavate tre volte con 10 ml PBS. Incubare le cellule con mezzo di pre-riscaldato senza mitomicina-C per 24 ore.
2. Un giorno dopo il trattamento, incubare cellule in 10 ml di mezzo (DMEM-F12 integrato con il 20% di knock-out siero sostituzione [KOSR], 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 1% NEAA, e l'1% di penicillina-streptomicina). Dopo 24 ore di incubazione, il raccolto CM in un tubo da 15 ml efiltrata del CM con un filtro siringa da 0,22 micron.
3. Aggiungere altri 10 ml di nuovi media e di incubazione. Raccogliere tutte surnatanti dalle culture ogni giorno per 1 settimana e congelare il medium raccolto a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.

4. Cellule Cultura di staminali embrionali umane (hESC) e induzione di cellule staminali pluripotenti (iPSCs)

1. Ottenere linee di cellule staminali embrionali umane, H1 e H9 cellule (elencati nel Registro NIH hESC con il nome di WA01 e WA09, rispettivamente) e di cellule staminali indotte pluripotenti-IPSC-1: iPS (prepuzio) -1 e IPSC-2 (IISH1i- BM) dal Research Institute WiCell (Madison, WI, USA). Le cellule devono essere scongelati e coltivate seguendo le istruzioni del produttore.
2. Per il gruppo di controllo, le cellule di coltura su piatti matrice di membrana basale rivestite in diffuso mezzo di coltura definito senza siero-libero-alimentazione e a 37 ° C e in 5% di CO _2. Inizialmente, sementi 80-100 ciuffi di hPSCs in 35 mm piatti. Crescere cellule in questi piatti fino a 70-80% di confluenza e di routine cellule passaggio per sub-coltura una volta ogni 5-6 giorni, con metodi meccanici o enzimatici (dispasi). Lavare le cellule due volte con terreno e li piastra in un rapporto di 1: 4. Sostituire il supporto con terreno fresco ogni giorno.
3. Per i gruppi sperimentali, le cellule di coltura in hPCCM sui piatti pre-rivestite con 0,1% di gelatina e di eseguire passaging di routine una volta ogni 5 giorni, sia meccanicamente o enzimatica. Cellule piastra a rapporti nella gamma di 1: 6-1: 10. hPSCs allegare alla gelatina entro 2 giorni dopo il trasferimento. Sostituire il supporto con terreno fresco tutti i giorni.

5. Caratterizzazione di cellule staminali pluripotenti umane

NOTA: Caratterizzare hPSCs utilizzando diversi metodi, come la colorazione fosfatasi alcalina, immunocitochimica, quantitativa real-time PCR (qRT-PCR), e western blotting.

1. Immunofluorescenza
   1. Per immunofluorescence di colorazione, hPSCs cultura e fissare le cellule nelle camere di scorrimento 8 pozzetti con il 4% (w / v) paraformaldeide per 10 minuti; poi, le cellule permeabilizzate con 0,1% (v / v) Triton-X100 per 15 min, e bloccare le cellule per 1 ora con 3% (v / v) di siero di cavallo normale in PBS contenente 0,1% (v / v) Tween- 20. Lavare PBS due volte per 5 minuti tra ogni passo.
   2. Incubare le cellule con l'anticorpo primario (ottobre-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, diluizione di 1: 1.000) O / N a 4 ° C e con l'anticorpo secondario.
   3. Prima del montaggio, incubare le cellule con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti al buio. Lavare le cellule rigorosamente tre volte per 5 minuti ciascuno e secche cellule completamente, nel buio. Conservare le cellule in mezzo di montaggio fluorescenza e osservarli al microscopio a fluorescenza.
2. qRT-PCR
   1. Isolare RNA totale da cellule utilizzando un kit RNeasy mini secondo le specifiche del produttore e quantificare l'RNA estratto utilizzando un Nano goccia spettrofotometro.
   2. Sintetizzare cDNA aggiungendo 2 ug di RNA totale per un oligo contenente 20 microlitri miscela di reazione (dT) primer e Superscript II trascrittasi inversa; seguire le istruzioni del produttore in questa procedura.
   3. Amplificare il cDNA sintetizzato con un sistema iQ Bio-Rad iCycler, utilizzando iQ SYBR Green qPCR Master Mix e le sequenze di primer descritti nella tabella di riferimento S1. Normalizzare i valori di soglia ciclo dei geni di interesse a quelli di deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GAPDH).
3. La fosfatasi alcalina (AP) colorazione
   1. Rilevare l'attività AP utilizzando il cellulare ES Caratterizzazione Kit, secondo il protocollo del produttore.
   2. Il giorno 5, aspirare i media e fissare i hPSCs con paraformaldeide al 4% in PBS per 12 min. Non overfix; fissa cellule per più di 2 min comporterà l'inattivazione di fosfatasi alcalina. Aspirare il fissativo e lavare con 1x Sciacquare tampone. Noni pozzetti si asciughino tra i passaggi.
   3. Aggiungere soluzione colorante sufficiente a coprire ogni pozzetto (1 ml per pozzetto di un piatto da 35 mm). Incubare le piastre al buio a temperatura ambiente per 15 min.
   4. Dopo l'incubazione, lavare i piatti con 1x Sciacquare tampone. Celle di copertura con PBS 1x per prevenire l'essiccazione ed esaminare e immagine le cellule colorate utilizzando un microscopio Olympus.
4. Western Blot
   1. Eseguire l'analisi western blot come descritto in precedenza in ^9. In breve, determinare le concentrazioni di proteine ​​in lisati cellulari. Risolvere uguali quantità di proteine ​​su un gel elettroforesi solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) gel di sodio dodecil e trasferire le proteine ​​su un fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana.
   2. Bloccare la macchia e la sonda è O / N con anticorpi primari diversi a 4 ° C; successivamente incubare la macchia con anticorpi secondari HRP-coniugati per 1 ora. Lavare la membrana per tre volte per 10 minuti ogni volta tra incubazione. Rileva segnali mediante un reagente ECL.
5. Short Tandem Repeat (STR) Analisi
   1. hPSCs sono state raccolte dal controllo e gruppi sperimentali allo stesso passo. DNA genomico è stato estratto utilizzando un kit Micro DNA, secondo le istruzioni del produttore.
   2. Amplificare il DNA genomico per 16 loci genetici diversi utilizzando il kit CF / STR PCR amplificazione, secondo le specifiche del produttore e elettroforesi capillare è stata effettuata utilizzando un analizzatore genetico.

Risultati

Un vantaggio di questo metodo di propagazione HPSC è che utilizza componenti secreti dalle cellule umane. Un passo più ciritical nel protocollo è l'isolamento e la coltura di cellule derivate da placenta umana. Ciò richiede ed accurata dissezione da una parte precisa di HPC piastra villi. La Figura 1 mostra la procedura per l'isolamento delle cellule derivate placenta umana. Questo processo è semplice e conveniente per l'isolamento delle cellule, e può essere facilmente eseguita entro 1 ora....

Discussione

Questo modello è stato sviluppato per propagare successo hPSCs, pur mantenendo le loro caratteristiche, in condizioni di coltura privo di alimentazione umanizzati senza aggiunta di esogeni fattori di crescita ricombinanti come bFGF o insulina, consentendo la manipolazione di hPSCs in un microambiente umanizzato. Supplementazione esogena bFGF è comune e l'applicazione di substrati come Matrigel o laminina è essenziale per la coltura senza alimentatore di hPSCs ^14.

Questo protoc...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mitomicina-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μ g/ml
kit di rilevamento di micoplasma	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispase	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gelatina	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0,10%
BM-Ciclina	Roche	799 050	10 μ g/ml
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Spettrofotometro a nano goccia	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Mix master qPCR verde	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
ES Kit di caratterizzazione cellulare	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Kit di sintesi del cDNA di potenza	iNtRON Biotecnologia	25011
QIAamp® Kit DNA Micro	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identificatore® Kit di amplificazione per PCR	Applied Biosystems Inc.
Applied Biosystems® Analizzatore genetico 3130xl	Biosistemi applicati Inc.

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