Rilevazione sensibile di Proteopathic Semina attività con FRET Citometria a flusso

Jennifer L. Furman; Brandon B. Holmes; Marc I. Diamond

doi:10.3791/53205

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Rilevazione sensibile di Proteopathic Semina attività con FRET Citometria a flusso

15.1K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/53205

⸱

8 dicembre 2015

Jennifer L. Furman^*¹ , Brandon B. Holmes^*¹ , Marc I. Diamond¹

¹Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, University of Texas Southwestern Medical Center

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il trasferimento da cellula a cellula di aggregati proteici, o semi proteopatici, può essere alla base della progressione della patologia nelle malattie neurodegenerative. In questo articolo, viene descritto un nuovo test di citometria a flusso FRET che consente di rilevare in modo specifico e sensibile l'attività di semina da campioni ricombinanti o biologici.

Abstract

Prove crescenti supportano la propagazione transcellulare di aggregati proteici tossici, o semi proteopatici, come meccanismo per l'inizio e la progressione della patologia in diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer e le tauopatie correlate. Il ruolo potenzialmente critico dei semi di tau nella progressione della malattia supporta fortemente la necessità di un test sensibile che rilevi prontamente l'attività di semina nei campioni biologici.

Combinando la specificità del trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET), la sensibilità della citometria a flusso e la stabilità di una linea cellulare monoclonale, è stato progettato un saggio di semina ultrasensibile compatibile con la rilevazione di semi da campioni ricombinanti o biologici, inclusi omogeneizzati cerebrali umani e di topo. Il test impiega cellule monoclonali HEK 293T che esprimono stabilmente il dominio di ripetizione (RD) della tau soggetto ad aggregazione che ospita la mutazione P301S associata alla malattia fusa con CFP o YFP, che producono un segnale FRET dopo l'aggregazione proteica. L'assorbimento di semi proteopatici di tau (ma non di altre proteine) nelle cellule biosensore stimola l'aggregazione di RD-CFP e RD-YFP e la citometria a flusso monitora in modo sensibile e quantitativo questo FRET indotto dall'aggregazione. Il test rileva le concentrazioni femtomolari (monomero equivalente) di semi di tau ricombinanti, ha una gamma dinamica che si estende su tre ordini di grandezza ed è compatibile con gli omogenati cerebrali di topi transgenici taupatici e soggetti con taupatia umana. Con lievi modifiche, il test può anche rilevare l'attività di semina di altri semi proteopatici, come la α-sinucleina, ed è anche compatibile con le colture neuronali primarie. La facilità, la sensibilità e l'ampia applicabilità della citometria a flusso FRET la rendono utile per lo studio di un'ampia gamma di disturbi dell'aggregazione proteica.

Introduzione

L'accumulo di tau intracellulare amiloidi definisce tauopatie come il morbo di Alzheimer. Nelle fasi iniziali della malattia, la patologia è generalmente localizzata alle regioni discrete del cervello, ma con la progressione della malattia, la patologia si diffonde sempre lungo le reti neurali distinte ^1-5. Accumulare evidenza suggerisce transcellulare propagazione di aggregati proteici tossici alla base di questa patologia (rivisto in ^6-10). In questo modello, i semi proteopathic (ad esempio, tau) vengono rilasciati dalle cellule del donatore e entrano nelle cellule vicine, trasformando proteina tau nativo nella forma misfolded via....