Articolo metodologico

L'isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

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DOI:

10.3791/53217

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13 novembre 2015

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1The Department of Human Nutrition, Foods, and Exercise, Virginia Tech, 2The Metabolic Phenotyping Core, Virginia Tech, 3Seahorse Bioscience

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo una modifica di un metodo precedentemente riportato che consente l'isolamento di mitocondri purificati e di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo. Questa procedura si traduce in mitocondri altamente accoppiati che respirano con elevata funzione durante i saggi respirometrici basati su micropiastre.

Abstract

Disfunzionali mitocondri dei muscoli scheletrici hanno un ruolo nel metabolismo alterato osservata con l'invecchiamento, l'obesità e il diabete di tipo II. Saggi respirometrici mitocondriali da isolate preparati mitocondriali consentono la valutazione della funzione mitocondriale, nonché la determinazione del meccanismo (s) d'azione dei farmaci e proteine ​​che modulano il metabolismo. Procedure di isolamento attuali richiedono spesso grandi quantità di tessuto per produrre mitocondri di alta qualità necessari per le analisi respirometrici. I metodi qui presentati descrivono come di alta qualità mitocondri purificato (~ 450 mg) può essere isolato da quantità minime (~ 75-100 mg) di topo muscolo scheletrico per l'uso in misure respiratorie throughput elevato. Abbiamo determinato che il nostro metodo di isolamento si ottiene il 92,5 ± 2,0% mitocondri intatti misurando l'attività citrato sintasi spettrofotometricamente. Inoltre, l'analisi Western Blot in mitocondri isolati portato alla debole espressione del cytosoproteine ​​lic, GAPDH, e il robusto espressione della proteina mitocondriale, COXIV. L'assenza di una banda di GAPDH prominente nei mitocondri isolati è indicativo di poco la contaminazione da fonti non-mitocondriali durante la procedura di isolamento. Soprattutto, la misura di O 2 tasso di consumo con tecnologia basata micropiastra e determinare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) per saggi respirometrici accoppiati mostra altamente accoppiate (RCR;> 6 per tutti i saggi) e mitocondri funzionali. In conclusione, l'aggiunta di una fase di macinazione separata e riducendo significativamente motorizzato velocità omogeneizzazione di un metodo riportato in precedenza ha permesso l'isolamento di alta qualità e mitocondri purificati da piccole quantità di topo muscoli scheletrici che si traduce nei mitocondri altamente accoppiate che respirano con alta funzione durante micropiastra saggi respirometirc.

Introduzione

La funzione primaria dei mitocondri è quella di produrre ATP dalla fosforilazione ossidativa. Tuttavia, i mitocondri hanno molte altre importanti funzioni cellulari tra cui, ma non solo: la produzione e la detossificazione di specie reattive dell'ossigeno, la regolazione del calcio citoplasmatico e mitocondriale, il traffico degli organelli, l'omeostasi ionica e il coinvolgimento nell'apoptosi1,2. Pertanto, non sorprende che i mitocondri disfunzionali svolgano un ruolo in molte patologie, come l'invecchiamento, le malattie neurodegenerative, le malattie cardiovascolari, il cancro, l'obesità e il diabete3,4. È importante sottolineare che i mitocondri del muscolo scheletrico sono specificamente coinvolti in molte di queste patologie3-5.

I saggi di respirazione mitocondriale che utilizzano mitocondri isolati consentono di valutare la catena di trasporto degli elettroni e la funzione di fosforilazione ossidativa e la determinazione dei meccanismi d'azione di farmaci e proteine che modulano il metabolismo. Esistono procedure di isolamento mitocondriale per più tipi di tessuti e cellule per una varietà di specie6,7. Tuttavia, queste procedure richiedono spesso grandi quantità di tessuto/cellule per una resa mitocondriale di alta qualità necessaria per i classici saggi respirometrici.

I saggi respirometrici basati su micropiastre consentono misurazioni ad alta produttività utilizzando quantità minime di mitocondri isolati, spesso solo pochi μg per pozzetto8. Pertanto, presentiamo una modifica dei metodi7 precedentemente pubblicati per consentire l'isolamento di mitocondri di alta qualità da quantità minori di muscolo scheletrico di topo per l'uso in saggi respirometrici basati su micropiastre. Inoltre, vengono forniti metodi per stabilire la qualità della preparazione all'isolamento mitocondriale e l'integrità delle membrane mitocondriali. Dato che i mitocondri del muscolo scheletrico sono coinvolti in molte condizioni patologiche, la misurazione del consumo di O2 in studi meccanicistici sta diventando sempre più diffusa nella ricerca biomedica9,10.

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Protocollo

Gli studi su animali sono stati effettuati nel quadro di un protocollo approvato dalla cura degli animali istituzionale e utilizzano Comitato al Virginia Polytechnic Institute e State University.

1. Setup (Tempo: ~ 45 min)

  1. Scongelare depositi congelati di 0,25% tripsina, isolamento tampone per mitocondri (IBM) 1 e IBM2 in un bagno d'acqua a 37 ° C.
  2. Sciacquare vetreria e strumenti di dissezione in etanolo al 70% e poi con acqua ad elevata purezza.
  3. Preparare la soluzione tripsina 0,05% dal 0,25% tripsina magazzino diluendo 1 parte di tripsina in 4 parti IBM1.
  4. Mescolare proteasi e fosfatasi inibitore cocktail con tampone di lisi cellulare (1: 100 ratio) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga con tappo a vite.
  5. Aliquote 5 ml (5 ml / topo) di 0,05% tripsina in un tubo di plastica da 15 ml.
  6. Impostare motorizzato omogeneizzatore tessuto a 80 giri.

2. Isolamento del muscolo scheletrico mitocondri (Tempo: ~ 90 min)

  1. L'eutanasia di un mouse da CO 2 inalazione, seguita da dislocazione cervicale.
  2. Rimuovere muscolo rosso dal quadricipite e del muscolo gastrocnemio, che comprende il soleo (~ 75-100 mg totale) come descritto nei seguenti passaggi:
    1. Sbucciare la pelle verso il mouse.
    2. Rimuovere il cuscinetto di grasso sopra il punto di origine del quadricipite. Tagliare il tendine del quadricipite che è collegato alla rotula con sottili forbici a punta.
      Nota: Il quadricipite è identificato dalla sua posizione anatomica sulla parte anteriore del femore prossimale.
    3. Lentamente tagliare l'aponeurosi tra l'osso e il quadricipite, evitando l'arteria femorale, per liberare i quadricipiti dall'osso. Tagliare il tendine con sottili forbici a punta in corrispondenza del punto di origine sul femore per liberare il muscolo quadricipite e posizionare il muscolo quadricipite in refrigerate PBS.
    4. Rimuovere il tessuto adiposo visibile sopra il quadricipite con le forbici. Vibrazione quadricipiti sopra in modo che la porzione del muscolo che è stato sovrapposto il femore sta affrontando up. Aprire il muscolo quadricipite con una pinza in un movimento rotatorio. Rimuovere le due porzioni muscolari rosse visibili da ogni lobo con ammenda forbici a punta e mettere in un bicchiere contenente 5 ml di acqua refrigerata IBM1.
      Nota: muscolo quadricipite appaiono come due lobi con una striscia di muscolo rosso si trova vicino al bordo laterale di ciascun lobo.
    5. Tagliare la pelle sovrastante il tendine di Achille con ammenda punta forbici e sbucciare la pelle verso il mouse. Tagliare il tendine di Achille esposto e staccare il muscolo verso il corpo del mouse.
    6. Tagliare il tendine ai condili mediale e laterale del femore con sottili forbici a punta per liberare il gastrocnemio e collocare il gastrocnemio attaccato ai suoi tendini in refrigerata PBS.
    7. Capovolgere il gastrocnemio sopra e staccare il muscolo soleo e mettere nel bicchiere contenente 5 ml di acqua refrigerata IBM1. Fan aprire il gastrocnemio. Rimuovere le tre porzioni visive rosse muscolari (due strisce rosse laterali e uno mediale superficiale) con multa forbice a puntas e trasferirli al bicchiere contenente 5 ml di acqua refrigerata IBM1.
  3. Rimuovere un'altra ~ 75-100 mg di muscolo rosso dalla altra gamba del mouse (come descritto al punto 2.2) e posto in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga con proteasi e fosfatasi inibitore cocktail e tampone di lisi cellulare (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, NaCl 150 mm, 1% dodecil solfato di sodio, 0,5% deossicolato di sodio, 1% Poliossietilene (9) nonylphenylether, ramificata. Subito lampeggiare-freeze questo secondo campione in azoto liquido per un uso successivo a assorbente occidentale (vedi punto 6.1).
  4. Mettere una superficie di plastica piatta pre-raffreddata su ghiaccio in un grande secchio. Versare una goccia di IBM1 sulla superficie di plastica e utilizzare pinzette per mettere tutti del muscolo rosso sezionato (passo 2.2.4 e 2.2.7) in IBM1 goccia. Tritare il tessuto muscolare per 2 minuti utilizzando 3 singole lame di rasoio bordo cambiando rasoi ogni 40 sec.
  5. Trasferire il tessuto tritato in un becher con 5 ml di IBM1 fresco tenendo superficie plastica sopra the becher e raschiare il muscolo nel becher con una lama di rasoio. Prendete questa soluzione e di scarico attraverso un colino cella di 100 micron collocato su un tubo da 50 ml.
  6. Tamponare il tessuto con un tergicristallo compito delicato e poi trasferisce in 5 ml della soluzione di tripsina 0,05%. Utilizzare pinzette per rimuovere il tessuto dal tergicristallo compito.
  7. Incubare il tessuto muscolare in ghiaccio per 30 minuti in soluzione tripsina 0,05%.
  8. Gira le tubo da 15 ml miscela contenente tripsina / muscolo a 200 xg per 3 min a 4 ° C.
  9. Versare il surnatante tripsina in un contenitore per rifiuti e risospendere il pellet con 3 ml di ghiaccio freddo IBM1. Trasferire il tessuto 45 ml tubo omogeneizzatore vetro. Sciacquare i tubo da 15 ml con un altro 1,5 ml IBM1 raccogliere qualsiasi campione rimanente e aggiungere questo al tubo omogeneizzatore vetro.
  10. Posizionare il tubo di omogeneizzatore vetro in un bicchiere o contenitore di plastica pieno di ghiaccio a metà strada quindi l'omogeneizzatore vetro si muove minimamente all'interno del bicchiere.
  11. Omogeneizzare la miscela di tessuti / IMB1 con il pestello in PTFE collegati ad un comando a motore omogeneizzatore tessuto con 10 passaggi a 80 giri al minuto. Tenere la parte inferiore di ogni pass per ~ 2 sec.
  12. Trasferire il tessuto omogenato di un nuovo tubo da 15 ml conica e sciacquare il tubo omogeneizzatore vetro con 6,5 ml di IBM1. Versare il IBM1 nel tubo da 15 ml contenente tessuto omogenato.
  13. Spin tubo conico da 15 ml a 700 g per 10 minuti a 4 ° C. Delicatamente versare il surnatante in una provetta da centrifuga ad alta resistenza vetro e scartare il pellet.
  14. Spin il supernatante dal passo a 8000 xg per 10 min a 4 ° C.
  15. Rimuovere il surnatante IBM1 e risospendere il pellet aggiungendo lentamente 500 ml di IBM2. Tagliare la fine di un puntale e omogeneizzare delicatamente il pellet in IBM2 con miscelazione e agitazione movimenti. Aggiungere altri 4,5 ml di IBM2 alla miscela dopo il pellet è completamente sospesa.
    Nota: Evitare l'eccessiva triturazione mentre rompendo pezzi pellet più grandi come tla sua può danneggiare le membrane mitocondriali.
  16. Spin l'omogeneizzato / tessuto IBM2 a 8000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
    Nota: Questo passaggio può essere ripetuto in una provetta pulita centrifuga ad alta resistenza per più precisa quantificazione delle proteine ​​di mitocondri isolati al punto 4 dal residuo BSA può contribuire al contenuto totale di proteine.
  17. Rimuovere il surnatante e delicatamente, ma completamente risospendere il pellet con l'aggiunta di due incrementi 25 microlitri di IBM2 con un puntale con il suo punto di taglio. Mescolare delicatamente e miscelare il pellet dopo ogni aggiunta di 25 ml di IBM2. Mettere questo stock mitocondriale su ghiaccio.

3. omogeneizzazione di tutto il tessuto lisato (Tempo: ~ 45 min; può essere effettuato durante Passo 7)

  1. Rimuovere il muscolo da che è stato posto in azoto liquido dal punto 2.3 e incubare a temperatura ambiente fino completamente scongelati.
  2. Tritare il tessuto per ~ 30 secondi sul ghiaccio con pregiati forbici a punta.
  3. Aggiungere due cucchiai 100 microlitri di ZircoPerline in ossido di zirconio alla provetta da 1,5 ml microcentrifuga con tappo a vite dal punto 3.2 che contiene il tessuto tritato. Omogeneizzare il tessuto in un omogeneizzatore tessuto mulino tallone con due o tre cicli di 5 min ad una impostazione di velocità di 4-6 (regolazione media).
  4. Spin la miscela dal punto 3.3 a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con una pipetta 1000 ml punta dopo lo spin e il trasferimento in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Eliminare il pellet e posizionare il surnatante su ghiaccio.

4. Determinazione delle proteine ​​(Tempo: ~ 30 min)

  1. Determinare la concentrazione di proteine ​​di tutto il lisato tissutale (punto 3.4) e magazzino mitocondriale (passo 2.17) utilizzando il kit di analisi delle proteine ​​BCA secondo le specifiche del costruttore.

5. I mitocondri Membrana di integrità; Citrato sintasi (CS) Attività (Tempo: ~ 15 min)

  1. Fare due separati 1: 20 diluizioni dello stock mitocondriale in acqua ad elevata purezza. Aggiungere0,1% di Triton 100-X per un campione e sonicare è a un livello basso (765 watt, l'ampiezza di 2). Lasciare l'altra soluzione sul ghiaccio. Riportare il campione ghiaccio dopo sonicazione.
  2. Eseguire un test citrato sintasi sia con il non-sonicato e sonicato diluizioni mitocondriali utilizzando un saggio spettrofotometrico precedentemente descritto 11,12.
  3. Determinare la percentuale delle membrane mitocondriali intatte in base alle seguenti equazioni:
    (Attività CS non sonicato ÷ sonicato CS attività) * 100


100- N (cento raggiunto da sopra)

6. I mitocondri isolamento di qualità; Western Blotting (Tempo: Secondo Lab Protocol)

  1. Eseguire Western blotting su tutta lisato tissutale e mitocondri isolati come descritto in precedenza 12.
    Nota: Utilizzare anticorpi primari per GAPDH (1: 1.000 diluizione 5% BSA / TBS-T) e COXIV (1: 1.000 diluizione 5% senza grassiLatte / TBS-T), seguita da anti-capra, e anticorpi secondari di coniglio, rispettivamente, (1: 10.000).

7. respirometrici Assay Run (Tempo: ~ 90 min)

  1. Effettuare test respirometrici desiderati usando basato O 2 tecnologia di misurazione del consumo di micropiastre come descritto in precedenza (vedi articolo correlato e Rogers et al 8).
  2. Determinare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) dividendo Stato 3 per Stato 4o (RCR) o dividere 3u Stato per Stato 4o. Utilizzare il mezzo (media) il punto, o il più alto (Stato 3) e tariffe più basse (4o Stato) dal punto a punto le tracce per determinare RCR.

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Risultati

Attività citrato sintasi serve come misura per l'integrità della membrana dal citrato sintasi si trova nella membrana mitocondriale interna, e quindi non dovrebbero essere presenti nelle sospensioni di mitocondri con membrane intatte. La Figura 1 rappresenta l'attività citrato sintasi in campioni non sonicato mitocondriali rispetto sonicato campioni dello stesso isolamento. Sonicating i risultati dei mitocondri in un aumento statisticamente significativo nell'attività citrat...

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Discussione

I metodi qui presentati forniscono una descrizione dettagliata di una procedura di isolamento mitocondriale da quantità minime (~ 75-100 mg) di topo muscoli scheletrici. Questa procedura di isolamento è in grado di produrre ad alto funzionamento, i mitocondri puro (~ 450 mg) come evidenziato da O 2 tassi di consumo, valori RCR, la massima attività citrato sintasi e di espressione proteica da immunoblotting. È importante sottolineare che i mitocondri isolati da questa procedura può essere utilizzato per più sa...

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Dichiarazioni

George Rogers è un dipendente di Seahorse Bioscience che produce lo strumento per il quale questo protocollo è stato modificato.

Ringraziamenti

Il Fralin Life Science Research Institute e il Metabolic Phenotyping Core del Virginia Tech hanno supportato questo lavoro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Essenzialmente grassoSigma AldrichA6003N/A
senza acidi- BSA
Tris/HClPromegaH5123N/A
KCLSigma AldrichP9541N/A
Tris BasePromegaH5135N/A
EDTASigma AldrichE6511N/A
EGTASigma AldrichE4378N/A
SaccarosioSigma AldrichS7903N/A
D-MannitoloSigma Aldrich63559N/A
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenoloThermo Scientific25200-056N/A
Cloruro di sodio
cristalli bianchi o polvere cristallina
≥ 99,0 %		Fisher ScientificBP3581N/A
Sodio dodecil solfatoSigma AldrichL3771 N/A
Desossicolato di sodioSigma AldrichD6750 N/A
Poliossietilene (12) nonilfenil etere, ramificatoSigma Aldrich238651N / A
Lame di rasoio a taglio singoloFisher Scientific12-640N / A
Falcon- 100 uM Nylon Filtri cellulariFisher Scientific352360N / A
Halt Proteasi & Cocktail di inibitori dei fosfatiThermo Scientific1861284N/A
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml con tappo a viteThermo Scientific3474N/A
Perle di ossido di zirconioFisher ScientificC9012112N/A
GAPDH (1D4)Santa Cruz Biotechnologysc-59540N / A
Anti-COXIV anticorpoCell Signaling4844sQualsiasi proteina della membrana interna mitocondriale sarà sufficiente
Perossidasi coniugata affinipure Donkey, Anti coniglio IgG (H + L)Jackson ImmunoResearh711-035-152N / A
Perossidasi coniugato affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H + L)Jackson ImmunoResearh115-001-003N/A
Triton-X100Sigma AldrichX100N/A
Pierce Kit di analisi delle proteine BCA Thermo Scientific23225N/A
Acido piruvico, 98%Sigma Aldrich107360Conservare a 4 gradi C, pH a 7,4 con KOH prima dell'uso nel saggio respirometrico
Acido succinicoSigma AldrichS9512Conservare a temperatura ambiente, pH a 7,4 con KOH prima dell'uso nel saggio respirometrico
Acido malico L(-), BioXtra, ≥ 95%Sigma AldrichM6413Conservare a temperatura ambiente, a 7,4 con KOH prima dell'uso nel saggio respirometrico
Acido L-glutammicoSigma AldrichG1251Conservare a temperatura ambiente, a 7,4 con KOH prima dell'uso nel saggio respirometrico, a 7,4 con KOH prima dell'uso nel test
Palmitoyl L-carnitina cloruroSigma AldrichP1645Conservare a -20 °C
Oligomicina A, ≥ 95% (HPLC)Sigma Aldrich75351Conservare a -20 C
Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)Sigma AldrichC2920Negozio a 2-8 gradi C
fenilidrazone
≥ 98% (TLC), polvere [FCCP]
Antimicina A da streptomyces sp.Sigma AldrichA8674Negozio a -20 C
Adenosina 5′-difosfato sale monopotassico disidratato [ADP]Sigma AldrichA5285Conservare a -20 ° C, a 7,4 con KOH prima dell'uso nel test
RotenoneSigma AldrichR8875Conservare a temperatura ambiente
respirometrico respirometrico

Riferimenti

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