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Articolo metodologico

Condizioni che influiscono spazio sociale in

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DOI:

10.3791/53242

5 novembre 2015

In questo articolo

Sommario

L'effetto dei geni e dell'ambiente sullo spazio sociale di Drosophila melanogaster può essere quantificato attraverso un potente ma diretto paradigma analitico. Mostriamo qui diversi fattori che possono influenzare questo spazio sociale, e quindi devono essere presi in considerazione quando si progettano esperimenti in questo paradigma.

Abstract

Il test spazio sociale qui descritto può essere utilizzato per quantificare le interazioni sociali di Drosophila melanogaste r - o di altri piccoli insetti - in modo semplice. Come abbiamo precedentemente dimostrato 1, in una camera a due dimensioni, abbiamo prima forza linea per formare un gruppo compatto, successivamente consentendo loro di loro distanza preferito l'uno dall'altro. Dopo che le mosche si sono stabiliti, si misura la distanza dal vicino più prossimo (o spazio sociale), l'elaborazione di un quadro statico con il software online gratuito (ImageJ). L'analisi della distanza del vicino più prossimo permette ai ricercatori di determinare gli effetti di fattori genetici e ambientali sulla interazione sociale, mentre il controllo di potenziali fattori di confondimento. Diversi fattori quali la capacità di arrampicata, l'ora del giorno, il sesso, e il numero di mosche, possono modificare la spaziatura sociale di mosche. Ci proponiamo quindi una serie di controlli sperimentali per mitigare questi effetti confondenti. Questo test puòessere utilizzato per almeno due scopi. In primo luogo, i ricercatori possono determinare in che modo il loro turno ambientale preferito (come l'isolamento, la temperatura, lo stress o tossine) avrà un impatto sociale, spaziatura 1,2. In secondo luogo, i ricercatori possono sezionare le basi genetiche e neurali di questa forma di base del comportamento sociale 1,3. In particolare, abbiamo usato come uno strumento diagnostico per studiare il ruolo dei geni ortologhi si ritiene siano coinvolti nel comportamento sociale in altri organismi, come i geni candidati per l'autismo negli esseri umani 4.

Introduzione

Le interazioni sociali sono fondamentali per il corretto sviluppo e la salute degli individui all'interno di un gruppo nel suo insieme, e possono essere osservati tra le numerose specie, dagli esseri umani (Homo sapiens) a organismi più semplici come i moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) 5,6. Un individuo moscerino della frutta o di condivisione umana mezzi comuni per elaborare le informazioni sensoriali durante queste interazioni, che si tratti di: uditiva, visiva, olfattiva, tattile o gustation. Noi e gli altri ipotizzare che ci sia un neurocircuitry potenzialmente condivisa sottostante risposte comportamentali alle interazioni sociali, e che le cellule neuronali e geni coinvolti potrebbe essere evolutivo conservati 7. Una volta che si è verificato l'interazione iniziale, lo spazio sociale tra gli individui interagenti sarà o aumento (evitamento sociale 8) o diminuire (formazione di gruppi / aggregazione 5). Interazioni più complesse, come l'aggressività o di corteggiamento, possono quindi prendere posto.

Né strumenti e metodi sofisticati, né grandi investimenti in tempo e la formazione sono necessari per quantificare questo semplice forma di comportamento sociale, rendendolo un potente strumento analitico. Qui, spieghiamo un protocollo semplice che quantifica la distanza inter-fly, o spazio sociale, per valutare l'interazione sociale in gruppi stabili di Drosophila melanogaster, usati nei seguenti studi 1-4,9. Spazio sociale si riferisce ad una misura della distanza tra una mosca e il suo vicino più vicino 10. Spazio sociale è coerente per una data popolazione di D. melanogaster quando le condizioni sperimentali sono conservati (in media circa in 1-2 lunghezze corpo), e varia rispetto alla esperienza sociale di linea, aumentando se l'individuo è stato tenuto in isolamento 1. La corretta visione è necessario per mantenere normale la distanza sociale, ma non odoranti classiche o percezione CVA 1. Misura dello spazio sociale può quindi essereutilizzato come strumento diagnostico per analizzare le interazioni sociali e quantificare il comportamento sociale in D. melanogaster 1. Descriviamo qui in dettaglio come eseguire questa quantificazione, e in che misura variabili sperimentali comuni influenzano questo comportamento.

Si dimostra che l'orientamento della camera in cui viene eseguito il test, così come il numero di mosche - in misura - fare colpisce spazio sociale. E 'stato precedentemente dimostrato che la geometria della camera colpisce spontaneo movimento esplorativo di mosche 11,12, e questo fenomeno potrebbe in ultima analisi, avere un impatto in cui decidono di stabilirsi. Tuttavia, finché la densità mosca (fly / cm 2) e l'orientamento della camera è mantenuta la stessa, lo spazio sociale della linea rimane costante. La robustezza di questo test è illustrata dal fatto che laboratori indipendenti utilizzando diverse dimensioni della camera, la forma e l'orientamento in grado di replicare il risultato visualizzato dal mutanti del whgene ite (che colpisce pigmentazione dell'occhio), che è uno spazio sociale incremento (triangolo verticale o cerchio orizzontale in 1, piazza orizzontale con flusso d'aria in 3).

I nostri risultati indicano anche che mantenere il momento in cui viene eseguito l'esperimento spazio sociale è fondamentale per la coerenza dei risultati, come abbiamo dimostrato che i maschi, ma non le femmine, sono più distanti la sera. Tuttavia, le differenze tra le viste diurne e serali ore non sono dovute a differenze di attività di linea, e discutiamo argomenti che indicano che i livelli di attività non sono correlati con lo spazio sociale.

Infine, ci sono basi genetiche alla determinazione dello spazio sociale, come indicato dal mutante bianco già descritto 1,3, e le differenze tra i vari ceppi inbred e catturati in natura di mosche che vi presentiamo qui.

Pertanto, questo test rappresenta un eccellente strumento fo studiare gli effetti della genetica e fattori ambientali.

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Protocollo

1. Attrezzature e reagenti creato in casa (vedi elenco dei materiali per gli Altri)

  1. Preparare un apparato di anestesia fredda Drosophila come descritto in precedenza 8.
  2. Preparare un aspiratore mosca come descritto in precedenza 13.
  3. Preparare camere spazio sociale e titolari.
    1. Ordinare o fare lastre di vetro e distanziali acrilico per creare le camere di spazio sociale. Ogni camera di spazio sociale è costituito da due lastre di vetro quadrati (17,6 cm per 17,6 cm, con uno spessore di 0,3 cm), due giusti distanziali triangolo acrilico (con un'altezza di 16,5 cm, una base di 8,9 cm, con uno spessore di 0,3 cm ), e due spazi rettangolari (9 cm per 1,5 cm con uno spessore di 0,3 cm) (Figura 1A).
    2. Montare il vetro e acrilico camera spazio sociale tale che è identica alla camera in Figura 1B. Per fare ciò, iniziare inserendo un distanziale triangolare piatta sulla parte superiore di un pannello quadrato di vetro in modo che l'angolo rettodel distanziale triangolare è allineato con uno degli angoli del riquadro quadrato. Successivamente, posizionare il secondo distanziale piatto triangolare sulla parte superiore del pannello piazza, rispecchiando il primo distanziale triangolare.
      NOTA: Assicurarsi di indossare i guanti per non contaminare i pezzi con oli e profumi dalle vostre mani.
    3. Inserire due piccoli distanziatori rettangolari piane sopra il riquadro piazza, lungo il lato del pannello che non è coperto. I distanziatori acrilico sulla parte superiore del piano piazza ora dovrebbero formare un'arena triangolare.
    4. Posizionare un secondo pannello quadrato di vetro sulla parte superiore dei distanziali acrilici tale che sia allineato sopra il riquadro originale di vetro inferiore.
    5. Utilizzare quattro clip legante per fissare i vetri e distanziali insieme per formare la camera di spazio sociale. Inserire una clip vicino all'angolo, sul lato lungo ciascuno dei distanziatori triangolari, fissandoli all'interno delle lastre di vetro. Su questi stessi lati, inserire una clip in un angolo adiacente, su ciascuno dei distanziatori rettangolari, fissandoli inlato i vetri.
    6. Assemblare un cavalletto di sostegno ed un morsetto matraccio tale che il morsetto manterrà la camera spazio sociale in posizione verticale, come la camera di spazio sociale poggia sul suo bordo sulla parte superiore della superficie di lavoro.
    7. Per ogni ripetizione nell'esperimento, assemblare una camera di spazio sociale e sostenere stare.
  4. Preparare un apparato di risposta test arrampicata per verificare la capacità di salita delle mosche testati.
    1. Utilizzare un apparato in controcorrente, come precedentemente descritto 14,15.
  5. Garantire un'illuminazione omogenee eseguendo l'esperimento su una superficie di lavoro coperto con un coperchio panchina bianca e di fronte a uno sfondo bianco.

2. Preparazione delle mosche prima dell'esperimento

  1. Mantenere mosche in flaconi contenenti standard di Drosophila volare cibo. Tenerli in una camera di incubazione a 25 ° C su una luce 12 hr / buio ciclo.
  2. Uno o due giorni prima della postaXperiment, raccogliere e sesso vola in anestesia freddo, come descritto in precedenza 8.
    1. Raffreddare l'apparecchio di anestesia freddo a -4 ° C. Luogo vola in 50 ml provette di plastica. Immergere completamente le provette di plastica contenenti mosche in ghiaccio in un secchio di ghiaccio isolato, attendere almeno 5 minuti per le mosche di diventare immobile.
    2. Posizionare linea sul foglio di polietilene dell'apparato anestesia fredda. A RT, utilizzare uno stereomicroscopio per separare i maschi dalle femmine. Mantenere le mosche, in gruppo, in flaconi contenenti norma Drosophila volare cibo, non supera i 40 mosche per flaconcino.
  3. Due ore prima dell'inizio dell'esperimento, assicurarsi che la temperatura della stanza in cui verrà eseguita l'esperimento è compresa tra 24-25 ° C e l'umidità è circa il 50%.
  4. Trasferire le mosche in nuove fiale contenenti cibo, e metterli per 2 ore sul piano di lavoro in cui verrà eseguita l'esperimento.
    NOTA: Per questi speriments, i ceppi mosca utilizzati sono stati Drosophila ceppi melanogaster: Cantone-speciali o Canton-S (CS), w 1118 Cs 10 (o W - w 1118 outcrossed 10 volte di Canton-S), Oregon e Samarcanda mosche erano tutti dal nostro laboratorio 16 titoli; Mosche Elwood sono stati raccolti in autunno 2011 nel quartiere Elwood di Huntington, a Long Island, New York, Stati Uniti d'America 8. A parte quando diversamente specificato, i risultati presentati sono stati ottenuti con Canton-S mosche (nei toni del rosso).

3. Esecuzione dell'esperimento

  1. Eseguire l'esperimento 12:00-03:00 (ora Zeitgeber - il tempo in ore dopo l'insorgenza di luce - di ZT 4-7).
  2. Preparare la camera di spazio sociale per il trasferimento di mosche.
    1. Posizionare una TV camera di spazio sociale su un piano di lavoro, con il lato contenente distanziatori rettangolari più vicini al vostro corpo.
    2. Rimuovere one fermaglio più vicino il vostro corpo e far scorrere un distanziale rettangolare verso l'esterno, creando un gap di circa 1 cm tra i distanziatori rettangolari.
    3. Con del nastro e un pennarello, etichettare la camera di spazio sociale in un angolo superiore con il sesso, lo sforzo, e il numero di ripetizione. Fare attenzione al fine di garantire il nastro non copre parte dell'arena triangolare interno.
  3. Trasferire le mosche nella camera di spazio sociale.
    1. Trasferimento vola da loro flacone contenente cibo in un nuovo, fiala vuota. Aspirare aria dal fiala vuota e trasferirli nella camera di spazio sociale.
      1. Inspirate per disegnare le mosche nella punta dell'aspiratore. Posizionare la punta nella fessura 1 cm tra i distanziatori rettangolari della camera di spazio sociale ed espirare a un ritmo costante per forzare linea nell'arena triangolare interno.
      2. Immediatamente far scorrere il distanziatore rettangolare al suo posto, chiudendo la base dell'arena triangolari interiore, e posizionare la clip legante indietro.
  4. Su un pad martellamento, che si trova sul banco diverso da quello in cui il lavoro sperimentale avviene, tenere la camera spazio sociale montante tale che i distanziatori rettangolari sono sul lato inferiore. Pound tre volte per garantire tutte le mosche sono caduti sul fondo dell'arena.
    NOTA: A causa del distanziale in acrilico che esce la più piccola dimensione della camera (Figura 1D), battere i gomiti sul piano di lavoro, pur mantenendo una presa sicura su apparati per garantire le mosche sono caduti sul fondo.
  5. Avviare un timer.
  6. Posizionare la camera spazio sociale sul piano di lavoro e utilizzando il cavalletto pallone di supporto e morsetto per tenerlo in posizione verticale. Posizionare un righello o un adesivo di lunghezza nota piatto contro la camera di spazio sociale, ma non a copertura di qualsiasi parte dell'arena triangolare interno.
    1. Per gli esperimenti in posizione orizzontale, non posizionare la camera di spazio sociale nel cavalletto di sostegno; invece porre l'appartamento camera di spazio sociale sul piano di lavoro.
  7. Quando le mosche si sono stabiliti, di solito dopo circa 30 minuti, scattare una foto della camera di spazio sociale. Assicurarsi che il telaio contiene l'intera arena interna triangolare, il sovrano, e l'etichetta.
  8. Ripetere l'esperimento per ogni genotipo e condizione (idealmente 3 repliche interne e 3 ripetizioni indipendenti).

4. Analizzare lo spazio dati sociale

  1. Importare i seguenti macro in ImageJ 17
    1. ImageJ è disponibile qui: http://rsbweb.nih.gov/ij/.
    2. È possibile creare un comando 'misurare le distanze "nel menu Plugin salvando le macro di seguito in un file chiamato' Measure_Distances.txt 'nella cartella di ImageJ / plugins, nella sottocartella macro, e con il comando Aiuto> comando Update Menu'.
    3. Copia in un file .txt le macro che sono forniti in dati supplementari e sono stati originariamente pubblicati in 3.
  2. Caricare le foto su un computer, e aprire uno picture utilizzando ImageJ.
    1. Creare una scala tracciando una linea da 0 cm a 1 cm segni sul righello nella foto, e sotto la scheda Analizza, scegli la funzione Imposta Scala per impostare una scala di 1 cm per quella distanza (stesso approccio per la vignetta di lunghezza nota). Scegliere l'opzione globale prima di applicare la scala per l'immagine.
    2. Ritagliare l'immagine utilizzando la funzione Ritaglia nella scheda Immagine tale che include tutte le mosche, mentre la rimozione come gran parte del resto del quadro il più possibile.
    3. Rendere l'immagine in bianco e nero, scegliendo a 8 bit dall'opzione Tipo nella scheda Immagine.
    4. Rimuovere tutti i rumori di fondo dal quadro andando alla funzione Soglia sotto l'opzione Regola della scheda Immagine. Trascinare i cursori per aumentare o rimuovere il contrasto in modo che il corpo di ciascun volo può essere visto chiaramente senza altre marcature nell'immagine. Se ci sono segni che non sono le mosche, li cattura con lo strumento rettangolare ed eliminarli.
    5. Impostare ille misurazioni utilizzando lo strumento Misure Imposta nella scheda Analisi. Selezionare Area, Centro della Messa, Centroid, e Etichetta visualizzata. Quindi, scegliere il Particelle Analizza presentano nella scheda Analizza per creare un elenco numerato di tutte le macchie nere che rappresentano mosche.
      1. Quando si utilizza Analizzare le particelle; Dimensioni set 0,01-0,1 (non scegliere unità pixel); circolarità 0,00-1,00; mostrare contorni; visualizzare i risultati, e aggiungere al responsabile.
      2. Assicurarsi che ogni macchia nera (ogni particella) è una rappresentazione accurata delle mosche che sono nell'immagine originale, confrontando l'elenco numerato per l'immagine originale.
        NOTA: Se alcune mosche che sono molto vicine tra loro contati come una particella, disegnare manualmente una linea bianca per separare le due mosche sull'immagine binaria.
    6. Mentre è selezionato nell'elenco, utilizzare il vicino più vicino - Lista distanze macro sotto la seconda opzione Macro nella scheda Plugin per creare un nuovo elenco contenente le distanze, in cm, da EAch volare a loro vicino più prossimo.
  3. Copiare i più vicini distanze vicine da ImageJ e incollarlo in una colonna di un foglio di calcolo.
    1. Compilare tutti i dati di ogni ripetizione sullo stesso foglio di calcolo e di organizzare per il genotipo e condizione.
  4. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software statistico. In questo esperimento, Grafico Pad Prism (versione 6 per MacOSX, GraphPad Software, San Diego California, www.graphpad.com) è stato utilizzato per condurre un ANOVA e test Kruskal-Wallis, Tukey e post-hoc test di Dunnet.
  5. La distribuzione delle distanze segue una distribuzione non parametrica 1, ei dati sono rappresentati come scatola e baffi di Tukey (per eliminare outliers).

5. Arrampicata Assay (comportamento di controllo)

  1. Utilizzare un test di arrampicata come un controllo di mosche di prova di salita 14,15,18.
    1. Utilizzare l'apparato controcorrente tale che tre prove cun essere eseguito in parallelo.
  2. Trasferire 50 a 100 mosche ingenui (mosche, che non sono stati testati in precedenza) in tre fiale di test differenti, e li scattare in 1 °, 3 ° e l'ultimo slot nella parte inferiore di apparecchi controcorrente, con le fiale freschi vuoti nelle posizioni opposte.
  3. Luogo fresco, i flaconi vuoti negli slot vuoti nella parte inferiore dell'apparecchiatura.
  4. Premere giù dell'apparecchiatura tre volte, in modo che tutte le mosche sono in fondo di ogni tubo, per iniziare l'esperimento.
  5. Avviare il timer per 15 secondi (tempo sufficiente per ~ 100% di 3-7 giorni di età Canton-S per raggiungere la fiala superiore - vedi figura 3F).
  6. Far scorrere la parte superiore dell'apparecchiatura controcorrente, per spostare i primi flaconi di uno slot.
  7. Raccogliere mosche toccando l'apparecchio verso il basso, per portare tutte le mosche nei flaconcini di fondo.
    1. 1 ° e 2 tubi nd (o 3 ° e 4 °, 5 ° e 6 °) corrispondono rispettivamente alle mosche che non hanno raggiunto verso l'alto e le mosche che hanno raggiunto la fiala superiore.
  8. Calcolare il Performance Index (PI).
    1. Contare il numero di mosche in ogni fiala.
    2. Il PI è la percentuale di mosche in grado di salire sul tubo superiore.
    3. I mezzi di PI seguono una distribuzione normale 1, ei dati sono rappresentati come grafici delle colonne di media più o meno l'errore standard a media (SEM).
      NOTA: In alternativa, il PI può essere calcolata come la percentuale di mosche in grado di raggiungere la parte superiore della fiala inferiore (per le mosche anziani, 5 sec è il tempo sufficiente per quantificare una differenza in salita tra infette e non infette 12 giorni Canton-S quantificati da un fermo immagine: vedere i risultati). Altri hanno usato diverse misure di performance geotassi negativi improvvisi indotto, che sono anche opportuno quantificare salita 19-22.

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Risultati

La camera di spazio sociale può essere utilizzato come strumento per quantificare il comportamento sociale di Drosophila melanogaster. Distanziatori acrilico e vetri sono ritagliati insieme per formare un'arena triangolare interno che fornisce una superficie a due dimensioni in cui vola può formare gruppi stabili senza la presenza di molti spunti potenzialmente confondenti. Quando le mosche sono trasferiti per l'arena verticale, vengono sorpresi da essere sfruttato in giù, e rispondono con un comportame...

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Discussione

In questo protocollo, una procedura dettagliata per la quantificazione dello spazio sociale è stato descritto. Alcuni passi cruciali per garantire l'esperimento è successo sono: 1) usare sempre i guanti durante la pulizia e messa in opera dell'apparecchiatura, per mantenere i propri oli e profumi fuori dalla camera interna dell'apparato, 2) garantire le mosche sono raccolti almeno un giorno prima l'esperimento per ridurre gli effetti potenziali di anestesia freddo, 3) 2 ore prima dell'esperimento for...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Tadmiri Venkatesh per il suo incoraggiamento a preparare questo manoscritto, Dova Brenman e Selwyn Chui per i loro commenti costruttivi, Elyssa Burg e Wayne Rasband per aver progettato la macro in ImageJ per tutte le distanze di interfly e per le distanze più vicine. Gli autori desiderano inoltre ringraziare i revisori per i loro commenti costruttivi.

A.A.A, M.C.C. e A.F.S erano responsabili della progettazione della ricerca; S.N.J., A.A.A., M.N., Z.R. e A.J.M. hanno eseguito gli esperimenti. A.A.A, M.N., A.J.M. e M.C.C e A.F.S. hanno analizzato i dati; A.R.M. e A.F.S. hanno scritto il manoscritto.

Questo lavoro è stato sostenuto da premi di ricerca PSC-CUNY, finanziati congiuntamente dal Professional Staff Congress e dalla City University di New York ad A.F.S.; da finanziamenti interni dalla Western University ad A.F.S.; da una borsa di studio per laureati in Matematica, Biologia, Chimica e Geologia per insegnanti in formazione e da una borsa di studio Louis Stokes Alliance for Minority Participation ad A.A.A.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio zoom stereoscopico Nikon   SMZ-645Qualsiasi altro cannocchiale standard per la manipolazione delle mosche funzionerebbe
Piccoli pennelli per spingere le mosche
Jazz-mixFisher33545qualsiasi altro cibo standard per drosophila funzionerebbe
Mini-Alarm Timer/Cronometro
  Penne
Nastro
Clip per raccoglitori di medie dimensioniPunti metalliciper tenere insieme le camere: clip medie da 1-1/4" (32 mm) con capacità di 5/8"
piccoli SupportStandsCarolina 707161per tenere le camere in orientamento verticale
Morsetti BuretCarolina707362
Fotocamera digitaleNikon  Coolpix S8000 per scattare le foto fisse
Piccolo righelloper poter ridimensionare il
pannello a tre ante e la coperturaper fornire uno sfondo bianco e una luce omogenea.
martellanteQualsiasi tappetino per mouse funziona.
Prisma 6GraphPad Software Inc.Prism 6 per Mac OS XQualsiasi software di analisi statistica con t-test, unidirezionale e due ANOVA funzionerebbe
Sharpieadesivo del banco bianca Tappetino

Riferimenti

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