Confrontando l'affinità delle proteine-GTPasi legame con saggi Concorso

Summary

Questo protocollo confronta le affinità relative dei partner di legame per le GTPasi della famiglia Rho, incluso Rac1. In vivo, le proteine leganti Rac1 competono per una singola interfaccia di legame, la cui conformazione è dettata da un nucleotide legato. Il nucleotide è importante e difficile da controllare sperimentalmente, a causa dell'alto tasso di idrolisi.

Abstract

In questo protocollo dimostriamo un metodo per confrontare la competizione tra le proteine leganti la GTPasi. Un tale approccio è importante per determinare le capacità di legame delle GTPasi per due motivi: il fatto che tutte le interazioni coinvolgano la stessa faccia delle GTPasi significa che gli eventi di legame devono essere considerati nel contesto dei concorrenti, e il fatto che il nucleotide legato debba anche essere controllato significa che gli approcci convenzionali come l'immunoprecipitazione non sono adatti per la biochimica delle GTPasi. Il test si basa sull'uso di proteine purificate. Il Rac1 purificato immobilizzato su perline viene utilizzato come proteina esca e può essere caricato con GDP, una versione non idrolizzabile di GTP o lasciato libero da nucleotidi, in modo da poter controllare lo stadio di segnalazione da studiare. Le proteine leganti da studiare vengono purificate da cellule di mammifero, per consentire il corretto ripiegamento, mediante un tag GFP. L'uso dello stesso tag su entrambe le proteine è importante perché non solo consente una rapida purificazione ed eluizione, ma consente anche il rilevamento di entrambi i concorrenti con lo stesso anticorpo durante l'eluizione. Ciò significa che le quantità relative delle due proteine legate possono essere determinate con precisione.

Introduction

Il citoscheletro di actina che determina la forma, la polarità e le proprietà migratorie delle cellule di mammifero è regolato dalla famiglia Rho delle piccole GTPasi. Le GTPasi della famiglia Rho includono RhoA che stimola la contrazione del citoscheletro, Rac1 che stimola la ramificazione dell'actina e la protrusione della membrana e Cdc42 che ha effetti simili sulla polimerizzazione dell'actina a Rac1 e provoca la formazione di filopodi ^1,2. L'attività di segnalazione della GTPasi è determinata dal legame di un nucleotide, che controlla la contrazione e il rilassamento dei loop switch I e switch II che mediano le interazioni proteina-proteina sia con i regolatori che con gli effettori. Le GTPasi legate alla guanosina 5'-trifosfato (GTP) attivano gli effettori a valle, mentre la forma legata alla guanosina 5'-difosfato (GDP) è inattiva. Nella cellula, i cicli di idrolisi del GTP e di scambio nucleotidico consentono un rapido turnover dei segnali della GTPasi necessari per la dinamica del citoscheletro. Il turnover nucleotidico è regolato da tre meccanismi. I fattori di scambio nucleotidico guanina (GEF) stabilizzano la GTPasi libera da nucleotidi, catalizzando lo scambio di GDP per GTP e quindi stimolando l'attività di segnalazione della GTPasi ^3,4. Le proteine attivanti la GTPasi (GAP) catalizzano l'idrolisi del GTP in GDP, inibendo così l'attività di segnalazione della GTPasi ⁵. Molecole sequestranti come il regolatore della condensazione della cromatina 2 (RCC2) e gli inibitori della dissociazione nucleotidica guanina (GDI) oscurano i circuiti di commutazione e, nel caso dei GDI, rimuovono la GTPasi dalla membrana interagendo con la coda di prenile ^6,7. Ciascuna delle tre classi di molecole regolatorie interagisce con i loop di commutazione, così come gli effettori a valle e alcuni regolatori del traffico come la coronina-1C ⁷. Lo scopo di questo protocollo è misurare la competizione per il sito di legame dell'interruttore I/II tra regolatori putativi e molecole di segnalazione a valle. Va notato che i saggi di competizione testano il legame a un sito di legame condiviso, quindi questo protocollo non è adatto per testare le interazioni con altri siti, come il legame dei GDI alla coda di prenile.

La sottigliezza delle differenze di conformazione tra forme attive e inattive, combinata con la natura labile del nucleotide legato, ha reso difficile lo studio degli eventi di legame con GTPasi. Il ruolo del nucleotide legato significa che i saggi di legame convenzionali come l'immunoprecipitazione o la risonanza plasmonica di superficie non sono adatti per l'indagine, poiché il nucleotide non può essere controllato. Questo ostacolo è aggravato dalla sovrapposizione nei siti di legame di GEF, GAP, effettori, molecole sequestranti e molecole di traffico, che rendono difficile interpretare i dati di legame per una singola interazione nel contesto della competizione che si verificherà nella cellula. L'immunoprecipitazione, in particolare, è compromessa dalla competizione tra i partner di legame, poiché in determinate condizioni cellulari, un partner di legame potrebbe essere identificato a spese di tutti gli altri, mentre in altre condizioni, un altro partner potrebbe dominare. La natura dinamica della segnalazione della GTPasi è essenziale per la funzione della GTPasi e deve essere considerata quando si analizzano le relazioni tra le interazioni di legame di diversi regolatori. Infatti, di recente abbiamo descritto un percorso che si basava fortemente sul vincolo competitivo. Abbiamo identificato la coronina-1C come una molecola di traffico che si lega agli anelli di commutazione di GDP-Rac1 ⁷. Nelle aree a bassa attività GEF, il traffico dominerebbe il traffico, rimuovendo il Rac1 da quelle regioni. Tuttavia, quando Rac1 viene consegnato alle regioni della cellula in cui l'attività del GEF è elevata, il GEF supererebbe la coronina-1C, attivando così sia Rac1 che impedendo la rimozione di Rac1 mediata dalla coronina-1C da quell'area. Il modello va oltre, perché l'azione del GEF scambia il PIL vincolato per il GTP, spostando l'equilibrio ancora più lontano dalla coronina-1C. Di conseguenza, l'attività di Rac1 potrebbe essere spiegata interamente in termini di competizione e affinità relativa.

In questo protocollo, descriviamo un metodo per confrontare le affinità relative di diversi partner di legame per piccole GTPasi, utilizzando Rac1 come esempio. Utilizzando un approccio proteico purificato, è possibile mettere insieme una catena di eventi di segnalazione mediante confronto a coppie, in un esperimento in cui il nucleotide legato può essere strettamente controllato.

Protocol

1. Purificazione di GTPase GST-tagged

1. Cultura una E. coli come BL21 trasformato con pGEX-Rac1 O / N a 37 ° C, agitando a 220 rpm, in 500 ml di media autoinduzione (25 mM Na ₂ HPO _4, 25 mM KH ₂ PO _4, 50 mM NH ₄ Cl, 5 Na mM ₂ SO _4, 2 MgSO _mm 4, 2 mM CaCl _2, 0,5% glicerolo, 0,05% di glucosio, lattosio 0,2%, 5 g Triptone, 2,5 g estratto di lievito, 100 mg / ml ampicillina).
2. Batteri Harvest per centrifugazione per 10 minuti a 10.000 xg, 4 ° C.
3. Risospendere pellet batterico in 20 ml di reagente di estrazione di proteine, inibitore della proteasi 1x e incubare per 20 min a temperatura ambiente con inversione.
4. Chiarire il lisato mediante centrifugazione a 40.000 xg per 30 min.
5. Aggiungere 2 ml di glutatione biglie magnetiche, lavati con PBS (PBS: Na ₁₀ mm 2 HPO _4, 1,8 mm KH _{2 PO} 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
6. Incubare per 2 ore, mescolando per inversione a 4 ° C.
7. Lavare perline proteina-caricato quattro volte con 10 ml di PBS, utilizzando un sorter particella magnetica per precipitare le perle ad ogni passo.
8. Perline in 2 ml di PBS e conservare risospendere proteina-caricato a -80 ° C in aliquote di 100 microlitri fino a quando necessario.

2. Espressione di proteine ​​GTPasi binding

1. Il giorno prima dell'esperimento, plasmidi transfettare che codificano la proteina fluorescente verde (GFP) -tagged versioni di ogni proteina-GTPasi legame in un pallone da 75 cm ² separata di HEK293T come segue. Per la convalida di nucleotide carico, transfect GFP-tagged TrioD1 in un terzo di 75 cm ² fiasco di HEK293T.
   1. Diluire polyethylamine a 1 mg / ml in 100 ml di NaCl 150 mM sterile.
   2. Aggiungere 27 ml polyethylamine diluito a 223 ml ridotti multimediali siero.
   3. Aggiungere 12 mg plasmide DNA per 250 microlitri ridotti multimediali siero.
   4. Incubare ogni provetta per 2 minuti a temperatura ambiente.
   5. Unire la polyethylamine e DNA mescola in una singola provetta e agitare per 2 min.
   6. Incubare per 15-20 minuti a temperatura ambiente.
   7. Sostituire i mezzi di crescita (Dulbecco Modified Eagle media, il 10% di siero bovino fetale, 2 mM di L-glutammina, antibiotici), sul 90% confluenti HEK293T con 5 ml di terreni di coltura fresco.
   8. Aggiungere la miscela polyethylamine / DNA combinato al pallone e incubare O / N a 37 ° C, 5% CO _2.

3. Purificazione di proteine ​​GTPasi binding

1. Sciacquare fiaschi di cellule trasfettate in PBS e scarico pallone per 5 minuti, aspirando liquido libero.
2. Raschiare le cellule in 500 microlitri di buffer di lisi (50 mM Tris-HCl (pH7.8), 1% Nonidet P-40, 1x inibitore della proteasi) in provetta per microcentrifuga.
3. Lisare le cellule miscelazione per inversione a 4 ° C per 30 min.
4. Durante lisi, lavare due lotti di 40 microlitri GFP-Trappola perle tre volte con tampone di lisi fresco, perline sedimenta a 2.700 xg per 2 minuti tra un lavaggio.
5. Chiarire lisati di centrifugazione a 21.000 xg per 10 min.
6. Trasferimento chiarito lisato di ciascuna delle proteine ​​concorrenti per separare lavate perline GFP-trappola e che consentono di proteine ​​GFP-fusione di legarsi per 2 ore, mescolando per inversione a 4 ° C. Tenere lisato da cellule GFP-TrioD1 sul ghiaccio.
7. Lavare caricate perline GFP-trap due volte in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w / v) Nonidet P-40 e due volte in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl ₂ , sedimenta perline a 2.700 xg per 2 minuti tra lavaggi.
8. Eluire proteine ​​GFP-fusione con l'aggiunta di 40 microlitri 0,2 M glicina (pH 2,5) e pipettando su e giù per 30 sec. Immediatamente perline sedimenti a 21.000 xg per 60 s e trasferimento di liquidi in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 4 ml 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Fate questo in fretta per limitare i danni alla proteina purificata.
9. Analizzare 1 ml di ogni proteina purificata mediante Western blot e sonda con un anticorpo anti-GFP stabilire resa relativa utilizzando un blott quantitativaSistema ing secondo il protocollo del produttore. In alternativa, la determinazione delle concentrazioni di proteine ​​di acido bicinconinico (BCA) assay ma questo introduce errori se le proteine ​​non reagiscono con il dosaggio in modo identico o ci sono proteine ​​contaminanti.
10. Uguagliare concentrazione proteica molare con l'aggiunta di 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl _2.

4. Nucleotide caricamento di GTPase

1. Scongelare un'aliquota di GST-Rac1 biglie magnetiche, previste al punto 1.
2. Prendere 90 ml di GST-Rac1 perline e lavare tre volte con 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, EDTA 4 mM, utilizzando una selezionatrice particella magnetica per precipitare le perle ad ogni passo.
3. Aspirare tampone da perline e aggiungere 100 ml di 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, EDTA 4 mm.
4. A seconda che il PIL, GTP o no nucleotide carico è necessario per l'esperimento della concorrenza, aggiungere 12 ml PIL 100 mm, 12 microlitri gu 10 mManosine 5 '- [γ-tio] trifosfato (GTPγS) o nessuna nucleotide a 60 microlitri GST-Rac1 perline.
5. Per i controlli nucleotide-caricamento, dividere i restanti perle in tre aliquote di 10 microlitri e aggiungere 2 ml PIL 100 mm, 2 pl 10 GTPγS mM o no nucleotide ad ogni provetta.
6. Incubare miscele tallone per 30 minuti a 30 ° C con agitazione.
7. Stabilizzare nucleotide-bound Rac1 per aggiunta di 1 M MgCl _2: 3 microlitri al mix sperimentale (passo 4.4), 0,5 microlitri a ciascuna delle miscele di controllo (passo 4.5).

5. Concorrenza vincolante.

1. Impostare 6 tubi microcentrifuga, ciascuna contenente:
   200 microlitri 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl ₂
   10 microlitri sperimentali perline Rac1 nucleotide-caricati (dal punto 4.7)
   5 microlitri proteina Rac1-binding A (proteina di legame costante)
2. Per ogni tubo, aggiungere 0, 1, 2,5, 5, 10 o 20 l-Rac1 binding protein B (proteina di legame variabile). Questi volumi assumono unpproximately uguali concentrazioni di magazzino delle proteine ​​di legame costante e variabile e può essere necessario un aggiustamento.
   1. Regolare volumi di proteine ​​leganti A e B se ci sono grandi differenze tra le affinità di legame delle due proteine ​​e questo dovrebbe essere determinati empiricamente attraverso le ripetizioni sperimentali. Portare il volume totale della miscela di legame di 235 ml per aggiunta di 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl _2.
3. Impostare una provetta da microcentrifuga contenente:
   200 microlitri 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl ₂
   10 microlitri sperimentali perline Rac1 nucleotide-caricati (dal punto 4.7)
   10 microlitri proteina Rac1-binding A (proteina di legame costante)
4. Impostare il PIL, GTPγS e senza tubi di controllo nucleotide:
   200 microlitri 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl ₂
   10 microlitri perline Rac1 controllo caricati al passo 4.5 con il PIL, GTPγS o no nucleotidi e stabilizzato al punto 4.7.
   180 microlitri HEK293T GFP-TrioD1 lisato, preparata come al punto 3.6
   4 microlitri 1 M MgCl ₂
5. Incubare la miscela per 2 ore, mescolando per inversione a 4 ° C.
6. Lavare le perline tre volte con 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl _2.
7. Eluire proteine ​​legate in 20 microlitri riducenti tampone (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glicerolo, 0,02 mg / ml di blu di bromofenolo, 5% β-mercaptoetanolo).

6. Analisi della concorrenza

1. Risolvere 10 ml di proteina legata (passo 5,6) mediante elettroforesi dodecil solfato di sodio gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) e Western Blot.
2. Incubare la membrana a 4 ° CO / N in anticorpo anti-GFP diluito 1/1000 in tampone bloccante diluito a 1x in PBS, 0,1% di Tween-20 per rilevare entrambe le proteine ​​GTPasi legame con tag.
3. Lavare la membrana per tre volte per 10 minuti con PBS, 0,1% Tween-20.
4. Incubare la membrana per 30 minuti a RT in DyLight 800 sec-coniugato anti-coniglioanticorpo daria, diluito 1 / 10.000 in tampone bloccante diluito a 1x in PBS, 0,1% di Tween-20.
5. Lavare la membrana per tre volte per 10 minuti con PBS, 0,1% Tween-20.
6. Scansione la membrana utilizzando un sistema di imaging a raggi infrarossi, utilizzando il software per misurare l'intensità di banda secondo il protocollo del produttore.
7. Tracciare la intensità della banda di ciascuna proteina contro il volume del concorrente variabili (Protein B).
8. Dividere il volume di concorrente variabile nel punto in cui le linee si intersecano dal volume di concorrente costante (Proteina A, 5 ml) per determinare il rapporto concorrente che è raggiunto l'equilibrio.
9. Per la convalida dello stato di nucleotide-caricamento, membrane sonda per p21-chinasi attivata 1 (PAK1) (un'unità di effetti) e GFP-TrioD1 (un GEF), come descritto nei passaggi 6.1-6.6.

Results

Questo protocollo è progettato per calcolare le relative affinità di legame per i partner Rac1, senza la necessità di conoscere la precisa concentrazione dei concorrenti (Figura 1). Determinazione della concentrazione proteica introduce errori e quando si considera la concorrenza tra le molecole in un percorso di segnalazione non è necessaria. Tuttavia, è importante sapere che i due concorrenti hanno la stessa concentrazione molare nelle soluzioni madre a consentire rapporti semplici da calcolare quando si aggiungono volumi diversi per il saggio. 40 ml di perline GFP-trap hanno una capacità di legame di ~ 300 pmol così un confluente 75 centimetri ² fiaschi di altamente cellule che esprimono saturerà le perline, con il risultato che i preparativi delle due diverse proteine ​​di legame saranno simili prima della regolazione (figura 2A). Se una delle proteine ​​esprime male, questo problema può essere superato purificando quella proteina da più di un pallone di cellule.

8 (Figura 2B). GEFs legano preferenzialmente al nucleotide-liberi GTPasi per stabilizzare lo stato di transizione. Come GEFs sono di bassa abbondanza, solitamente inattivo e spesso asciugare bene male, è meglio iperespressione di un GEF o GEF frammento di prova GTPasica senza nucleotide. Usiamo spesso la prima omologia Dbl di Trio, espresso come una fusione GFP (GFP-TrioD1 ⁹⁾ (Figura 2B), ma qualsiasi GEF avrebbe funzionato. Le proteine ​​che si legano al GTPasi PIL-caricati sono più rari. Recentemente abbiamo riportato RCC2 come una di queste proteine ^​​7, o PIL di carico può essere convalidato semplicemente come binding né alla GEF né effettrici.

L'uscita dal esperimento sarà una macchia occidentale raffigurante i due partner di legame GFP-tagged legati alla GTPasi. Utilizzando un singolo anticorpo per rilevare entrambe le proteine, le concentrazioni alle quali simili quantità di entrambi i concorrenti legano può essere determinato e quindi le relative affinità presupposta. In questa competizione esempio, tra il dominio propulsore della proteina Rac1-tratta, Coronin-1C (Rac1-binding protein A), e la proteina Rac1-sequestro, RCC2 (Rac1-binding protein B), è dimostrato (Figura 3A). Utilizzando un volume costante di Coronin-1C elica (5 ml), e l'aggiunta di crescenti volumi di RCC2, possiamo vedere dalla GFP macchia che l'equilibrio è raggiunto a 1,25-2,5 ml di RCC2 (asterisco), dimostrando che ha una forte RCC2 affinità per Rac1 di Coronin-1C. Misurando l'intensità delle bande utilizzando Western blotting quantitativa, e riportando i valori medi per ogni competitoR, il punto di equilibrio può essere calcolata con precisione identificando i volumi in cui le curve si intersecano (Figura 3B).

Uno dei possibili ostacoli ad un dosaggio competere con successo è se il partner di legame si legano l'uno all'altro così come legame Rac1. Nella Figura 3A + B dimostriamo concorrenza tra RCC2 e il dominio propulsore di Coronin-1C, piuttosto che full-length Coronin-1C. La ragione per usare la Coronin troncato è che Coronin-1C si lega anche RCC2 attraverso il dominio di coda. Quando full-length Coronin-1C è titolato con RCC2, legame di entrambe le proteine ​​viene rilevato, a causa della formazione del complesso ternario, piuttosto che la concorrenza (Figura 3C). Se la concorrenza è in corso, legame di una proteina aumenta mentre l'altra diminuisce, e totale legato GFP-fusione rimarrà costante. Nei casi in cui un complesso ternario forma è necessario troncare una delle proteine ​​GTPasi vincolanti, talché la competmodifiche ai contenuti interagire non più.

Figura 1. Flusso di lavoro. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro per determinare l'affinità delle proteine ​​GTPasi legame con saggi di concorrenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. La convalida di proteine ​​purificate. (A) purificato GFP-tagged proteine ​​analizzate mediante Western blot vincolante, sondando con anti-GFP per determinare la resa relativa delle due proteine ​​Rac1. Questo tipo di equalizzazione durante l'esperimento permette la concentrazione delle due proteine ​​di essere regolata in modo che corrispondano nell'esperimento vincolante. (B) GDP, GTPγS e non nucleotide-caricato GST-Rac1 è stata incubata con lisato da HEK293T esprimono GFP-TrioD1 e proteine ​​rilevate tracciando per PAK1 endogena o sovraespresso GFP-TrioD1 legate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Western blot di proteine ​​relativo vincolante. Uscite esempio da saggi di concorrenza vincolante. (A) GDP-caricato Rac1 è stato mescolato con 5 microlitri GFP-Coronin-1C dominio elica e volumi crescenti di GFP-RCC2 stati titolato in. Per Western blotting proteine ​​legate per GFP, problemi con rilevamento differenziale delle due proteine ​​vengono evitati e il segnale GFP riporta il rapporto molare tra i due proteine ​​di fusione. Gli asterischi indicano i rapporti di concorrenza in eithelato r il punto di equilibrio. (B) Banda intensità rilegati proteine ​​GFP fusione di tre esperimenti indipendenti sono stati misurati mediante Western blotting quantitativa, utilizzando fluoroforo-coniugato anticorpi secondari e le medie complottato per calcolare la quantità di RCC2 necessaria per raggiungere l'equilibrio. (C ) Esempio di output da un esperimento in cui proteine ​​Rac1 vincolanti legano fra loro e formano un complesso ternario, invece di competere. PIL-caricato Rac1 è stato mescolato con 5 microlitri GFP-RCC2 e volumi crescenti di GFP-Coronin-1C full-length sono stati titolati in. L'aumento del limite GFP-Coronin-1C senza perdita di limite GFP-RCC2 indica ternario formazione complessa. Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo per confrontare le affinità relative di coppie di piccole proteine leganti la GTPasi. I passaggi chiave sono la preparazione di proteine leganti la GTPasi purificate e il caricamento nucleotidico della GTPasi. L'uso di proteine leganti la GTPasi con lo stesso tag GFP, consente di determinare con precisione le concentrazioni alle quali si legano quantità simili di ciascun concorrente. L'uso della GTPasi ricombinante caricata con nucleotidi consente l'interrogazione delle proprietà di legame della GTPasi in specifiche condizioni di attività. Questo passaggio è anche il più sensibile, in quanto i nucleotidi si idrolizzano e si staccano dalla GTPasi se le condizioni di magnesio non vengono mantenute con precisione.

Nella cellula, il gran numero di proteine leganti la GTPasi combinato con il rapido turnover nucleotidico rende tali percorsi difficili da interpretare. La semplicità di questo metodo nel confrontare solo coppie di proteine leganti e nell'utilizzare condizioni di carico nucleotidico attentamente controllate consente di chiarire le vie di segnalazione. Tuttavia, il maggior punto di forza del protocollo è anche la più grande debolezza in quanto si tratta di una semplificazione della situazione in vivo . I saggi di competizione possono essere utilizzati per costruire un'ipotesi robusta, ma questa dovrebbe poi essere testata nelle cellule mediante esperimenti di knockdown.

Ci sono tre caratteristiche che devono essere considerate quando si selezionano le proteine leganti la GTPasi marcate con GFP da utilizzare nell'esperimento. In primo luogo, le proteine di fusione devono esprimersi bene nelle cellule di mammifero, come HEK293T, poiché i saggi di competizione richiedono una quantità ragionevole di proteine. In secondo luogo, deve essere possibile purificare la proteina ricombinante senza una degradazione significativa e, laddove ciò non sia possibile, dovrebbe essere preso in considerazione il clonaggio di un frammento legante la GTPasi. In terzo luogo, le due proteine leganti la GTPasi devono risolversi l'una dall'altra su SDS-PAGE per consentire l'analisi nella sezione 6.

Ci sono una serie di potenziali avvertimenti all'esperimento che devono essere considerati e possibilmente affrontati:

Possibile denaturazione delle proteine leganti la GTPasi purificate durante la fase di eluizione acida o impedimento sterico da parte del tag GFP. Nelle nostre mani, questi non sono stati un problema, ma devono essere messi alla prova. Le proteine purificate possono essere testate in saggi funzionali ¹⁰. Esistono ora kit commerciali per testare l'attività di GEF o GAP senza la necessità di nucleotidi marcati con isotopi. Le proteine sequestranti, per loro natura, proteggono le GTPasi dall'attività di GEF o GAP, quindi possono essere utilizzate come inibitori competitivi nei saggi commerciali di GEF o GAP, come abbiamo fatto nella nostra recente pubblicazione ⁷. La caratteristica rilevante delle proteine che trasportano la GTPasi è la capacità di legare la GTPasi, e questo può essere facilmente testato in un saggio di pull down. Un approccio alternativo per testare l'integrità proteica applicabile a tutte le proteine leganti consiste nel titolare la proteina eluita da perle GFP-trappola con glicina con la stessa proteina rimossa dalle perle GFP-trappola mediante scissione enzimatica. L'esperimento sarebbe stato analizzato sondando sia la proteina marcata con GFP che quella scissa con un anticorpo contro la proteina stessa. Se la proteina non viene danneggiata dall'eluizione, l'equilibrio dovrebbe essere raggiunto con un rapporto 1:1. Questo approccio indicherebbe anche se la presenza del tag GFP stesso compromette le proprietà di legame della proteina candidata, sebbene ciò richieda la produzione di un costrutto con un sito di scissione enzimatica tra il tag e la proteina legante. Indipendentemente dal fatto che la proteina sia compromessa dal tag o dalla fase di eluizione, il problema potrebbe essere affrontato modificando il protocollo per utilizzare un metodo di purificazione alternativo. Piuttosto che GFP, le proteine leganti potrebbero essere marcate con His, purificate con Ni-NTA e analizzate con un anticorpo contro l'His-tag. La caratteristica importante è che entrambe le proteine leganti devono condividere un tag comune anche se, se necessario, potrebbero essere aggiunti due tag a una proteina, uno per la purificazione e l'altro per il rilevamento.

Il protocollo è progettato per studiare la competizione tra le interazioni con i domini I/II dello switch. Sebbene la maggior parte delle interazioni GTPasi siano mediate da questo motivo, ci sono alcune eccezioni, in particolare le interazioni dei GDI che si legano alla coda del prenile, oltre a oscurare i domini di commutazione. In linea di principio, il protocollo potrebbe essere adattato per utilizzare la GTPasi purificata da cellule di mammifero, in modo che la GTPasi sia prenilata, tuttavia, la presenza di più siti di legame o effetti allosterici complicano l'interpretazione dei dati di legame della competizione. Ulteriori problemi associati a tale modifica sono che i GDI co-purificano con la GTPasi da cellule di mammifero, compromettendo la purezza delle proteine isolate e la natura idrofobica dei gruppi prenilici significa che le GTPasi prenilate sono associate al GDI o alla membrana lipidica e tali fattori dovrebbero essere considerati nell'esperimento.

La quantità di GST-Rac1 utilizzata nel saggio. La proteina legante la GTPasi costante deve essere a una concentrazione maggiore rispetto alla Rac1, altrimenti quando viene aggiunta la concorrente, si legherà semplicemente alla Rac1 libera. Sarà immediatamente ovvio se ciò è accaduto poiché il legame del concorrente, senza una perdita della proteina costante, sarà rilevato più o meno allo stesso modo di quando le due proteine concorrenti si legano l'una all'altra, come mostrato nella Figura 3B. Come controllo aggiuntivo (Fase 5.3), deve essere inclusa una reazione di legame contenente il doppio della quantità di proteina a legame costante e nessuna proteina a legame variabile (Fase 5.3). Se il Rac1 nell'esperimento di titolazione è saturo, il raddoppio della quantità di proteina a legame costante non avrà alcun effetto sull'output. I volumi suggeriti nel protocollo dovrebbero essere appropriati, ma la quantità di Rac1 può essere facilmente ridotta. Se si osserva il legame del concorrente senza la perdita del partner di legame costante, si dovrebbe tentare di ridurre la quantità di Rac1 prima di provare a mappare i siti di legame per evitare la formazione di complessi ternari.

Interazione non specifica delle proteine leganti la GTPasi con la GST o la perlina, nonché specificamente con Rac1. Questo problema si manifesterebbe con il legame residuo della proteina legante la GTPasi costante, anche quando la proteina legante la GTPasi variabile ha raggiunto un plateau ad alta concentrazione. L'identificazione di questo problema sarà facilitata dalla conduzione di esperimenti reciproci in cui le proteine costanti e variabili che legano la GTPasi vengono scambiate. Gli esperimenti reciproci miglioreranno anche notevolmente l'accuratezza della stima del punto di equilibrio, quindi dovrebbero essere sempre inclusi. Nei casi di legame non specifico, le concentrazioni relative alle quali viene raggiunto l'equilibrio possono ancora essere calcolate confrontando l'intensità della banda tra i massimi e i minimi per ciascuna proteina, o misurando l'entità del legame non specifico utilizzando perle GST come esca, piuttosto che GST-Rac1.

I saggi di pull down che utilizzano diverse condizioni di carico nucleotidico devono essere utilizzati per integrare il test di competizione descritto in questo protocollo. Determinare la preferenza nucleotidica dei partner è importante sia per comprendere gli eventi di competizione che per comprendere la via di segnalazione in cui è coinvolta la proteina legante la GTPasi. Nella Figura 2B analizziamo il legame di proteine con preferenza stabilita per la GTPasi caricata con GTP o priva di nucleotidi come mezzo per convalidare il carico nucleotidico. Tuttavia, è sensato studiare l'effetto del carico nucleotidico anche su ciascuno dei concorrenti. Se gli ipotetici concorrenti mostrano preferenze diverse, la competizione darà un contributo minore alla via di segnalazione, e in effetti il turnover nucleotidico è probabilmente il meccanismo che dirige lo scambio delle proteine leganti.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugbuster	Novagen	70584-3
Inibitore completo della proteasi	Roche	05 056 489 001
Perle magnetiche di glutatione	Pierce	88821
Polietilenimmina, ramificata, media Mw ~25.000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetale Siero Bovino Life	Technologies	10270-1-6
L-Glutammina	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Altamente instabile. Aliquotare e conservare a -80 immediatamente dopo la ricostituzione
GTPγ S	Sigma Aldrich	G8634	Altamente instabile. Aliquotare e conservare a -80 immediatamente dopo la ricostituzione
Tampone bloccante	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Anticorpo anti-GFP	Living Colors	632592	Utilizzare a 1/1000 di diluizione
DyLight 800 coniugato capra anti-coniglio anticorpo	secondario Fisher Scientific 10733944
Anticorpo PAK1	Segnalazione cellulare	2602S	Utilizzo a diluizione 1/1000
imaging a infrarossi Odyssey SA	Li-cor	9260-11PC