Articolo metodologico

Un Sistema di punteggio rapida fenotipica neurologica per la valutazione di progressione della malattia nel SOD1-G93A modello murino della SLA

DOI:

10.3791/53257

⸱

6 ottobre 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1ALS Therapy Development Institute

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo video descrive un metodo sensibile, affidabile e rapido per valutare i deficit neuromuscolari in un modello murino transgenico di sclerosi laterale amiotrofica.

Abstract

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Il topo transgenico SOD1-G93A è il modello animale più utilizzato di sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Alla ALS TDI abbiamo sviluppato un protocollo di screening fenotipico, dimostrato nel video qui, che valuta in modo affidabile la funzione neuromuscolare dei topi SOD1-G93A in modo rapido. Questo protocollo comprende un semplice sistema di punteggio neurologico (NeuroScore) progettato per valutare la funzione degli arti posteriori. NeuroScore si concentra sulla funzione degli arti posteriori perché i deficit degli arti posteriori sono i primi segni neurologici riportati di malattia nei topi SOD1-G93A. Il protocollo sviluppato da ALS TDI fornisce una valutazione imparziale dell'insorgenza della paresi (paralisi lieve o parziale), della progressione e della gravità della paralisi ed è sufficientemente sensibile da identificare i cambiamenti indotti dal farmaco nella progressione della malattia. In questo rapporto, la combinazione di un manoscritto dettagliato con un video riduce al minimo le ambiguità di punteggio e la variabilità tra gli sperimentatori, consentendo così l'adozione del protocollo da parte di altri laboratori e consentendo confronti tra studi che si svolgono in contesti diversi. Riteniamo che questo protocollo video possa fungere da eccellente strumento di formazione per i ricercatori presenti e futuri sulla SLA.

Introduzione

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Da quando il suo sviluppo negli metà del 1990 il modello di topo transgenico SOD1-G93A è stato il modello animale più diffuso della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) 1. Questo modello di topo transgenico è stato geneticamente modificato per iperespressione di una forma mutante del gene umano Cu / Zn superossido dismutasi 1 (SOD1) ospitare la glicina ALS-associata a mutazioni alanina a aminoacidi 93 (G93A). La mutazione G93A è una delle tante mutazioni nel gene SOD1 che collettivamente il make-up di circa un quinto dei casi di SLA familiare 2.

Il modello SOD1-G93A è diventato un cavallo di battaglia della ricerca lo sviluppo di farmaci SLA perché oltre alla sua evidente legame genetico per la SLA, si ricapitola molte delle caratteristiche patologiche della SLA nell'uomo come la perdita dei motoneuroni, progressiva debolezza muscolare e atrofia, con eventuale paralisi e la morte 3. Anche se, come spesso accade con modelli animali transgenici, c'è un bi intrinsecavariabilità ological associati con i topi SOD1-G93A. Scott et al. hanno determinato che le coorti di almeno 24 topi di genere equilibrata lettiera abbinati sono necessari disegni di studio farmaco-efficacia al fine di superare il rumore creato dalla variabilità biologica 4. Il gran numero di animali necessari in questi studi, in combinazione con la progressione della malattia aggressiva e la necessità di monitoraggio giornaliero vieta l'uso di tecniche in termini di tempo e potenzialmente stressanti elaborati per misurare forza e la funzione neuromuscolare (ad esempio, elettromiografia, forza di presa, Rotorod , ecc). Invece, evidenzia la necessità di un vivo strumento di screening in che valuta in modo affidabile la funzione neuromuscolare di topi SOD1-G93A in modo rapido.

A ALS TDI un protocollo è stato sviluppato che consente la valutazione affidabile della funzione neuromuscolare di topi SOD1-G93A in meno di 30 secondi per topo in media. Questo encompa protocolloSSES valutazione giornaliera della funzione degli arti posteriori utilizzando un semplice sistema di punteggio neurologico (NeuroScore) che è descritta in questa relazione in corso di stampa e in video. NeuroScore si concentra sulla funzione degli arti posteriori, perché i deficit arti posteriori sono il primo riferito segno neurologico della malattia nei topi SOD1-G93A 5,6. Inoltre, il protocollo sviluppato da SLA TDI fornisce una valutazione imparziale di insorgenza della paralisi (lieve o parziale paralisi), la progressione e la gravità di paralisi ed è abbastanza sensibile per identificare i cambiamenti indotti da farmaci a progressione della malattia.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono condotti in conformità con i protocolli descritti dai National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali e sono stati approvati dalla cura degli animali e l'uso istituzionale comitato di SLA TDI (IACUC).

1. Gli animali, della casa, e lo studio di design

Nota: Il mouse colonia SOD1-G93A è stato derivato dalla alta copia B6SJLTgN (SOD1G93A) ceppo 1Gur originariamente prodotto da Gurney ed altri 7.. La colonia è attualmente mantenuto attraversando transgenici maschi C57BL / 6-SJL con wild-type femmine C57BL / 6-SJL F1. Gli animali F1 sono generate dall'incrocio maschi SJL con le femmine B6. I topi sono spediti a ALS TDI settimanale a 35-45 giorni di età.

  1. Lasciare topi almeno una settimana per acclimatarsi al stabulario (luce 12 ore / buio ciclo, ad una temperatura di 18-23 ° C e 40-60% di umidità) prima di assegnare ad uno studio.
  2. Casa SOD1-G93A maschio mice un mouse per gabbia, in quanto gruppo ospitato i maschi tendono a combattere. Casa topi femmina SOD1-G93A fino a due per gabbia. Fornire arricchimento ambientale, sotto forma di capanne di plastica. Fornire cibo e acqua ad libitum, a meno che i topi fanno parte di uno studio che richiede la somministrazione del farmaco in acqua potabile / cibo. In questi casi, razione alimentare e registrare e acqua.
  3. Iniziare uno studio farmaco-efficacia in giro giorno di 50 anni e comprendono 64 lettiera corrispondenza di genere equilibrata topi (32 per coorte). Infine, assicurarsi che i ricercatori che conducono studi sono accecati alle condizioni sperimentali.
    Nota: Si raccomanda che un tipico studio farmaco-efficacia inizia a giorno 50 anni tuttavia, in base al tipo di intervento terapeutico potrebbe essere preferibile iniziare lo studio precedente o successiva.
    Nota: Uno studio con 32 topi per coorte è alimentato per rilevare droga effetti specifici di genere. Se non sono necessarie confronti specifici di genere, 24 topi per coorte dovrebbe essere sufficiente per rilevare droga effetti complessivi.

2. Peso corporeo

  1. Pesi corporei record per tutti i topi in studi giornaliero con una precisione di un decimo di grammo. Nota: Il peso corporeo è un indicatore sensibile della progressione della malattia e di qualsiasi malessere che potrebbero derivare da un trattamento farmacologico cronico.
  2. Peso corporeo mouse variano considerevolmente nel corso di una giornata, essendo più alta al mattino, quindi li registrano intorno alla stessa ora ogni giorno.

3. Neurologico Scoring System (NeuroScore)

  1. Valutare punteggi neurologici (NS) per ciascun topo quotidianamente osservando il mouse sotto le seguenti tre condizioni eseguite in sequenza: a) il mouse è sospeso dalla sua coda, b) il mouse viene permesso di camminare, e dopo l'inizio della paresi c) mouse viene posizionato su un lato.
    1. Per il test di sospensione posteriore, tenere il mouse circa 1,5 "dalla base della coda sopra la parte superiore del filo della loro gabbia casa per 1-2 sec, lontano dal bacino cibo, mentre obsErving arti posteriori. Ripetere il test di sospensione 3 volte e registrare il risultato più consistente.
    2. Per il test del cammino, posizionare il mouse su una superficie pulita che fornisce una certa trazione e una distanza di 25 cm (per es., Un tovagliolo di carta registrata giù per evitare scivolamenti). Lasciare che il mouse per camminare un totale di 75 cm (lunghezza 3X del tovagliolo di carta), mentre si osserva la sua andatura.
    3. Per il test "riflesso di raddrizzamento", posizionare il mouse sul lato sinistro o destro e utilizzando un cronometro misurare il tempo necessario per raddrizzarsi fino senza assistenza da entrambi i lati. Nota: solo una prova di questo test è richiesto.
  2. Determinare la NS di ogni arti posteriori (sinistra o destra) in modo indipendente su una scala da 0 a 4. Nota: Per esempio un punteggio di 0, 1 indica che il arti posteriori di sinistra NS è 0, mentre la destra arti posteriori NS è 1.
  3. Assegnare punteggi neurologici (0-4) corrispondente alla seguente serie di osservazioni (sintesi di cui alla tabella 1):
    1. Assegnare NS 0 (pre-sintomatica) se il seguente si osserva: Quando il mouse è sospeso per la coda, la arti posteriori presenta una strombatura normale cioè, punto di massima estensione di distanza dalla linea mediana laterale e rimane in questa posizione per 2 sec più a lungo. Quando è consentito il mouse per camminare, andatura normale si osserva.
    2. Assegna NS 1 (primi sintomi) se si osserva quanto segue: Quando il mouse è sospeso per la coda, la arti posteriori presenta una strombatura anormale, cioè, è compressa o parzialmente crollato verso linea mediana laterale O trema durante la sospensione della coda o è rientrato / abbracciato. Quando è consentito il mouse per camminare, andatura normale o leggermente lento si osserva.
    3. Assegnare NS 2 (insorgenza di paresi) se la seguente si osserva: Quando il mouse è sospeso per la coda, la arti posteriori è parzialmente o completamente crollato, che non si estende molto. (Ci potrebbe essere ancora il movimento articolare). Quando è consentito il mouse per camminare, il arti posteriori viene utilizzata per mot avantiion però arricciare le dita dei piedi verso il basso almeno due volte nel corso di un 90 centimetri passeggiata o qualsiasi parte del piede sta trascinando sulla parte inferiore della gabbia / tavolo. Quando il mouse è posizionato sul lato sinistro e destro, è in grado di raddrizzarsi entro 10 secondi da entrambi i lati.
    4. Assegnare NS 3 (paralisi) se il seguente si osserva: Quando il mouse è sospeso per la coda, c'è la paralisi rigida in arti posteriori OR minimo movimento articolare. Quando è consentito il mouse per camminare non c'è movimento in avanti però il arti posteriori non viene utilizzato per il movimento in avanti. Quando il mouse è posizionato sul lato sinistro e destro, è in grado di raddrizzarsi entro 10 secondi da entrambi i lati. Nota: Raramente, dopo l'inizio della paralisi, urina umidità potrebbe apparire sugli arti posteriori. Sinistra umidità urina non trattata può portare a urina "bruciare" e lesioni cutanee. Trattare urina umidità clipping i capelli, applicare acqua calda assorbe per rimuovere l'urina, e asciugare delicatamente asciutto. Se lesioni cutanee sono presenti applicano antibiopomata tic.
    5. Assegnare NS 4 (Humane end-point), se la si osserva seguente: Quando il mouse è sospeso per la coda, c'è la paralisi rigida nelle arti posteriori. Quando è consentito il mouse per camminare, non vi è alcun movimento in avanti. Quando il mouse è posizionato sul lato sinistro e destro non è in grado di raddrizzarsi entro 10 secondi da una parte QUALSIASI. Cioè, l'assenza del riflesso di raddrizzamento.

4. Data Entry e analisi

  1. Nel corso di uno studio di efficacia droga, inserire i dati raccolti per ogni mouse in una Laboratory Information Management System (LIMS) o in un software di foglio elettronico disponibile in commercio.
    Nota: il software LIMS ALS TDI-sviluppato è un repository centrale per tutti i dati raccolti da studi interni, rendendo questi dati facilmente accessibile nel tempo per gli investigatori SLA TDI. LIMS tracce qualsiasi individuo del mouse, con il suo ID univoco, al suo lignaggio, il peso corporeo o punteggio neurologico tutti i giorni di studio,e comprende tutte le altre osservazioni rilevate durante la sua vita. LIMS genera infine un foglio che viene utilizzato per le analisi successive.
  2. Dopo il completamento di uno studio di droga efficacia, cioè, quando tutti i topi raggiungono il punto finale umana, software uso foglio (vedi TABELLA MATERIALI) per calcolare il combinato NS per ogni mouse, per ogni giorno facendo la media del hindlimb sinistra e destra NS . Avanti, calcola l'età media di ciascun NS per ogni mouse e il numero di giorni ogni mouse passa ad una particolare NS.
  3. Analizzare movimenti complessivi NS nel tempo importando i dati dal foglio di calcolo al software statistico (vedi Tabella dei Materiali). Montare questi dati utilizzando un modello di regressione logistica ordinale che stima l'atteso NS, con età media alla NS e droga trattamento come effetti nella regressione. Utilizzando il test del chi quadro log-rank stimare la probabilità effetto verosimiglianza e determinare se l'effetto della droga trattamento su NS progressione è statisticaly significativo (vedi file di codice supplementare per passo-passo le istruzioni).
    Nota: Un valore di p <0.05 è considerato statisticamente significativo.
    Nota: Questo metodo di analisi statistica rispetta la natura ordinale dei dati NS e la natura variabile delle traiettorie NS per singoli topi. Si è preferito perché percorsi individuali NS possono essere notevolmente diverse con conseguente NS tempo associata medie di gruppo che non sono sufficientemente riflettente di risposte NS. Inoltre, in alcuni casi NS possono oscillare, in particolare quando nella gamma da zero a uno.
  4. Infine, il software uso graficamente (vedi tabella dei Materiali) per generare "ordinale Expected NS vs mediana Età al NS" grafici per gli animali trattati con farmaci e di controllo (Figura 2; cfr Codice supplementare File per passo-passo le istruzioni). Utilizzare questi grafici per valutare comodamente spostamenti tra i gruppi trattati con farmaci e controllo interpolando dalla y l'età media di insorgenza della malattia (i.e., NS 2) sul asse x.
    Nota: La differenza di età media tra i due gruppi rappresenta un cambiamento farmaco-indotta ed è trattata come una misura pratica della grandezza dell'effetto.
    Nota: si sposta verso destra della curva della NS età mediana attesi indicano rallentato la progressione della malattia sintomatica. Al contrario, si sposta leftward nel NS curva della età media attesi indicano accelerato la progressione della malattia sintomatica.

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Risultati

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I dati neurologici punteggio di 90 maschi e 94 donne non trattate topi SOD1-G93A studiato presso ALS TDI nel corso del 2014 sono stati valutati. I risultati mostrano che i topi maschi di solito hanno una progressione della malattia più aggressiva rispetto ai topi di sesso femminile, come evidenziato da una percentuale maggiore della loro vita a NS 1 rispetto alle femmine. NS 2 e 3 NS si verificano con frequenza pressoché uguale in tutta generi. NS 0 è stato escluso dall'analisi perché è considerato un fenotipo "normale"...

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Discussione

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In questo rapporto, si descrive un protocollo video semplice e veloce che, se applicata correttamente, è in grado di valutare in modo affidabile la progressione della malattia nei topi SOD1-G93A e identificare cambiamenti indotte da farmaci. Mentre diversi gruppi hanno sviluppato sistemi di scoring fenotipiche per i topi SOD1-G93A 8-10, spesso non forniscono dettagli sufficienti sulla procedura e sono inadeguati per la replica. Come risultato, sistemi di scoring sono raramente utilizzati all'esterno del g...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Beth Levine per la revisione critica del manoscritto, Valerie Tassinari per lo sviluppo del protocollo di genotipizzazione e Matt Ferola e Carlos Maya per la loro eccezionale cura degli animali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ceppo B6SJLTgN(SOD1G93A)1GurThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME002726Ceppo di topi utilizzato in questo studio
BreedersBiomedical Research Models, Inc., Worcester, MAScala di mantenimento della colonia
NavigatoreOHAUS, Parsippany, NJModello N14120Utilizzato per pesare i topi
Nutra-GelHBio-Serv, Flemington, NJCibo umido fornito ai topi malati
Irradiato Lab Animal DietHarlan, Indianapolis, IN2918-111914MChow diet
Lab-grade Sani-chipsHarlan Teklad, Indianapolis, IN7090Biancheria da letto
JMPH SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC  v10.0.2Software statistico
Microsoft ExcelMicrosoft, One Microsoft Way, Redmond, WAExcel 2013 (v 15.0)Software per fogli di calcolo
GraphPad Prism 5GraphPad software Inc., La Jolla, CAv5.4Software grafico
Mouse HutsBio-Serv, Flemington, NJK3272Per l'arricchimento ambientale
#S4798

Riferimenti

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  1. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  2. Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
  3. Gurney, M. E. The use of transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis in preclinical drug studies. J Neurol Sci. 152, Suppl. 1 (6415), (1997).
  4. Scott, S., et al. Design, power, and interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
  5. Hegedus, J., Putman, C. T., Gordon, T. Time course of preferential motor unit loss in the SOD1 G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol. Dis. 28 (2), 154-164 (2007).
  6. Gordon, T., Ly, V., Hegedus, J., Tyreman, N. Early detection of denervated muscle fibers in hindlimb muscles after sciatic nerve transection in wild type mice and in the G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurol. Res. 31 (1), 28-42 (2009).
  7. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  8. Kim, K., Moore, D. H., Makriyannis, A., Abood, M. E. AM1241, a cannabinoid CB2 receptor selective compound, delays disease progression in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur. J. Pharmacol. 542 (1-3), 1-3 (2006).
  9. Weydt, P., Hong, S. Y., Kliot, M., Moller, T. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
  10. Azari, M. F., et al. Behavioural and anatomical effects of systemically administered leukemia inhibitory factor in the SOD1(G93A G1H) mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain Res. 982 (1), 92-97 (2003).
  11. Guan, Y., et al. Thiazolidinediones expand body fluid volume through PPARgamma stimulation of ENaC-mediated renal salt absorption. Nat. Med. 11 (8), 861-866 (2005).
  12. Savcheniuk, O. A., et al. The effect of probiotic therapy on development of experimental obesity in rats caused by monosodium glutamate. Fiziol. Zh. 60 (2), 63-69 (2014).
  13. Smittkamp, S. E., Brown, J. W., Stanford, J. A. Time-course and characterization of orolingual motor deficits in B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J mice. Neuroscience. 151 (2), 613-621 (2008).
  14. C, M., Gurney, M. E. A low expressor line of transgenic mice carrying a mutant human Cu,Zn superoxide dismutase (SOD1) gene develops pathological changes that most closely resemble those in human amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol. 93 (6), 537-550 (1997).
  15. Wegorzewska, I., Baloh, R. H. TDP-43-based animal models of neurodegeneration: new insights into ALS pathology and pathophysiology. Neurodegener. Dis. 8 (4), 262-274 (2011).
  16. Hatzipetros, T., et al. C57BL/6J congenic Prp-TDP43A315T mice develop progressive neurodegeneration in the myenteric plexus of the colon without exhibiting key features of ALS. Brain Res. 1584, 59-72 (2014).

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