Articolo metodologico
Le proprietà immunomodulanti di cellule umane staminali mesenchimali (MSC) appaiono sempre più rilevante per l'applicazione clinica. Utilizzando un sistema di co-coltura di cellule staminali mesenchimali e leucociti del sangue periferico pre-colorati con il colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE), si descrive la valutazione in vitro di MSC immunomodulazione sulla proliferazione dei leucociti effettrici e sottopopolazioni specifiche.
Le proprietà immunomodulatorie delle cellule staminali mesenchimali umane (MSC) multilineage sembrano essere molto rilevanti per l'uso clinico verso un'ampia gamma di malattie immuno-correlate. I meccanismi coinvolti sono sempre più chiariti e in questo articolo, descriviamo l'esperimento di base per valutare l'immunomodulazione delle MSC attraverso la soppressione della proliferazione leucocitaria effettrice. Rappresentando l'attivazione, la proliferazione leucocitaria può essere valutata con una serie di tecniche e in questo protocollo descriviamo l'uso del colorante cellulare fluorescente carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) per marcare i leucociti con successive analisi citofluorimetriche. Questa tecnica può non solo valutare la proliferazione senza radioattività, ma anche il numero di divisioni cellulari che si sono verificate, oltre a consentire l'identificazione della popolazione specifica di cellule proliferanti e l'espressione intracellulare di citochine/fattori. Inoltre, il test può essere personalizzato per valutare popolazioni specifiche di leucociti effettori mediante la selezione di marcatori di superficie di perline magnetiche di singole popolazioni di cellule mononucleate del sangue periferico prima della co-coltura con MSC. La flessibilità di questo test di co-coltura è utile per studiare le interazioni cellulari tra MSC e leucociti.
Le cellule staminali mesenchimali umane (MSC) sono progenitrici somatiche che possono differenziarsi in lignaggi mesodermiche parassiali di ossa, cartilagine e tessuto adiposo 1-4, così come ad alcuni lignaggi extramesodermal 5. In primo luogo isolato dal midollo osseo adulto, questi progenitori multilineage ora sono state trovate in numerosi tessuti 6-8 e, inaspettatamente, dimostrato di avere forti proprietà immunomodulanti che sembrano altamente suscettibili di applicazione clinica 9-12. Meccanismi dettagliati coinvolti negli effetti immunomodulatori sono attivamente indagati dell'effettiva applicazione in entità pat....
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Il consenso informato del paziente, come approvato dal comitato istituzionale di revisione deve essere ottenuto per l'uso di cellule umane.
1. Densità Isolamento gradiente di cellule periferiche mononucleari Sangue umano (PBMC)
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Figura 1 denota lo schema generale dell'esperimento, e la figura 2 mostra l'aspetto delle diverse condizioni di coltura cellulare come visualizzato in contrasto di fase invertita microscopia. Le MSC sono cellule aderenti con fibroblastica, morfologia a forma di fuso, mentre PBMC e leucociti sono piccole cellule non aderenti rotonde. Questi due tipi di cellule morfologicamente differenti può essere visto chiaramente nella co-coltura. Al termine del test, quando le PBMC (o leuckotyes) vengono aspirati.......
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Sempre più spesso, le proprietà immunomodulatorie delle MSC vengono tradotte in uso clinico più rapidamente rispetto alla capacità multilineage di queste cellule staminali18-20. Pertanto, le tecniche di co-coltura di MSC con leucociti e i saggi per valutare la funzione immunitaria sono importanti per delineare ulteriormente i meccanismi specifici coinvolti in queste proprietà per ottimizzare un'efficace applicazione terapeutica.
Uno degli aspetti tecnici più critici per il successo.......
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Non abbiamo nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni da NHRI (CS-104-PP-06 a B.L.Y.).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Densità grandient per l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Etichetta cellulare per il rilevamento della divisione cellulare |
| Fitoagglutinina (PHA) | Sigma | L8902 | Attivazione di PBMC |
| umane Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Attivazione di linfociti T umani, ad es. CD4+ cellule T, CD8+ cellule T, ecc. |
| autoMACS&commercio; Separatore | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separatore | Separatore di celle a base magnetica |
| autoMACS® Colonne | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | colonne di separazione |
| CD14 microsfere, umano | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Per la selezione positiva di CD14+ monociti e macrofagi da |
| microsfere CD4 PBMC, umano | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | Per la selezione positiva di linfociti T umani CD4+ da PBMC |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Terreno di coltura di PBMC/leucociti umani |
| DMEM, basso glucosio, piruvato | Life Technologies | 11885 | Terreno di coltura di cellule staminali mesenchimali umane (MSC) |
| L-glutammina | Life Technologies | 25030-081 | Integrazione per MSC medio completo |
| Penicillina/streptomicina | Life Technologies | 15070-063 | Integrazione per PBMC/leucociti e MSC medio completo |
| Siero fetale bovino (FBS) | 1) Hyclone, per coltura di MSC 2) Life Technologies, per tutte le altre cellule (ad es. PBMC, popolazioni specifiche di leucociti) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Lotti pre-test per il supporto di MSC in vitro Piastra per |
| coltura cellulare a 24 pozzetti | Corning | COR3524 | Piastra di co-coltura |
| Provetta da centrifuga da 50 ml | Corning | 430291 | Isolamento PBMC da sangue intero mediante Ficoll-Paque PLUS |
| Provetta da centrifuga da 15 ml... | Corning | 430766 | Raccolta delle frazioni cellulari marcate e non marcate |
| Provette a fondo tondo | BD Falcon | 352008 | Raccolta di cellule per analisi citofluorimetriche |
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