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Articolo metodologico

Valutazione della proprietà immunomodulanti di cellule staminali mesenchimali umane (MSC)

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DOI:

10.3791/53265

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24 dicembre 2015

 ,  ,  ,  , 
1Regenerative Medicine Research Group, Institute of Cellular & System Medicine, National Health Research Institutes (NHRI), 2National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes (NHRI), 3Institute of Microbiology & Immunology, National Defense Medical Center

In questo articolo

Sommario

Le proprietà immunomodulanti di cellule umane staminali mesenchimali (MSC) appaiono sempre più rilevante per l'applicazione clinica. Utilizzando un sistema di co-coltura di cellule staminali mesenchimali e leucociti del sangue periferico pre-colorati con il colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE), si descrive la valutazione in vitro di MSC immunomodulazione sulla proliferazione dei leucociti effettrici e sottopopolazioni specifiche.

Abstract

Le proprietà immunomodulatorie delle cellule staminali mesenchimali umane (MSC) multilineage sembrano essere molto rilevanti per l'uso clinico verso un'ampia gamma di malattie immuno-correlate. I meccanismi coinvolti sono sempre più chiariti e in questo articolo, descriviamo l'esperimento di base per valutare l'immunomodulazione delle MSC attraverso la soppressione della proliferazione leucocitaria effettrice. Rappresentando l'attivazione, la proliferazione leucocitaria può essere valutata con una serie di tecniche e in questo protocollo descriviamo l'uso del colorante cellulare fluorescente carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) per marcare i leucociti con successive analisi citofluorimetriche. Questa tecnica può non solo valutare la proliferazione senza radioattività, ma anche il numero di divisioni cellulari che si sono verificate, oltre a consentire l'identificazione della popolazione specifica di cellule proliferanti e l'espressione intracellulare di citochine/fattori. Inoltre, il test può essere personalizzato per valutare popolazioni specifiche di leucociti effettori mediante la selezione di marcatori di superficie di perline magnetiche di singole popolazioni di cellule mononucleate del sangue periferico prima della co-coltura con MSC. La flessibilità di questo test di co-coltura è utile per studiare le interazioni cellulari tra MSC e leucociti.

Introduzione

Le cellule staminali mesenchimali umane (MSC) sono progenitrici somatiche che possono differenziarsi in lignaggi mesodermiche parassiali di ossa, cartilagine e tessuto adiposo 1-4, così come ad alcuni lignaggi extramesodermal 5. In primo luogo isolato dal midollo osseo adulto, questi progenitori multilineage ora sono state trovate in numerosi tessuti 6-8 e, inaspettatamente, dimostrato di avere forti proprietà immunomodulanti che sembrano altamente suscettibili di applicazione clinica 9-12. Meccanismi dettagliati coinvolti negli effetti immunomodulatori sono attivamente indagati dell'effettiva applicazione in entità patologiche specifiche. Uno dei modi più semplici per valutare immunomodulazione è valutando per la soppressione di effettori leucociti proliferazione 13. La maggior parte dei leucociti effettrici quali T linfociti e monociti proliferano prodigiosamente quando stimolato o attivato. Funzione immunomodulante può essere valutata quando la soppressione diproliferazione è evidenziato.

Tradizionalmente, effettore leucociti proliferazione è stata valutata mediante rilevamento di [3 H] timidina nel DNA. Tuttavia, questo metodo ha svantaggi significativi a causa delle preoccupazioni di radiazioni e smaltimento post-utilizzo, così come il complesso attrezzature necessarie. Mentre ci sono saggi non radioattivi per valutare la proliferazione cellulare, l'estere carboxyfluorescein succinimidil (CFSE) test ha anche altri vantaggi come ad esempio consentendo l'identificazione delle popolazioni cellulari specifiche, il che è particolarmente utile in esperimenti di co-coltura di cellule che coinvolgono molteplici tipi. CFSE è un colorante cellulare fluorescente che può essere valutata mediante l'analisi di citometria di flusso. Come le cellule si dividono, l'intensità di questa etichetta cellulare diminuisce proporzionalmente; questo permette non solo la determinazione della proliferazione cellulare complessiva ma anche permette di valutare il numero di divisioni cellulari fino a 8 divisioni prima fluorescenza diventa difficile detect contro segnale di fondo. Inoltre, la stabilità della fluorescenza CFSE permette il monitoraggio in vivo di cellule marcate tali che le cellule possono essere visualizzati fino a molti mesi 14.

Questo test può anche essere variata per valutare specifici tipi di leucociti effettrici o la funzione immunomodulante di specifiche popolazioni di MSC indotta leucociti-come immunomodulatori l'interleuchina-10 (IL-10), la produzione di monociti CD14 + 15 eseguendo magnetico tallone selezione marcatore superficie popolazioni di cellule di interesse prima o dopo co-coltura a seconda dei casi. Il nostro protocollo descrive il saggio base di valutare gli effetti immunomodulatorie delle MSC sui leucociti effettrici (diagramma di flusso mostrato nella Figura 1) e una variazione su questo test base per la valutazione di MSC indotta immunomodulazione leucociti su allogeniche CD4 + effettrici linfociti T (diagramma di flusso mostrato in figura 4).

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Protocollo

Il consenso informato del paziente, come approvato dal comitato istituzionale di revisione deve essere ottenuto per l'uso di cellule umane.

1. Densità Isolamento gradiente di cellule periferiche mononucleari Sangue umano (PBMC)

  1. Aggiungere 25 ml di sangue intero eparinizzati in un tubo da 50 ml con una pipetta 25 ml.
    1. Diluire le cellule con 25 ml di PBS (PBS).
  2. Aggiungere 15 ml di gradiente di densità Ficoll-Paque in un nuovo tubo 50 ml, e mentre inclinando il tubo, molto lentamente e con attenzione aggiungono in 25 ml di sospensione cellulare diluita su gradiente di densità in modo che non vi è alcuna miscelazione del sangue intero con gradiente di densità, cioè., nessun disturbo dell'interfaccia gradiente di densità del sangue.
  3. Centrifugare la sospensione dal punto 1.2 a 400 g per 30 e 40 minuti in un rotore oscillante secchiello temperatura controllata senza freno a 20 ° C.
    Nota: Tre strati distinti dovrebbero essere evidenti dopo la centrifugazione: °e l'essere al plasma strato superiore; lo strato inferiore è chiaro gradiente di densità Ficoll-Paque; e uno strato cellulare sottile, centrale è il PBMCs
  4. Aspirare e scartare lo strato superiore per aspirazione con una pipetta Pasteur, con attenzione a non disturbare lo strato interfase delle cellule mononucleate (cioè, linfociti, monociti e piastrine).
  5. Raccogliere accuratamente questo strato di cellule mononucleate con una pipetta 10 ml in un tubo da centrifuga da 50 ml.
  6. Riempire il tubo con 20 ml di PBS, mescolare bene e centrifugare a 300 xg per 10 min a 20 ° C. Rimuovere il surnatante completamente dopo la centrifugazione.
  7. Risospendere il pellet cellulare in 20 ml di PBS e centrifugare a 200 xg per 10-15 minuti a 20 ° C. Rimuovere il surnatante completamente dopo la centrifugazione.
    Nota: Questo passaggio rimuove le piastrine-che sono indesiderate, all'interno delle PBMC; questo passaggio può essere ripetuto per assicurare la rimozione completa delle piastrine.
  8. Se nessuna selezione di popolazioni specifiche èdesiderato, pellet cellulare risospendere in leucociti terreno completo (10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di L-glutammina, e 1% di penicillina / streptomicina in terreno RPMI-1640) per la coltura, dopo l'esecuzione di un numero di cellule 16 di sospendere 1 ml di medio per 10 7 PBMC prima di procedere alla fase successiva.

2. magnetica Etichettatura dei leucociti popolazioni (passare alla Fase 4 se nessuna selezione di popolazioni specifiche è obbligatorio)

  1. Sospensione centrifugare PBMC a 300 × g per 10 minuti e aspirare il surnatante completamente.
  2. Pellet cellulare Risospendere in 80 ml ​​di PBS per 10 7 cellule totali.
  3. Aggiungere 20 ml di sfere magnetiche specifici (ad esempio, CD14 sfere magnetiche per l'isolamento dei monociti, CD4 sfere magnetiche per l'isolamento dei linfociti T) per 10 7 cellule totali.
  4. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 2 e 8 ° C in frigorifero.
  5. Aggiungere 1-2 ml di PBS per 10 7 cellule per lavare e centrifugarea 300 g per 10 min.
  6. Aspirare il surnatante e risospendere completamente fino a 10 8 cellule in 500 ml di PBS.

3. magnetica Selezione delle sottopopolazioni di leucociti

Nota: Una varietà di separatori perline magnetiche e le colonne sono disponibili per l'isolamento della specifica popolazione di leucociti da marcatore di superficie cellulare da un certo numero di produttori. L'isolamento può essere da una selezione positiva sulla base di uno o pochi marcatori positivi o selezione negativa dopo l'esaurimento delle popolazioni indesiderate. Un orientamento generale di eseguire selezione positiva utilizzando un marcatore (ad esempio, per i linfociti T CD4 helper, o CD14 per i monociti) è indicato di seguito.

  1. Preparare e separatore magnetico primo compresa colonna di separazione secondo le istruzioni del produttore.
  2. Applicare provetta contenente il campione di PBMC etichettati. Fornire due 15 ml provette per la raccolta dell 'ed unlabel etichettata positivamentefrazioni cellulari ndr, seguendo le istruzioni del produttore.
  3. Contare il numero di cellule 15 e sospendere nuovamente le leucociti selezionati positivamente (ad esempio, linfociti T CD4 + CD14 + o cellule) in leucociti terreno completo, utilizzando 1 ml di terreno per 10 7 cellule.

4. CFSE colorazione di leucociti per la valutazione di proliferazione

Nota: CFSE è stato ampiamente utilizzato in indagini immunologiche, sia in vivo e in vitro. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per lo studio in vitro di MSC / PBMC (o altri leucociti) interazioni. Mentre i passaggi generali coinvolti nella conduzione CFSE etichettatura in vitro sono simili, ci possono essere differenze di dosaggio specifica e la tempistica del protocollo 14. Ciò può essere dovuto a una serie di fattori, vale a dire, il tipo di cellula specifico utilizzato, il numero di cellule utilizzate-che possono probabilmente influenzare l'intensità del segnale fluorescente CFSE.

  1. Diluire la soluzione CFSE magazzino (10 mm) in PBS alla concentrazione di lavoro desiderata di 10 micron (soluzione CFSE-lavoro). Preparare 10 7 cellule (ad esempio, PBMC o cellule T) per l'etichettatura con la soluzione CFSE-lavoro.
  2. Centrifugare a 300 g per 10 minuti per ottenere un pellet di cellule e aspirare il surnatante.
  3. Risospendere delicatamente le cellule in 1 ml di soluzione di pre-riscaldato (37 ° C) CFSE-lavoro e incubare le cellule per 10 min a 37 ° C.
  4. Per lavare eccesso CFSE, diluire la sospensione cellulare con 10x (in volume) di preraffreddato (4 ° C) RPMI mezzo contenente 10% FBS. Sedimentare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Lavare il pellet di cellule in questo modo per altre due volte.
  5. Re-agglomerare le cellule per centrifugazione e contare il numero di cellule 15. Risospendere 10 7 cellule (sia PBMC o cellule T) in 1 ml di fresco leucociti preriscaldata terreno completo.

5. Co-coltura di MSC con leucociti e attivazione dei leucociti

  1. Pre-caldo MSC terreno completo (10% FBS (pretestati per una crescita ottimale MSC), 1% L-glutammina, 1% di penicillina e / streptomicina in terreno di glucosio DMEM-basso) a 37 ° C per non più di 30 min.
  2. MSC Seed a 50.000 cellule in 1 ml di MSC terreno completo in piastre da 24 pozzetti (densità MSC: 25.000 cellule / cm 2) per il fissaggio O / N in un incubatore a 37 °, consentendo alle cellule staminali di raggiungere l'80% di confluenza.
  3. Media Aspirare, e sulla base di numeri MSC teste di serie, aggiungere PBMC CFSE etichettati (precedentemente etichettata-consultare sopra protocollo punto 4) a MSC coltivati ​​(testa di serie il giorno precedente in piastre da 24 pozzetti) in 1 ml di leucociti terreno completo in un 01:10 (rapporto cellulare) Rapporto co-coltura delle cellule staminali mesenchimali per PBMC.
  4. Aggiungere il mitogeno fitoemoagglutinina (PHA), un non-specifico attivatore leucociti, ad una concentrazione finale di 10 ug / ml in un volume totale di 1 ml leucociti terreno completo per pozzetto.
    1. Alternatively, per stimolare l'attivazione dei linfociti T in particolare: utilizzare alfa-CD3 / 28 microsfere e aggiungere al due cellule co-coltura per ottenere un rapporto di linfociti da tallone a T di 1: 1.
  5. Per il controllo negativo, piatto 500.000 PBMC / bene (o di una specifica popolazione effettore leucocitaria; densità cellulare: 250.000 leucociti / cm 2) in un 24-pozzetti con 1 ml di leucociti solo terreno completo; per il controllo positivo, oltre alla placcatura lo stesso numero di PBMC / pozzetto, aggiungere PHA ad una concentrazione finale di 10 mg / ml.
  6. Al 3 ° e 5 ° giorno dell'esperimento co-coltura, valutare la proliferazione dei leucociti CFSE marcati (posto in tubi tondi-basso) mediante analisi di citometria di flusso 17 con 488 nm di eccitazione ed emissione di appositi filtri per fluoresceina.
    Nota: intracellulare colorazione citochine per citometria a flusso può essere eseguita anche a questi leucociti CFSE marcato a questo punto per valutare per i cambiamenti nel profilo di espressione dei leucociti citochine come modulated da MSC. Poiché CFSE viene valutata con un adeguato filtro per fluoresceina, gli anticorpi selezionati per valutare varie citochine devono essere coniugato con fluorocromi diversi fluoresceina o spettro simile (ad esempio, ficoeritrina, peridinina complesso proteico clorofilla (PerCP)).

6. Variazione: Effector Soppressione Assay magnetico Bead-selezionata, MSC-indotta immunomodulante leucociti attivati ​​su CFSE etichettati cellule effettrici CD4 + T

  1. MSC Seed a 250.000 cellule in 3 ml di MSC terreno completo a 6 pozzetti (densità MSC: 25.000 cellule / cm 2) per il fissaggio O / N in un incubatore a 37 °, consentendo alle cellule staminali di raggiungere l'80% di confluenza. Almeno 3 6 pozzetti sono necessari per garantire sufficiente di PBMC MSC-messi in coltura per la selezione sottopopolazione.
  2. Aspirare il terreno, e aggiungere PBMC separati secondo la Fase 1, ma in 6 pozzetti a 2,5 x 10 6 cellule / pozzetto (densità delle cellule: 250.000 leukocytes / cm 2) con 3 ml di terreno completo leucociti. Co-coltura per 48-72 ore in un incubatore a 37 °.
  3. Magnetic bead-seleziona specifica popolazione di leucociti immunomodulatori MSC-indotta (ad esempio, CD14 + cellule) come da Sezioni 2-3.
    Note: colorazione intracellulare di citochine per l'analisi citometrica possono essere eseguite a questo punto per valutare variazioni di leucociti citochine profilo di espressione, cioè, espressione di interleuchina-10 come modulati dal MSC.
  4. Add CFSE marcato allogeniche cellule T CD4 + generati secondo le sezioni 2-4 in piastre da 24 pozzetti in 1 ml di leucociti completa (densità delle cellule T: 250.000 cellule / cm 2) a medio leucociti MSC-indotta tallone-selezionato a vari rapporti , cioè, 1:10, 1: 5, 1: 2 e 1: 1 (cella per cella) rapporti.
  5. Per stimolare le cellule T CD4 +, aggiungere alfa-CD3 / 28 microsfere coniugati per ottenere un rapporto di tallone-cellula di 1: 1.
  6. Per un controllo negativo, piatto 500.000 cellule T CD4 + / bene in un (densità cellulare T: 250.000 cellule / cm 2) 24-pozzetti con 1 ml di leucociti solo terreno completo; per il controllo positivo, oltre alla placcatura lo stesso numero di cellule CD4 + T / pozzetto, aggiungere alfa-CD3 / 28 microsfere coniugate ad ottenere un rapporto da tallone a cella di 1: 1.
  7. Il giorno 3 ° di co-coltura, valutare la proliferazione di CFSE etichettati cellule T CD4 + (posti in tubi tondi fondo) per citometria a flusso di analisi 16 con 488 nm di eccitazione ed emissione di appositi filtri per fluoresceina.

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Risultati

Figura 1 denota lo schema generale dell'esperimento, e la figura 2 mostra l'aspetto delle diverse condizioni di coltura cellulare come visualizzato in contrasto di fase invertita microscopia. Le MSC sono cellule aderenti con fibroblastica, morfologia a forma di fuso, mentre PBMC e leucociti sono piccole cellule non aderenti rotonde. Questi due tipi di cellule morfologicamente differenti può essere visto chiaramente nella co-coltura. Al termine del test, quando le PBMC (o leuckotyes) vengono aspirati...

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Discussione

Sempre più spesso, le proprietà immunomodulatorie delle MSC vengono tradotte in uso clinico più rapidamente rispetto alla capacità multilineage di queste cellule staminali18-20. Pertanto, le tecniche di co-coltura di MSC con leucociti e i saggi per valutare la funzione immunitaria sono importanti per delineare ulteriormente i meccanismi specifici coinvolti in queste proprietà per ottimizzare un'efficace applicazione terapeutica.

Uno degli aspetti tecnici più critici per il successo...

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Dichiarazioni

Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni da NHRI (CS-104-PP-06 a B.L.Y.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare71-7167-00 AGDensità grandient per l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)Life TechnologiesV12883Etichetta cellulare per il rilevamento della divisione cellulare
Fitoagglutinina (PHA)SigmaL8902Attivazione di PBMC
umane Dynabeads Human T-Activator CD3/28Life Technologies111.32DAttivazione di linfociti T umani, ad es. CD4+ cellule T, CD8+ cellule T, ecc.
autoMACS&commercio; SeparatoreMiltenyi BiotecautoMACS™ SeparatoreSeparatore di celle a base magnetica
autoMACS® ColonneMiltenyi Biotec130-021-101colonne di separazione
CD14 microsfere, umano Miltenyi Biotec130-050-201Per la selezione positiva di CD14+ monociti e macrofagi da
microsfere CD4 PBMC, umano Miltenyi Biotec130-045-101Per la selezione positiva di linfociti T umani CD4+ da PBMC
RPMI 1640 MediumLife Technologies11875Terreno di coltura di PBMC/leucociti umani
DMEM, basso glucosio, piruvatoLife Technologies11885Terreno di coltura di cellule staminali mesenchimali umane (MSC)
L-glutamminaLife Technologies25030-081Integrazione per MSC medio completo
Penicillina/streptomicinaLife Technologies15070-063Integrazione per PBMC/leucociti e MSC medio completo
Siero fetale bovino (FBS)1) Hyclone, per coltura di MSC                                    2) Life Technologies, per tutte le altre cellule (ad es. PBMC, popolazioni specifiche di leucociti)1) SH30070.03M 2) 10091-148Lotti pre-test per il supporto di MSC in vitro Piastra per
coltura cellulare a 24 pozzettiCorningCOR3524Piastra di co-coltura
Provetta da centrifuga da 50 mlCorning430291Isolamento PBMC da sangue intero mediante Ficoll-Paque PLUS
Provetta da centrifuga da 15 ml...Corning430766Raccolta delle frazioni cellulari marcate e non marcate
Provette a fondo tondoBD Falcon352008Raccolta di cellule per analisi citofluorimetriche

Riferimenti

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