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Articolo metodologico

Ripetuto il prelievo di sangue per esami del sangue in Zebrafish adulti

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DOI:

10.3791/53272

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30 agosto 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Medical Science, Graduate School of Medicine, Mie University, 2Department of Molecular and Cellular Pharmacology, Pharmacogenomics, and Pharmacoinformatics, Graduate School of Medicine, Mie University

In questo articolo

Sommario

Il campionamento ripetuto del sangue è necessario e importante nella ricerca sugli animali. Abbiamo sviluppato un metodo innovativo, non letale e affidabile per la raccolta ripetuta del sangue da pesci zebra adulti e abbiamo applicato questo metodo allo studio della biochimica del sangue, compreso il metabolismo del glucosio.

Abstract

Raccolta del sangue ripetuta è una delle tecniche più comuni eseguiti su animali da laboratorio. Tuttavia, non è stato stabilito un protocollo non letale per la raccolta del sangue da zebrafish. I metodi precedenti per la raccolta del sangue da zebrafish sono letali, come incisione laterale, decapitazione e la coda di ablazione. Così abbiamo sviluppato un metodo di raccolta del sangue "ripetuto" romanzo, e qui presenti un protocollo dettagliata che illustra questa procedura. Questo metodo è minimamente invasiva e comporta un tasso di mortalità molto basso (2,3%) per zebrafish, consentendo campionamento ripetuto sangue dello stesso individuo. Il volume massimo di prelievo di sangue dipende dal peso corporeo del pesce. Il volume per ripetuti prelievi di sangue a intervalli dovrebbe essere ≤0.4% del peso corporeo ogni settimana o ≤1% ogni 2 settimane, che sono stati valutati da misurazioni di emoglobina nel sangue. Inoltre, l'emoglobina, glicemia a digiuno, trigliceridi del plasma (TG) e totale eclivelli holesterol in zebrafish adulti maschili e femminili sono stati misurati. Abbiamo applicato anche questo metodo per studiare la disregolazione del metabolismo del glucosio a obesità indotta dalla dieta. Questo metodo di raccolta del sangue consentirà numerose applicazioni, tra cui metabolismo glucidico e lipidico e gli studi ematologiche, che consentirà di aumentare l'uso di zebrafish come un modello di malattia umana organismo.

Introduzione

Zebrafish stanno guadagnando crescente popolarità come un modello valido di malattie umane perché i loro organi e genetica sono simili a quelli degli esseri umani 1,2. Nel campo della biologia dello sviluppo, molti studi hanno dimostrato che il pesce zebra e spettacolo umano contrassegnati somiglianza in ematopoiesi 3, emostasi 4,5, e mielopoiesi 6. Zebrafish adulti sono utilizzati anche per lo studio immunologico 7, 8 e le malattie neurodegenerative legate all'obesità 9 perché questo modello azioni organismo percorsi comuni con quelli perturbato in malattie umane. Per l'obesità e le malattie connesse con l'obesità (diabete, steatosi epatica non alcolica e e aterosclerosi steatoepatite), zebrafish glucosio nel sangue e livelli di lipidi sono state investigate esaurientemente in vari modelli transgenici obesità e dieta-indotta 10-13.

Ripetuto prelievo di sangue da singoli animali riduce il consumo animale e dicembrerease differenze interindividuali. Tuttavia, la raccolta dei campioni ripetuto è tecnicamente difficile in piccoli animali come zebrafish causa della loro relativamente piccolo volume di sangue e la mancanza di navi facilmente accessibili. Sono stati sviluppati diversi metodi per un tempo di raccolta del sangue da zebrafish, anche se questi metodi hanno i loro inconvenienti, tra cui letalità, danno tissutale associato e il volume di sangue limitata. Ad esempio, 1-5 microlitri di sangue può essere raccolto da un'incisione laterale di circa 0,3 cm di lunghezza nella regione della aorta dorsale 5. Decapitazione con le forbici tagliando attraverso la cintura pettorale può raccogliere 5-10 microlitri di sangue 10. Un altro comodo metodo di campionamento del sangue è la coda di ablazione 14. Puntura cardiaca è una potenziale metodo alternativo per la raccolta di sangue ripetuto da uno stesso pesce, ma la piccola quantità ottenuta (circa 50 nl) con questa procedura limita il numero di analisi che possono essere effetmed 11. Di conseguenza, è necessario un nuovo protocollo per consentire ripetuto prelievo di sangue non letale, che sarebbe un progresso critica necessaria per questo organismo sia un organismo modello standard per le malattie umane. Questa tecnica consentirebbe di testare risposta farmacologica, la scoperta di biomarcatori molecolari per la diagnosi, la determinazione della prognosi e il monitoraggio di varie malattie, come le malattie metaboliche, malattie degenerative e diversi tipi di tumori maligni.

Abbiamo quindi sviluppato un metodo minimamente invasivo per ottenere sangue da zebrafish in serie 15. Qui mostriamo la procedura visivamente e fornire un protocollo dettagliato per questa tecnica. Con questo metodo, il valore normale in base a vari parametri, tra cui l'emoglobina, glicemia a digiuno, e lipidi nel sangue di zebrafish adulti sani sono stati valutati. Inoltre, abbiamo anche valutato se questo metodo è adatto per gli studi che richiedono campioni di serie di mONITORAGGIO i cambiamenti temporali nei livelli di glucosio nel sangue durante gli esperimenti sovralimentazione.

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Protocollo

Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Università di Mie, e sono state eseguite secondo normativa giapponese benessere degli animali 'legge sul Welfare e la gestione degli animali' (Ministero dell'Ambiente del Giappone) e il rispetto delle linee guida internazionali.

1. Preparazione del Needle

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in anestesia, e sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze. Per l'eutanasia, i pesci sono stati immersi in un bagno di acqua e ghiaccio (5 parti ghiaccio / 1 parte di acqua a ≤4 ° C) per ≥20 min.

  1. Preparare aghi microcapillari vetro tirando un capillare di vetro 1,0 mm di diametro esterno, con un estrattore ago (Figura 1A).
  2. Tagliare le punte degli aghi obliquamente con le forbici sottili (Figura 1B). Il diametro della punta ideale dovrebbe essere di circa 100-200 micron (Figura 1C). Se la punta diameter è troppo stretta, il sangue non entrerà l'ago.
  3. Sciogliere eparina in soluzione salina ad una concentrazione di 5 mg / ml.
  4. Inserire un ago pretagliato alla fine boccaglio di un gruppo del tubo aspiratore e tenere il boccaglio in bocca, oppure collegare l'ago ad un erogatore lampadina. Immergere la punta dell'ago nella soluzione di eparina, e eparinizzare l'ago per aspirazione e soffia attraverso la soluzione (Figura 1D e 1E).
    Nota: Il gruppo del tubo di aspirazione è stato utilizzato per zebrafish crioconservazione degli spermatozoi 16. Lungo tubo di gomma in grado di fermare il sangue volare in bocca. Impostazione di un filtro nella metà del tubo può evitare i pericoli.
  5. Conservare gli aghi eparinizzati in una capsula di Petri di 10 cm e asciugare per almeno 1 ora. Un gran numero di aghi può essere preparata in anticipo.

2. Anestesia

  1. Preparare la soluzione di anestetico in un piccolo caso di plastica mescolando 200 ml di acqua pesce con 100 ml di 2-fenossietanolo (2-PE). Concentrazione finale del anestetici è 500 ppm.
    ATTENZIONE! 2-PE ha un effetto rapido.
  2. Rimuovere numero desiderato di pesce (ceppo AB) dal sistema di circolazione.
  3. Utilizzare una rete per trasferire i pesci nelle anestetici per 1-2 min (Figura 1F). Osservare il pesce gradualmente nuotare, diffondere le pinne pettorali orizzontalmente, rantolo, e hanno movimenti rapidi opercolo entro 1 min.
  4. Come il passare del tempo, osservare i pesci disteso sul fondo della cassa e finalmente smettere nuoto. Il piano di anestesia chirurgica raggiungerà quando il pesce si ferma a boccheggiare e movimenti opercolo sono lenti. A questo punto, il pesce è pronto per la raccolta di sangue.
  5. Utilizzando uno skimmer sollevare il pesce anestetizzato dal 2-PE e delicatamente appoggiarlo su un tovagliolo di carta imbevuto di anestetici (Figura 1G). Coprire la testa del pesce con la carta dei tessuti molli anche imbevuto con una soluzione 2-PE per prevenire la secchezza degli occhi e utilizzare un'altra carta velina morbido e asciutto per delicatamenteasciugare la superficie del corpo.

3. Il prelievo di sangue

  1. Mettere un ago eparinizzata alla fine revolver del gruppo del tubo aspiratore (o il distributore lampadina) e tenere l'estremità portavoce del gruppo del tubo di aspirazione in bocca.
  2. Afferrare l'estremità revolver e l'ago insieme, e rimuovere con attenzione le squame che interferiscono con la punta dell'ago. Inserire l'ago con un 30 - ° Angolo nel sito di raccolta del sangue 45. Evitare la puntura del tratto gastrointestinale (Figura 1 H). Nel caso di utilizzo di dispenser lampadina, premete la lampadina con pollice e il medio, e di bloccare il foro sulla punta del bulbo con il primo dito, poi inserire l'ago come descritto sopra.
    Nota: Il sito per la raccolta del sangue è lungo l'asse del corpo e posteriore all'ano nella regione dell'aorta dorsale. L'aorta dorsale (DA) e la vena posteriori cardinale (PCV) sono solo ventrale al dorso (Figura 2).
  3. Inizia a succhiare ilboccaglio estremità del gruppo del tubo di aspirazione quando l'ago è sentita toccare la colonna vertebrale. Se il sangue non aumenta, spostare la punta dell'ago sottilmente a mano per incoraggiare il flusso sanguigno. Si noti che una volta che il sangue è in aumento l'ago, interrompere immediatamente agitazione e succhiare delicatamente (Figura 1I). In caso di utilizzo di dispenser bulbo, rilasciare la pressione del bulbo per aspirare il sangue.
  4. Osservare il sangue aumentare lentamente l'ago in modo pulsatile senza aspirazione, che è probabilmente a causa della pressione arteriosa. Pertanto, non è necessario per aspirare se l'ago penetra correttamente l'arteria.
  5. Smettere di aspirazione dopo il volume appropriato di sangue viene raccolto. Rimuovere l'ago dal pesce e premere il sito di puntura utilizzando carta velina morbido per fermare le emorragie. Osservare la fermata sanguinamento dopo circa 10-20 secondi di pressione delle dita (Figura 1J).
  6. Dopo l'emorragia viene arrestata, trasferire immediatamente il pesce di nuovo ad un CLEun riscaldamento dell'acqua (~ 28 ° C) del serbatoio. Aiuta il pesce di recuperare rimestando delicatamente acqua verso le branchie fino a quando non comincia a nuotare.
    Nota: Mantenere fino a 5 postsampling pesci in una vasca 2 L e connessione del serbatoio al sistema di circolazione per ossigenare il pesce. L'aggiunta di antibiotici all'acqua pesce non è necessaria. Mantenere il pesce con custodia normale e l'alimentazione.
  7. Espellere il sangue dal dell'ago su una superficie pulita di un pezzo di parafilm (Figura 1K).
  8. Misurare la glicemia utilizzando qualsiasi glucometro portatile commerciale (Figura 1L).
    Nota: Il glucometro utilizza un glucosio-deidrogenasi flavina adenina dinucleotide elettrodo e richiede un volume del campione di 0,6 ml.
    1. Inserire una striscia reattiva completamente nello strumento e toccare direttamente la goccia di sangue. Osservare il prelievo di sangue nella striscia di test automatico e di ottenere il glucosio nel sangue risultato 5 secondi sul display. Registrare il risultato ed eliminare la striscia reattiva. Usa unnuova striscia reattiva per ogni misurazione.
  9. (passaggio facoltativo) Prendere quantità precise di sangue da un pipettaggio e trasferire il sangue in una provetta per ulteriori analisi (emoglobina, trigliceridi (TG), colesterolo totale, ecc.) Se necessario, diluire il sangue intero da un pesce con soluzione salina. Centrifugare i campioni di sangue per 3 min a 680 xg a temperatura ambiente e raccogliere il plasma. Trasferire il plasma in un nuovo tubo. A questo punto è pronto per essere utilizzato nelle analisi biochimiche.

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Risultati

Questo metodo di raccolta del sangue provoca lesioni minime di zebrafish (un <1 millimetro puntura; Figura 1J) e produce un tasso di mortalità molto basso del 2,3%. Abbiamo esaminato il volume massimo di sangue che potrebbero essere raccolti da un singolo pesce e valutato il rapporto al peso corporeo (Figura 3). Abbiamo trovato che il volume massimo sangue raccolto è linearmente correlata con il peso corporeo (R = 0,813). Il maggior volume di sangue raccolto da un singolo pesce (peso...

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Discussione

Vi presentiamo qui un protocollo dettagliato per l'ottenimento in serie sangue di zebrafish adulto. Questo metodo è semplice da effettuare e lo usiamo in laboratorio su base giornaliera. Questo metodo di raccolta del sangue si basa sull'inserimento di un capillare ago di vetro in aorta dorsale del pesce zebra. Durante questa procedura, è fondamentale stare attenti a non asportare la colonna vertebrale, perché è il criterio per la ricerca per l'aorta dorsale. Ridurre il lesioni alla colonna vertebrale miglior...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 e 25590073. Vorremmo ringraziare la signora Yui Namie per l'illustrazione disegnata a mano, e il signor Koshi Kataoka e la signora Sayuri Ichikawa per l'assistenza con la manutenzione del pesce zebra.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Capillari in vetro con filamentoNarishigeGD-1esterno 1,0 mm.
Estrattore per aghiNarishigePC-10Per produrre gli aghi
EparinaWako Pure Chemical Industries081-00136Per l'eparinizzazione
Assemblaggio del tubo dell'aspiratoreDrummond2-040-000Per la raccolta del sangue
Distributore di lampadineDrummond1-000-9000Per la raccolta del sangue
2-fenossietanoloWako Pure Chemical Industries163-12075Per l'anestetizzazione del pesce
DRI-CHEM3500VFujifilm-Perla misurazione dell'emoglobina
DRI-CHEM VetriniFujifilmHb-WIIPer la misurazione dell'emoglobina
Glutest Neo SuperSanwa Kagaku Kenkyusho-Perla misurazione del glucosio
corporeo Kit TG Wako di tipo LWako Pure Chemical Industries464-44201Per TG kit
CHO Wako tipo L WakoPure Chemical Industries460-44301Per la misurazione del colesterolo totale
Parafilm MAlcan ImballaggioPM996Per espellere il sangue
diametro

Riferimenti

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