Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane

Sommario

Forniamo una nuova strategia per isolare i compartimenti di replicazione virale (RC) dalle cellule umane infettate da adenovirus (Ad). Questo approccio rappresenta un sistema cell-free che può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari che regolano la replicazione e l'espressione del genoma virale, nonché la regolazione delle interazioni virali-ospite stabilite al RC.

Abstract

Durante l'infezione di cellule umane da adenovirus (Ad), il nucleo della cellula ospite viene drasticamente riorganizzato, portando alla formazione di microambienti nucleari attraverso il reclutamento di proteine virali e cellulari nei siti occupati dal genoma virale. Questi siti, chiamati compartimenti di replicazione (RC), possono essere considerati domini nucleari indotti da virus in cui il genoma virale è localizzato e vengono reclutate proteine virali e cellulari che partecipano alla replicazione, alla trascrizione e all'elaborazione post-trascrizionale. Inoltre, anche le proteine cellulari coinvolte nella risposta antivirale, come le proteine oncosoppressori, i componenti della risposta al danno al DNA (DDR) e i fattori di risposta immunitaria innata sono cooptati nella RC. Sebbene le RC sembrino svolgere un ruolo cruciale nel promuovere un ciclo di replicazione efficiente e produttivo, non è stata effettuata un'analisi dettagliata della loro composizione e delle attività associate. Per facilitare lo studio delle RC adenovirali e potenzialmente di quelle di altri virus a DNA che si replicano nel nucleo cellulare, abbiamo adattato una semplice procedura basata sui gradienti di velocità per isolare Ad RC e abbiamo stabilito un sistema cell-free in grado di condurre studi morfologici, funzionali e composizionali di queste strutture subnucleari indotte da virus, nonché di studiare il loro impatto sulle interazioni ospite-cellula.

Introduzione

Adenovirus contengono un genoma a doppio filamento di DNA che si replica nel nucleo della cellula infetta. Quando il DNA virale entra nel nucleo, localizza adiacente PML corpi nucleari ^1. A seguito di espressione genica virale precoce, l'architettura nucleare è drammaticamente riorganizzato, inducendo la formazione di microambienti virali, chiamato Compartimenti replicazione virale (RC) ^2. Dal adenovirus (Ad) RC sono i siti dove la replicazione virale e l'espressione del genoma di geni virali in ritardo si svolgono, forniscono un ambiente per l'assunzione di tutti i fattori virali e cellulari necessari che partecipano a questi proces....

Protocollo

1. HFF coltura cellulare e Ad-infezione

1. Propagare virus Ad5 WT in monostrati di cellule HEK-293 e titolo come fluorescenti unità formanti (FFU) sulle cellule HFF come descritto in precedenza ^8.
2. Crescere fibroblasti Foreskin umana (HFF) in 10 ml di DMEM / 10% siero fetale bovino (FBS) in sterile cultura 100 mm piatti a 37 ° C e 5% di CO ₂ in un incubatore umidificato. Determinare il numero di cellulare utilizzando una camera Neubauer contando cellule nei quattro set di 16 quadrati. Il numero di cellule per ml si ottiene calcolando il numero medio di cellule nei quattro set di 16 quadri e moltiplicando questo numero per ^1....

Risultati

Poiché compartimenti di replicazione virale (RC) sono strutture virale indotta subnucleari composte da proteine ​​e acidi nucleici, in modo simile ad altri domini nucleari, hanno dimostrato di essere suscettibili di isolamento dai gradienti di velocità basati su caratteristiche biochimiche. Passaggi critici nel protocollo di frazionamento sono illustrati nella Figura 1. Ad ogni passo i campioni devono essere monitorati mediante microscopia in campo chiaro per garantire l'integrità d.......

Discussione

Al fine di chiarire i meccanismi molecolari che governano la regolazione delle attività cellulari da parte dell'infezione virale, sarebbe fondamentale comprendere la composizione e le attività associate alla RC. Pertanto, per effettuare un'analisi dettagliata del RC, abbiamo stabilito un sistema cell-free che sfrutta le dimensioni e la composizione biochimica di queste strutture indotte da virus, per isolare frazioni subnucleari arricchite con RC utilizzando una semplice procedura che si basa su gradienti di velocità con.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Gibco	12100-046	Caldo in 37 º C bagnomaria prima dell'uso
Fetale Siero Bovino	Gibco	12484-028
Saccarosio, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Preparare una soluzione madre da 2,55 M e conservare a 4 º C
Schiacciante Omogeneizzatore	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Bagno ad ultrasuoni	Branson	Z769533  SIGMA	Accendere 15 minuti prima dell'uso.
Anticorpo secondario IgG1 anti-topo di capra, coniugato Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-21121	Utilizzo con diluizione 1:2.000 in vetrini PBS
Silane-Prep Sigma		S4651-72EA	Aperto in una cappa a flusso laminare
SuperSignal West Pico Substrato chemiluminescente	Pierce ThermoScientific	34080