Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane

Summary

Forniamo una nuova strategia per isolare i compartimenti di replicazione virale (RC) dalle cellule umane infettate da adenovirus (Ad). Questo approccio rappresenta un sistema cell-free che può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari che regolano la replicazione e l'espressione del genoma virale, nonché la regolazione delle interazioni virali-ospite stabilite al RC.

Abstract

Durante l'infezione di cellule umane da adenovirus (Ad), il nucleo della cellula ospite viene drasticamente riorganizzato, portando alla formazione di microambienti nucleari attraverso il reclutamento di proteine virali e cellulari nei siti occupati dal genoma virale. Questi siti, chiamati compartimenti di replicazione (RC), possono essere considerati domini nucleari indotti da virus in cui il genoma virale è localizzato e vengono reclutate proteine virali e cellulari che partecipano alla replicazione, alla trascrizione e all'elaborazione post-trascrizionale. Inoltre, anche le proteine cellulari coinvolte nella risposta antivirale, come le proteine oncosoppressori, i componenti della risposta al danno al DNA (DDR) e i fattori di risposta immunitaria innata sono cooptati nella RC. Sebbene le RC sembrino svolgere un ruolo cruciale nel promuovere un ciclo di replicazione efficiente e produttivo, non è stata effettuata un'analisi dettagliata della loro composizione e delle attività associate. Per facilitare lo studio delle RC adenovirali e potenzialmente di quelle di altri virus a DNA che si replicano nel nucleo cellulare, abbiamo adattato una semplice procedura basata sui gradienti di velocità per isolare Ad RC e abbiamo stabilito un sistema cell-free in grado di condurre studi morfologici, funzionali e composizionali di queste strutture subnucleari indotte da virus, nonché di studiare il loro impatto sulle interazioni ospite-cellula.

Introduction

Adenovirus contengono un genoma a doppio filamento di DNA che si replica nel nucleo della cellula infetta. Quando il DNA virale entra nel nucleo, localizza adiacente PML corpi nucleari ^1. A seguito di espressione genica virale precoce, l'architettura nucleare è drammaticamente riorganizzato, inducendo la formazione di microambienti virali, chiamato Compartimenti replicazione virale (RC) ^2. Dal adenovirus (Ad) RC sono i siti dove la replicazione virale e l'espressione del genoma di geni virali in ritardo si svolgono, forniscono un ambiente per l'assunzione di tutti i fattori virali e cellulari necessari che partecipano a questi processi. È interessante notare che una varietà di proteine ​​cellulari responsabili per la risposta antivirale cellulare, come risposta al danno del DNA, la risposta immunitaria innata e soppressione del tumore sono co-scelto di questi siti virali ^2. Mozzi normativi Quindi, Annuncio RC può essere considerato che promuovono la replicazione virale efficiente, in concomitanza regolazione delrisposta antivirale cellulare, indicando che queste strutture sono la chiave per la comprensione delle interazioni delle cellule virus-ospite. Tuttavia, i meccanismi molecolari della formazione di RC, la loro composizione e le attività connesse sono poco conosciute.

Adenovirale RC, nonché RC da altri virus DNA che si replicano nel nucleo non sono associati alle membrane, in contrasto con RC citoplasmatica ^3. Inoltre, queste strutture virus indotta sono suscettibili di essere composto interamente di proteine ​​e acidi nucleici. RC formata in cellule infettate con virus a RNA (di solito chiamato fabbriche virali) sono stati isolati, approfittando della loro localizzazione citoplasmatica e lo status di membrana, che ha facilitato il loro morfologica dettagliata, caratterizzazione funzionale e biochimico ^4.

A nostra conoscenza, RC virale nucleare non sono stati isolati, forse a causa della complessità dell'architettura nucleare e assenza di m intranucleariembranes che potrebbero agevolare il loro isolamento. Il loro studio si è basata invece su immunofluorescenza, FISH e microscopia elettronica a trasmissione. Tuttavia, nonostante le complicazioni inerenti a isolare strutture subnucleari, altri domini nucleari come nucleoli ed Enti Cajal sono stati isolati prima di ^5,6. Poiché nucleoli e RC sono entrambi composti di proteine ​​e acidi nucleici, e hanno un diametro compreso tra 0,5 - 5 micron, abbiamo ipotizzato che RC dovrebbe anche essere suscettibili di isolamento. Pertanto, al fine di caratterizzare più precisamente la composizione molecolare e funzioni associate RC, abbiamo stabilito un nuovo metodo per isolare frazioni subnucleari arricchite con telecomando. A tal fine, abbiamo preparato sub-nucleare frazioni utilizzando gradienti di velocità e cuscini saccarosio simili a procedure utilizzate per isolare nucleoli ⁷ o altri domini nucleari ⁶ e stabilito un sistema non cellulare che permette lo studio della composizione molecolare e le attività connesse diRC. Questa tecnica dovrebbe quindi avanzare la comprensione delle interazioni delle cellule virus e ospite e rappresenta un potente strumento che dovrebbe anche facilitare l'analisi dettagliata di RC da altri virus che si replicano nel nucleo e indurre la formazione di compartimenti replica di dimensioni simili a quelle costituite in adenovirus- cellule infettate, come, herpesvirus, papillomavirus o poliomavirus.

Protocol

1. HFF coltura cellulare e Ad-infezione

1. Propagare virus Ad5 WT in monostrati di cellule HEK-293 e titolo come fluorescenti unità formanti (FFU) sulle cellule HFF come descritto in precedenza ^8.
2. Crescere fibroblasti Foreskin umana (HFF) in 10 ml di DMEM / 10% siero fetale bovino (FBS) in sterile cultura 100 mm piatti a 37 ° C e 5% di CO ₂ in un incubatore umidificato. Determinare il numero di cellulare utilizzando una camera Neubauer contando cellule nei quattro set di 16 quadrati. Il numero di cellule per ml si ottiene calcolando il numero medio di cellule nei quattro set di 16 quadri e moltiplicando questo numero per ¹⁰ 4. Per ogni volta dopo l'infezione inclusa nella fase 1.3, utilizzare 1 x ¹⁰ 7 cellule HFF.
3. Mock-infettare o infettare le cellule HFF con il tipo di adenovirus 5 (AD5) wild-type (WT) (H5pg4100 ⁸⁾ a 100 mm piastre di coltura dei tessuti utilizzando 1 ml di Ad5 in DMEM al piatto con un MOI di 30 focus Forming Unit, o FFU , per cella. Incubare per 2 ore a ahumidified coltura cellulare incubatore a 37 ° C e 5% CO _2, dondolo accuratamente i piatti ogni 15 minuti per assicurare una distribuzione omogenea del virus inoculo sulle celle. Trascorso questo tempo, rimuovere il supporto e aggiungere DMEM fresco supplementato con 10% FBS e incubare per 16, 24 o 36 ore in un incubatore umidificato coltura cellulare a 37 ^° C e 5% CO _2. Passare al punto 2.1.

2. Preparazione di frazioni sub-nucleare arricchito con Adenovirus RC

1. Raccolto Ad5-infetti o cellule HFF mock-infettati con scrapper cellule e raccogliere le cellule in provette sterili. Determinare il numero di cellulare come al punto 1.2. Utilizzare 1 x ¹⁰ 7 cellule per ogni tempo di post-infezione specificato al punto 1.3.
2. Centrifugare le cellule a 220 xg, 4 ° C per 5 min.
3. Risospendere il pellet di cellule in PBS freddo (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO ₄ e 1,8 mm KH ₂ PO _4). Pellet Washs 3 volte utilizzando 5 ml di PBS ghiacciato a lavaggio. A tal fine, centrifugare le cellule a 220 xg, 4 ° C per 5 minuti, decantare e scartare il surnatante (SN), e risospendere il pellet cellulare delicatamente pipettando.
4. Per interrompere la membrana plasmatica, risospendere il pellet cellulare in 700 μ l di tampone ipotonico ghiacciata (10 mM HEPES pH 7.9, KCl 10 mM, MgCl _1,5 mm 2, DTT 0,5 mM, 20 μ g / ml phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) , una miscela di cisteina, serina, treonina e inibitori della proteasi aspartil compresi 10 μ g / ml inibitore della tripsina pancreatica bovina, 10 μ g / ml pepstatina A e 10 μ g / ml N-acetil-L-leucil-L-leucil-L -argininal) e lasciare che le cellule si gonfiano in ghiaccio per 3 ore.
5. Lyse le cellule utilizzando un omogeneizzatore con larghi Un pestello tipo teflon. Eseguire 80 Dounce ictus e campioni di monitoraggio ogni 20 colpi, mediante microscopia a campo chiaro per garantire che tutte le cellule sono state lisato, ma che i nuclei hanno not stato danneggiato o rotto.
6. Centrifugare l'omogeneizzato cellulare a 300 xg, 4 ° C per 5 minuti. Conservare il SN come frazione citoplasmatica a -20 ° C in una provetta da centrifuga.
7. Per rimuovere i detriti cellulari dai nuclei, risospendere il pellet in 750 μ l di soluzione 1 (S1) (0,25 M di saccarosio, 10 mM MgCl ₂ 20 mcg / ml PMSF, una miscela di cisteina, serina, inibitori treonina e aspartil proteasi di cui 10 μ g / ml inibitore della tripsina pancreatica bovina, 10 μ g / ml pepstatina A e 10 μ g / ml N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-argininal) e strato sopra un volume uguale di soluzione 2 (S2) (0,35 M di saccarosio, 0,5 mM MgCl _2, 20 μ g / ml PMSF, una miscela di cisteina, serina, inibitori treonina e aspartil proteasi di cui 10 μ g / ml inibitore della tripsina pancreatica bovina, 10 μ g / ml pepstatina A e 10 μ g / ml N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-argininal). Centrifuge a 1.400 xg, 4 ° C per 5 minuti.
8. Eliminare il SN con una micropipetta. Evitare di disturbare il pellet.
9. Risospendere il pellet contenente nuclei isolati in 750 μ l di S2.
10. Per isolare le frazioni subnucleari arricchiti con adenovirus RC (RCF), ultrasuoni risospeso nuclei con un bagno ad ultrasuoni, per mezzo di due 5 min impulsi, o fino a quando tutti i nuclei vengono lisati come osservato in microscopia in campo chiaro. Utilizzare ghiaccio in bagno a ultrasuoni come necessario per mantenere i campioni pari o inferiore a 4 ° C.
11. Strato nuclei sonicati su un volume uguale di soluzione di 3 (S3) (0,88 M di saccarosio, 0,5 mM MgCl ₂₎ e centrifugare a 3000 xg, a 4 ° C per 10 min. Conservare il surnatante 1,5 ml come frazione nucleoplasmic (NPL) a -70 ° C. Risospendere il pellet in 700 μ l di S2 e negozio come RCF a -70 ° C.

3. Western Blot analisi di RCF

NOTA: Per l'analisi Western Blot NPL e RCF frazioni set oltre 640 μ l per Npl e 300 μ l per RCF dal volume totale ottenuto al punto 2.11.

1. Mescolare 15 μ l di ogni frazione subnucleare in 2x tampone Laemmli (4% SDS, 20% glicerolo, 10% 2-mercaptoetanolo, 0,004% blu di bromofenolo, 0,125 M Tris HCl pH 6.8) e far bollire a 95 ° C per 5 min. Caricare i campioni in un elettroforesi 10% di sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel (SDS-PAGE) e gel proteine ​​separati denaturazione per 1,5 ore, a 20 milliampere (mA).
2. Trasferimento proteine ​​da elettroblotting per 1,5 ore a 400 mA su di polivinile (PVDF) membrane.
3. Bloccare membrana per 2 ore a temperatura ambiente usando latte in polvere 3% senza grassi in PBS.
4. Incubare O / N a 4 ° C con anticorpo primario contro E2A DNA-binding proteina virale (B6-8 ⁹⁾ ad una diluizione 1: 500 in latte in polvere PBS / 0,3% senza grassi.
5. Membrana Lavare 3 volte con PBS / Tween 20 0,1% per 10 min.
6. Incubare la membrana con topo anti IgG un secondariotibody accoppiato alla perossidasi di rafano (HRP) ad una diluizione 1: 10.000 in PBS per 2 ore a temperatura ambiente.
7. Lavare la membrana 3 volte con PBS / Tween 20 0,1% per 10 min.
8. Sviluppare la membrana utilizzando chemiluminescenza e pellicole radiografiche.

4. virale rilevamento del DNA a RCF

NOTA: per l'isolamento del DNA da entrambe le frazioni Npl e RCF, utilizzare 210 μ l per Npl e 100 μ l per RCF del volume totale ottenuto nel passaggio 2.11.

1. Incubare frazioni sub-nucleari per 1 ora a 55 ° C con 1 mg / ml di proteinasi K e 0,5% Tween 20.
2. Inattivare proteinasi K incubando i campioni per 10 min a 95 ° C.
3. Centrifugare i campioni a 20.000 xg, a temperatura ambiente per 2 min.
4. Raccogliere la SN. Precipitare il DNA con 1/10 volume di 3M acetato di sodio e un volume di isopropanolo, O / N a 4 ° C.
5. Centrifugare i campioni a 20.000 xg, a temperatura ambiente per 10 min.
6. Gettare la u SNcantare una micropipetta. Lavare il pellet con 70% etanolo e centrifugare a 20.000 xg, a 4 ° C per 5 min.
7. Risospendere il DNA in 10 μ l di 10 mM Tris-HCl pH 7.4
8. Quantificare DNA utilizzando uno spettrofotometro misurando la densità ottica (OD) a 260 nm.
9. Per amplificare DNA virale, utilizzare 100 ng di DNA da ogni frazione subnucleare in una reazione standard di PCR utilizzando DNA polimerasi Taq in 25 μ l di volume di reazione con primers che permettono l'amplificazione di una regione all'interno del maggiore unità Dopo la trascrizione, dal nucleotide 7273 al nucleotide 7353 (81 pb) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Ap: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Utilizzare le seguenti condizioni ciclo: denaturazione iniziale per 3 min a 95 ° C, seguiti da 20 cicli di amplificazione (1 min a 95 ° C, ricottura per 1 min a 62 ° C ed estensione per 30 sec a 72 ° C) e una fase di estensione finale per 3 min a 72 ° C.
10. Eseguire il prodotto di PCR in 2% gel di agarosio, a 90 V. Macchia con etidiobromuro a 0,5 μ g / ml concentrazione finale e visualizzare il DNA per corroborare l'arricchimento del DNA virale nel RCF. Maneggiare il bromuro di etidio con estrema cautela e assicurarsi sempre di indossare i guanti, come questo composto è un potente mutageno. Smaltire bromuro di etidio secondo le linee guida istituzionali.

5. Fine virale mRNA rilevamento in RCF

NOTA: Per l'RNA isolamento da entrambe le frazioni Npl e RCF, utilizzare 640 μ l per Npl e 300 μ l per RCF dal volume totale ottenuto al punto 2.11.

1. Isolare RNA da frazioni subnucleari utilizzando Trizol accordo con le istruzioni del produttore. Risospendere l'RNA a 50 μ l di DEPC (diethilpyrocarbonate) acqua -treated.
2. Quantificare l'RNA utilizzando uno spettrofotometro per misurare la densità ottica a 260 nm (circa 3 μ g si ottengono). Conservare l'RNA a 50 ng / μ l aliquote a -70 ° C.
3. Controllare RNA purificatoper l'assenza di contaminazione DNA eseguendo un controllo di reazione PCR in assenza di trascrittasi inversa (RT), utilizzando 5 ng di RNA totale e le condizioni del ciclo descritto al punto 4.9.
   1. Se la contaminazione del DNA è assente non amplicone dovrebbe essere prodotto. Se la contaminazione del DNA è presente, incubare i campioni con 10 U DNasi I, 10 U di RNasi inibitore, 0,1 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M KCl e 15 mM MgCl ₂ per 30 minuti a 37 ° C. Procedere alla ri-isolare l'RNA come al punto 5.1.
4. Per analizzare mRNA virale associato alla RCF, amplificare i 100 ng di RNA da ogni frazione subnucleare mediante RT-PCR utilizzando primer disegnati per rilevare adenovirale mRNA tardi da diverse famiglie di geni (Tabella 1).
   1. Per la trascrizione inversa (RT), utilizzare 100 ng di RNA, da ogni frazione subnucleare in una reazione standard di RT utilizzando M-MuLV RT enzima in 20 μ l di volume di reazione per 1 ora a 42 ° C e 10 min a 70 ° C.
   2. Per l'amplificazione, usare 1μ l di cDNA in reazioni di PCR, come al punto 4.9. Utilizzare le seguenti condizioni del ciclo: denaturazione iniziale per 3 minuti a 95 ° C, seguita da 25 cicli di amplificazione (1 min a 95 ° C, ricottura per 1 min alla temperatura indicata nella tabella 1 e l'estensione per 30 sec a 72 ° C) e una passo estensione finale per 3 minuti a 72 ° C.
5. Eseguire i prodotti di RT-PCR in 2% gel di agarosio, a 90 V. gel macchia con etidio bromuro a 0,5 μ g / ml concentrazione finale e visualizzare per corroborare virale tardi mRNA associazione al RCF. Maneggiare il bromuro di etidio come indicato al punto 4.10.

6. immunofluorescenza Visualizzazione di RCF

NOTA: Carry-questa procedura sotto una cappa a flusso laminare per evitare la contaminazione dei campioni con le particelle di polvere, e filtrare tutte le soluzioni prima dell'uso.

1. Spot 5 μ l della frazione RCF ottenuto nel passaggio 2.10 terribilectly su un vetrino rivestito silano.
2. Lasciate che la macchia asciugare per circa 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Reidratare lentamente e indirettamente pipettaggio 500 μ l di PBS in una goccia accanto al posto RCF e lasciando fluire inclinando il vetrino. Scaricare l'eccesso di PBS dal lato.
4. Block coprendo il campione con 500 μ l di PBS / 5% di albumina sierica bovina (BSA) per 2 ore a temperatura ambiente.
5. Lavare il vetrino 3 volte da delicatamente e indirettamente pipettando 500 l μ di PBS sul campione. Inclinare il vetrino per drenare l'eccesso di PBS.
6. Incubare il campione con l'anticorpo primario contro E2A virale DNA-binding protein (B6-8 ⁹⁾ ad una diluizione 1: 500 in PBS per 2 ore a temperatura ambiente. Coprire il campione macchiato con 20 μ l di soluzione di anticorpo e incubare in una camera umida per evitare l'essiccamento.
7. Lavare il campione 3 volte con PBS / 0,02% di Tween 20 da delicatamente e indirettamente pipettando 500 μ l di PBS sul campione. Inclinare il vetrino per scaricare l'exsoluzione di lavaggio processo.
8. Incubare i campioni con topo anti IgG anticorpo secondario accoppiato ad un fluoroforo che viene eccitato a 488 nm in una diluizione 1: 2000 in PBS, per 1 ora a 4 ° C. Coprire il campione macchiato con 20 μ l di soluzione di anticorpo e incubare in una camera umida per evitare l'essiccamento.
9. Lavare il campione 3 volte con PBS / 0,02% di Tween 20 da delicatamente e indirettamente pipettando 500 μ l di PBS sul campione. Inclinare il vetrino per lo scarico della soluzione di lavaggio in eccesso.
10. Coprire il campione individuato sul vetrino con un coprioggetto utilizzando 2 μ l PBS / 10% di glicerolo come mezzo di montaggio. Sigillare con smalto trasparente e conservare al -20 ºC.
11. Analizzare i campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza, con un obiettivo 63x e 1.4 Aperture numerico (NA) alla lunghezza d'onda di 488 nm.

Results

Poiché compartimenti di replicazione virale (RC) sono strutture virale indotta subnucleari composte da proteine ​​e acidi nucleici, in modo simile ad altri domini nucleari, hanno dimostrato di essere suscettibili di isolamento dai gradienti di velocità basati su caratteristiche biochimiche. Passaggi critici nel protocollo di frazionamento sono illustrati nella Figura 1. Ad ogni passo i campioni devono essere monitorati mediante microscopia in campo chiaro per garantire l'integrità delle...

Discussion

Al fine di chiarire i meccanismi molecolari che governano la regolazione delle attività cellulari da parte dell'infezione virale, sarebbe fondamentale comprendere la composizione e le attività associate alla RC. Pertanto, per effettuare un'analisi dettagliata del RC, abbiamo stabilito un sistema cell-free che sfrutta le dimensioni e la composizione biochimica di queste strutture indotte da virus, per isolare frazioni subnucleari arricchite con RC utilizzando una semplice procedura che si basa su gradienti di velocità con...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	Caldo in 37 º C bagnomaria prima dell'uso
Fetale Siero Bovino	Gibco	12484-028
Saccarosio, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Preparare una soluzione madre da 2,55 M e conservare a 4 º C
Schiacciante Omogeneizzatore	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Bagno ad ultrasuoni	Branson	Z769533  SIGMA	Accendere 15 minuti prima dell'uso.
Anticorpo secondario IgG1 anti-topo di capra, coniugato Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-21121	Utilizzo con diluizione 1:2.000 in vetrini PBS
Silane-Prep Sigma		S4651-72EA	Aperto in una cappa a flusso laminare
SuperSignal West Pico Substrato chemiluminescente	Pierce ThermoScientific	34080