Qui proponiamo una strategia per studiare l'effetto di un fattore di trascrizione di interesse sul trascrittoma del microRNA utilizzando dati pubblicamente disponibili, risorse computazionali e dati ad alto rendimento da array di microRNA dopo aver trasfettato cellule con una piccola forcina (sh)RNA mirata a un fattore di trascrizione di interesse.
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Articolo metodologico
Descrivendo un regolamento Dipendente Fattore di trascrizione del MicroRNA trascrittoma
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mentre la regolazione della trascrizione dei geni codificanti proteine è stato ampiamente studiato, poco si sa su come fattori di trascrizione sono coinvolti nella trascrizione di RNA non codificanti, in particolare dei microRNA. Qui, proponiamo una strategia per studiare il ruolo potenziale del fattore di trascrizione nella regolazione della trascrizione dei microRNA utilizzando i dati pubblicamente disponibili, risorse di calcolo e di dati ad alta produttività. Usiamo il H3K4me3 firma epigenetica per identificare i promotori di microRNA e immunoprecipitazione della cromatina (chip) di dati -sequencing dal progetto ENCODE per identificare i promotori microRNA che si arricchiscono con siti di legame fattore di trascrizione. Transfettando cellule di interesse con shRNA mira un fattore di trascrizione di interesse e sottoporre le cellule a matrice microRNA, si studia l'effetto di questo fattore di trascrizione sul trascrittoma microRNA. A titolo di esempio illustrativo usiamo il nostro studio sull'effetto di STAT3 sul trascrittoma microRNA di mente croniciLeucemia mphocytic (CLL) cellule.
Introduzione
I microRNA sono endogeni piccoli RNA non codificanti normativi che di solito funzionano come regolatori negativi di espressione dell'mRNA a livello post-trascrizionale. Circa 1000 non codificante 20 a 25 nucleotidi lunghe microRNA si trovano nel genoma umano 1,2. I microRNA regolano l'espressione genica attraverso l'accoppiamento di base canonica tra la sequenza seme del microRNA e il suo complementare sequenza partita seme, che è comunemente trova in regione 3 'non tradotta (UTR) del mRNA bersaglio. Collettivamente, microRNA regolano oltre il 30% dei geni codificanti proteine 3, ma solo poco si sa circa la trascrizione dal DNA....
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Protocollo
1. Identificare fattore di trascrizione siti di legame nel promotore di geni microRNA Utilizzando Approach Data Mining
- Utilizzare il browser genoma Università della California a Santa Cruz (UCSC) per estrarre cromatina immunoprecipitazione dati (chip) di sequenziamento generati come parte della Encyclopedia of DNA elemento del progetto (ENCODE).
- Aprire il browser tavolo nel browser genoma UCSC.
- Utilizzare le seguenti specifiche per estrarre la tabella: Clade: (mammiferi), genoma: (umano), Montaggio: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), gruppo: (regolamento), brano (TxnFactorChIP), tabella: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), regione : (Genoma), il forma....
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Risultati
STAT3 è un fattore di trascrizione che induce tipicamente la trascrizione di geni che sono anti apoptotico ed effetti proliferativi 12. Sia STAT3 riguardano anche la non codificante RNA trascrittoma è attualmente sconosciuto. In tutte le cellule CLL STAT3 è costitutivamente fosforilata in serina 707 residui 10,13. Fosfoserina STAT3 navette per il nucleo, si lega al DNA, e attiva i geni noti per essere attivato da tirosina pSTAT3 in altri tipi di cellule 10.
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Discussione
Il meccanismo alla base della RNA polimerasi II trascrizione dipendente dei geni codificanti proteine è stata ampiamente studiata. Mentre questi elementi costituiscono solo l'1% - 2% del genoma umano, la prova del progetto ENCODE suggeriscono che oltre l'80% del genoma umano può subire trascrizione 17 e quello che regola la trascrizione degli elementi di DNA non codificanti rimane in gran parte sconosciuta 6 .
Diversi studi, che ha indicato che Pol II è anche .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione della Fondazione Global Research LLC. L'Università del Texas MD Anderson Cancer Center è supportato in parte dal National Institutes of Health attraverso un Cancer Center Support Grant (P30CA16672).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0,45 &; m filtro per siringa | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Dispositivo filtrante ultracentrifugo Amicon con soglia di 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| Reagente TRIzol | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Linea cellulare umana | Sigma-Aldrich | 85120602 |
Riferimenti
- Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
- Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
- Bar....
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Ristampe e permessi
