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Articolo metodologico

Descrivendo un regolamento Dipendente Fattore di trascrizione del MicroRNA trascrittoma

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DOI:

10.3791/53300

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15 giugno 2016

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1Division of Hematology, Davidoff Cancer Center, Rabin Medical Center, 2The Center of Nanoscience and Nanotechnology, Tel Aviv University, 3Experimental Therapeutics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In questo articolo

Sommario

Qui proponiamo una strategia per studiare l'effetto di un fattore di trascrizione di interesse sul trascrittoma del microRNA utilizzando dati pubblicamente disponibili, risorse computazionali e dati ad alto rendimento da array di microRNA dopo aver trasfettato cellule con una piccola forcina (sh)RNA mirata a un fattore di trascrizione di interesse.

Abstract

Mentre la regolazione della trascrizione dei geni codificanti proteine ​​è stato ampiamente studiato, poco si sa su come fattori di trascrizione sono coinvolti nella trascrizione di RNA non codificanti, in particolare dei microRNA. Qui, proponiamo una strategia per studiare il ruolo potenziale del fattore di trascrizione nella regolazione della trascrizione dei microRNA utilizzando i dati pubblicamente disponibili, risorse di calcolo e di dati ad alta produttività. Usiamo il H3K4me3 firma epigenetica per identificare i promotori di microRNA e immunoprecipitazione della cromatina (chip) di dati -sequencing dal progetto ENCODE per identificare i promotori microRNA che si arricchiscono con siti di legame fattore di trascrizione. Transfettando cellule di interesse con shRNA mira un fattore di trascrizione di interesse e sottoporre le cellule a matrice microRNA, si studia l'effetto di questo fattore di trascrizione sul trascrittoma microRNA. A titolo di esempio illustrativo usiamo il nostro studio sull'effetto di STAT3 sul trascrittoma microRNA di mente croniciLeucemia mphocytic (CLL) cellule.

Introduzione

I microRNA sono endogeni piccoli RNA non codificanti normativi che di solito funzionano come regolatori negativi di espressione dell'mRNA a livello post-trascrizionale. Circa 1000 non codificante 20 a 25 nucleotidi lunghe microRNA si trovano nel genoma umano 1,2. I microRNA regolano l'espressione genica attraverso l'accoppiamento di base canonica tra la sequenza seme del microRNA e il suo complementare sequenza partita seme, che è comunemente trova in regione 3 'non tradotta (UTR) del mRNA bersaglio. Collettivamente, microRNA regolano oltre il 30% dei geni codificanti proteine ​​3, ma solo poco si sa circa la trascrizione dal DNA dei microRNA. È stato suggerito che la regolazione dei microRNA trascrizione è simile a quella di mRNA 4,5. In particolare, simile alla sua attività di promozione trascrizione dei geni codificanti proteine, fattori di trascrizione sono pensati per attivare la trascrizione dei microRNA 6. Fattore di trascrizione-microRNA gioco è stato segnalato come un fattore di modulazione dell'espressione genica 7, e può anche formare feed-back e feed-forward loop. Ad esempio, Yamakuchi et al. Riportato un anello di retroazione in cui p53 induce l'espressione di microRNA34a, che a sua volta inibisce traduzione della SIRT p53 repressore e aumentando così l'attività p53 8.

Considerando che sono stati riportati esempi specifici di fattore di trascrizione espressione dei microRNA dipendente, un metodo accettato che fornisce informazioni su come un fattore di trascrizione di interesse regola l'espressione del microRNA-trascrittoma è carente. Lo scopo del protocollo suggerito qui è quello di fornire una descrizione approfondita della trascrizione Regolazione fattore-dipendente del microRNA-transcriptome. Combinando i dati pubblicamente disponibili, strumenti di bioinformatica e utilizzando la tecnologia microarray, i ricercatori che seguono questo algoritmo sarebbe in grado di catturare su scala genomica come qualsiasifattore di trascrizione in qualsiasi tipo di cellula di interesse regola l'espressione del microRNA-trascrittoma e per esplorare un contributo putativo del fattore di trascrizione-mRNA nella regolazione dell'espressione di microRNA.

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Protocollo

1. Identificare fattore di trascrizione siti di legame nel promotore di geni microRNA Utilizzando Approach Data Mining

  1. Utilizzare il browser genoma Università della California a Santa Cruz (UCSC) per estrarre cromatina immunoprecipitazione dati (chip) di sequenziamento generati come parte della Encyclopedia of DNA elemento del progetto (ENCODE).
    1. Aprire il browser tavolo nel browser genoma UCSC.
    2. Utilizzare le seguenti specifiche per estrarre la tabella: Clade: (mammiferi), genoma: (umano), Montaggio: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), gruppo: (regolamento), brano (TxnFactorChIP), tabella: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), regione : (Genoma), il formato di output (tutti i geni da tabella selezionata).
    3. Salvare l'output da 1.1.2 come un file .txt e in un foglio elettronico.
    4. Ordinamento e filtro per il fattore di trascrizione di interesse (ad esempio, STAT2).
  2. Utilizzare l'elenco dei promotori microRNA basate su H3K4me3 epigenetica firma disponibile presso Baeer et al. 9 . Copia questo elenco in un file .txt.
  3. Per abbinare secondo coordinate sul genoma umano, mappare i dati da 1.1 e 1.2 (ad esempio, vincolante STAT3 su promotori microRNA putativi) e determinare il legame mediana affinità con il codice scritto in C diesis come indicato nel supplementare di file 1 codifica.

2. Utilizzare shRNA di down-regolare l'espressione di un fattore di trascrizione di interesse

  1. Piastra 1,5 x 10 6 cellule provenienti da 293 linea di cellule renali di embrioni umani a 10 cm piastra a circa il 50% di confluenza (DMEM con 10% FBS).
  2. cellule trasfezione da 293 linea di cellule renali embrionali umane con 5 mg di verde lentivirus proteina fluorescente (GFP) contenente shRNA diretti al fattore di trascrizione di interesse e con 5 mg di vettori di confezionamento con il reagente di trasfezione per cellule aderenti secondo il protocollo del produttore.
  3. Come controllo, trasfezione le cellule a partire da 293 linea di cellule renali embrionali umane constrapazzate shRNA ei vettori imballaggio secondo il protocollo del produttore.
  4. Mantenere mix trasfezione su cellule per 16 ore (a 37 ° C, CO 2 incubatore), poi cambiare supporto a 10 ml fresca 10% DMEM media con 10% FBS.
  5. Attendere 48 ore dopo la trasfezione, centrifugare la coltura cellulare (300 xg, 5 min) e raccogliere il surnatante infettive. Filtrare il surnatante con un filtro a siringa da 0,45 micron (25-mm tensioattivo libero di cellulosa membrana in acetato) per rimuovere eventuali cellule galleggianti.
  6. Concentrare il surnatante e raccogliere il lentivirus utilizzando un dispositivo di filtro ultracentrifugo con soglia di 100 kDa. Spin a 950 xg per 30 - 60 min fino a quando il volume è stato concentrato a meno di 250 microlitri. Conservare il virus concentrato a -80 ° C.
  7. Trasfezione delle cellule con il lentivirus. Rimuovere lentivirus congelate da -80 ° C freezer e scongelare a temperatura ambiente. Trasferire 100 ml di surnatante virale per un fresco 1,5 ml provetta da microcentrifuga.
    1. Bring il volume nel tubo di 1 ml con ridotta mezzo siero. Aggiungere hexadimethrine bromuro di 1 ml di sospensione di virus per la concentrazione finale di 10 ng / ml, mescolare delicatamente e lasciare riposare l'impasto per 5 min.
  8. Centrifugare 5 x 10 6 cellule per la trasduzione e delicatamente risospendere il pellet cellulare in 0,5 ml di supporti contenenti virus. Lasciare le cellule rimangono nell'incubatrice: 4 - 24 ore, quindi aggiungere 0,5 ml di terreno con 20% FBS ad una concentrazione finale del 10% FBS.
  9. Attendere 48 a 72 ore e macchiare le cellule con ioduro di propidio (PI) e la proteina fluorescente verde (GFP) in base alle istruzioni del produttore. Proteggere le cellule dalla luce e usare un sorter FACS per misurare i tassi di GFP + / PI - cellule. Dal momento che le macchie PI solo cellule morte, questo tasso è una stima di efficienza di trasfezione nelle cellule viventi.
  10. Ordina la popolazione di cellule positive per l'espressione della GFP (GFP +) da FACS sorter come descritto in precedenza 10.
  11. Usa Western blotting immunitario come precedentemente descritto 10 per determinare i livelli di un fattore di trascrizione di interesse prima e dopo infettare le cellule di interesse (per esempio, cellule CLL) con designato shRNA.

3. Determinare il livello di espressione dei microRNA trascrittoma in cellule trasfettate con Fattore di trascrizione-shRNA

  1. Isolare RNA utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore.
  2. Etichettare il RNA e ibridare al microRNA microarray 11.
  3. Determinare il microRNA differenzialmente espressi in cellule trasfettate con fattore di trascrizione-shRNA o con comandi vuoto vettore 5.
  4. Convalidare i risultati di microarray per i microRNA più differenzialmente espressi nel formato Real-time PCR 5.

4. Determinare la sovrapposizione tra la bioinformatica e l'approccio shRNA nel descrivere il trascrittoma Dependent fattore di trascrizione

  1. per detErmellino i rapporti attesi e osservati di geni microRNA che ospitano fattore di trascrizione siti nel loro promotori vincolanti e sono stati inibiti nella trascrizione fattore-shRNA cellule trasfettate, effettuare le seguenti operazioni:
    1. Ottenere il rapporto di geni che ospitano il fattore di trascrizione di interesse per il loro promoter / microRNA totale dalla lista generata in 1.3. Questo elenco è il rapporto atteso (ad esempio, i geni microRNA con siti di legame STAT3 / totale geni microRNA testati = 0.25).
    2. Determinare il numero di geni che sono stati diminuito l'in cellule trasfettate fattore di trascrizione-shRNA dalla lista generata in 3.3 ed è fattore di trascrizione del legame di interesse siti dalla lista generata in 1.3. Questo / Numero totale di geni ha diminuito l'numero è il rapporto osservato (ad esempio, i geni microRNA con STAT3 siti di legame / numero totale dei microRNA ha diminuito l'= 0.6).
  2. Utilizzare χ2 statistiche per confrontare i rapporti osservati e attesi che sono stati generati al di sopra e determinare se l'elenco dei geni che sono stati downregulated in cellule trasfettate fattore di trascrizione-shRNA sono arricchiti con siti di legame fattore di trascrizione nel loro promotore.

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Risultati

STAT3 è un fattore di trascrizione che induce tipicamente la trascrizione di geni che sono anti apoptotico ed effetti proliferativi 12. Sia STAT3 riguardano anche la non codificante RNA trascrittoma è attualmente sconosciuto. In tutte le cellule CLL STAT3 è costitutivamente fosforilata in serina 707 residui 10,13. Fosfoserina STAT3 navette per il nucleo, si lega al DNA, e attiva i geni noti per essere attivato da tirosina pSTAT3 in altri tipi di cellule 10.

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Discussione

Il meccanismo alla base della RNA polimerasi II trascrizione dipendente dei geni codificanti proteine ​​è stata ampiamente studiata. Mentre questi elementi costituiscono solo l'1% - 2% del genoma umano, la prova del progetto ENCODE suggeriscono che oltre l'80% del genoma umano può subire trascrizione 17 e quello che regola la trascrizione degli elementi di DNA non codificanti rimane in gran parte sconosciuta 6 .

Diversi studi, che ha indicato che Pol II è anche ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione della Fondazione Global Research LLC. L'Università del Texas MD Anderson Cancer Center è supportato in parte dal National Institutes of Health attraverso un Cancer Center Support Grant (P30CA16672).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lipofectamin 2000Life Technologies11668027
0,45 &; m filtro per siringaThermo Scientific (Nalgene)190-2545
Dispositivo filtrante ultracentrifugo Amicon con soglia di 100  kDaMerck Millipore
PolybreneMerck MilliporeTR-1003-G
Reagente TRIzolLife Tachnologies (Invitrogen)15596-026
293 Linea cellulare umanaSigma-Aldrich85120602

Riferimenti

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