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Articolo metodologico

In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

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DOI:

10.3791/53302

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5 gennaio 2016

1Department of Biological Sciences, St John's University

In questo articolo

Sommario

Il presente rapporto descrive un test enzimatico in vitro per misurare l'attività della fosfatidiletanolammina metiltransferasi utilizzando estratti cellulari di Leishmania. Questo test si basa sul trasferimento di un gruppo metilico radioattivo dalla S-[metil-3H]adenosil-L-metionina alla fosfatidiletanolammina endogena.

Abstract

Le fosfatidiletanolammina metiltransferasi sono enzimi biosintetici che catalizzano il trasferimento di uno o più gruppi metilici dalla S-adenosil-L-metionina alla fosfatidiletanolammina, monometil-fosfatidiletanolammina o dimetil-fosfatidiletanolammina per dare monometil-fosfatidiletanolammina, dimetil-fosfatidiletanolammina o fosfatidilcolina. Questi enzimi sono onnipresenti nelle cellule animali, nei funghi e si trovano anche in circa il 10% dei batteri. Svolgono varie funzioni importanti nella fisiologia cellulare oltre al loro ruolo diretto nel metabolismo dei lipidi, come nell'insulino-resistenza, nel diabete, nell'aterosclerosi, nella crescita cellulare o nella virulenza. Il presente manoscritto riporta un semplice saggio enzimatico cell-free che misura il trasferimento di gruppi metilici triziati da S-[Metil-3H]adenosil-L-metionina su fosfatidiletanolammina utilizzando estratti di cellule intere come fonte enzimatica. Le forme metilate risultanti di fosfatidiletanolammina sono idrofobiche e quindi possono essere separate dalla S-[metil-3H]adenosil-L-metionina solubile in acqua mediante estrazione organica. Questo test può essere potenzialmente applicato a qualsiasi altro tipo di cellula e utilizzato per testare inibitori/farmaci specifici per una fosfatidiletanolammina metiltransferasi di interesse senza la necessità di purificare l'enzima.

Introduzione

Fosfatidiletanolamina metiltransferasi (PEMT) enzimi catalizzano l'attacco covalente di uno o più gruppi metilici utilizzando S -adenosylmethionine (SAM) come il gruppo metilico donatore sul PE, PE o monometil-dimetil-PE dare monometil-PE, dimetil-PE e / o fosfatidilcolina (PC). Questi enzimi sono quasi onnipresenti nelle cellule animali e funghi. Possono anche essere trovati in alcune piante 1 e circa il 10% dei batteri, in particolare quelli che interagiscono con eucarioti 2.

PEMTs sono rilevanti alla biologia della cellula non solo contribuendo alla produzione di PC, che è la classe principale lipidi nelle cellule animali, ma anche compiendo altre importanti funzioni cellulari. Nei mammiferi, PEMTs sono espressi principalmente nel fegato dove sono richiesti per il normale secrezione di lipoproteine ​​a bassissima densità e contribuiscono anche all'obesità indotta dalla dieta 3, aterosclerosi 4, e l'insulina resistonoANCE 5. Inoltre, PEMT mammiferi sono espressi anche negli adipociti, anche se a livelli più bassi, e partecipare a deposizione di grasso 6, 7. Ruolo PEMT nello sviluppo del cancro 8, 9 apoptosi, e la crescita delle cellule 10 sono stati anche dimostrato. Nei batteri, enzimi PEMT hanno dimostrato di essere importante per la normale crescita delle cellule 2, la virulenza 2, e simbiosi con la pianta ospite 11.

L'obiettivo e le motivazioni del presente protocollo è quello di misurare l'attività PEMT da estratti cellulari interi, senza la necessità di purificare l'enzima. Due protocolli distinti sono stati sviluppati per misurare l'attività PEMT. Il primo e più comune misura il trasferimento del gruppo metilico triziata da SAM radioattivo su PE, che è l'argomento di questo articolo. Questo protocollo è stato originariamente sviluppato per misurare l'attività PEMT dal lievito 12 e cellule di mammifero (fegato) 13 per ottenere un understANDing di biosintesi PC in queste cellule, nonché per determinare la specificità di questi enzimi. Successivamente, questa tecnica è stata applicata ad altri tipi di cellule, come i batteri 2 (utilizzando un valore pH basico per il test se 15) e protozoi parassiti 14. Questa tecnica può essere utilizzata con estratti cellulari interi nonché enzima purificato, e può potenzialmente essere applicato a qualsiasi sistema di estratto cellulare. Un test non radioattivo è stato progettato che si basa sulla quantificazione enzimatica di S -adenosylhomocysteine, il prodotto di transmetilazione SAM 16. Quest'ultimo test può essere più conveniente in quanto non comporta radioattività ma è adatto solo per gli enzimi purificati.

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Protocollo

1. cella estratto Preparazione

  1. Crescere le cellule Leishmania in una bottiglia di plastica sterile, sigillato con tappo a tenuta d'aria a 26 ° C in un mezzo fatto di 1x M199 supplementato con 20 mM HEPES pH7.4, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 5 mg / ml eme , 0,35 g / L Naco 2 H, adenina mM 0.1, e 2 mg / ml biopterina senza agitare. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1.500 g per 5 minuti a 4 ° C quando raggiungono una densità cellulare di 1-2 x 10 7 / ml.
  2. Eliminare il surnatante con una pipetta e lavare le cellule risospendendo il pellet cellulare con una pipetta sierologica a metà del volume del cultura del fosfato salino freddo tamponata (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, Na 10 mm 2 HPO 4, 1.8 KH mM 2 PO 4, pH7.4). Smaltire surnatanti cellulari secondo le linee guida di sicurezza BL2.
  3. Centrifugare le cellule di nuovo a 1.500 g per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante con una pipetta. Procedere to il prossimo passo elastico, congelare il pellet di cellule in azoto liquido per la conservazione a lungo termine a -80 ° C (fino a tre mesi).
  4. Preparare 2x tampone di lisi (0,5 M di saccarosio, 0,1 M TrisHCl, pH7.5, 2 mM EDTA, e inibitore della proteasi 2x cocktail) e tenerlo a 4 ° C su ghiaccio.
  5. Risospendere il pellet cellulare (fresco o congelato) in volume uguale di tampone di lisi 2x. Aggiungere il volume 1x di perline di vetro. Vortex vigorosamente a 4 ° C per 10 min.
  6. Aggiungere 2 volumi di tampone di lisi 1x e mescolare. Estratti cellulari centrifugare a 1500 xg a 4 ° C per 10 minuti a pellet cellule intatte e nuclei.
  7. Trasferire il surnatante con una pipetta in una provetta da centrifuga fresca aperta e mantenerlo estratti cellulari in ghiaccio fino al completamento dell'esperimento.

2. Determinare la concentrazione della proteina del estratto cellulare utilizzando proteine ​​Stima Kit Come bicinconinico Acid Assay

  1. Preparare la soluzione di acido bicinconinico (BCA) (1 ml / tubo) mescolando il BCA e rame (II) sulfate in un rapporto di 49: 1 (v / v).
  2. Preparare gli standard proteici di 0, 10, 20, 30, 40, 50, e 60 ug / ml diluendo un / ml albumina di siero bovino (BSA) soluzione madre 10 mg in 1 ml aliquote della soluzione BCA.
  3. Aggiungere 2 ml di cellule estratti in 1 ml di soluzione di BCA in duplicato. Incubare standard e campioni di proteine ​​per 10 minuti in un bagno d'acqua a 60 ° C pre-riscaldato.
  4. Campioni di trasferimento di ghiaccio per 3 min. Misurare l'assorbanza degli standard e dei campioni di proteine ​​con uno spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 562 nm.
  5. Calcolare la concentrazione proteica degli estratti cellulari utilizzando lo standard BSA come riferimento, come descritto nel protocollo del produttore. Diluire estratti cellulari ad una concentrazione proteica di 10 mg / ml con tampone di lisi 1x.

3. enzimatica Assay in 200 pl per Tubo

NOTA: Eseguire le seguenti operazioni in una cappa chimica.

  1. Testare ciascun campione in duplicato in 15 mltubo conico. Preparare 20 ml 1 M TrisHCl pH 7,5 per tubo e tenerlo in ghiaccio. Preparare 2 ml di cloroformio / metanolo (1: 1 (v / v); soluzione di stop) a temperatura ambiente per ogni provetta.
  2. Pipettare 20 ml di 1 M pH 7,5 TrisHCl in ciascun tubo da 15 ml su ghiaccio.
  3. Seguire le linee guida di sicurezza di radiazioni da qui in poi. Aggiungere l'equivalente di 0,06 mM (0,2 pCi) S - [Methyl- 3 H] adenosil-L-metionina e 50 mM freddo SAM per provetta per un totale di 50,06 mM di SAM. Aggiungi x ml di acqua fredda dove x = 200- (20 (per il buffer) + 20 (per estratti cellulari) + volume di freddo e radioattivi SAM) per provetta.
  4. Trasferire ogni tubo conico a 30 ° C bagno di acqua preriscaldata. Aggiungere a ciascuna provetta 20 l di estratti cellulari (pari a 200 mg di proteine) per attivare la reazione. Incubare per il tempo desiderato (da 0 a 45 min).
  5. Arrestare la reazione aggiungendo 2 ml di cloroformio / metanolo (1: 1; v / v; soluzione di arresto) ad ogni provetta. Trasferire il tubo conico di RT (20-256; C).

4. lipidi Estrazione

NOTA: Eseguire le seguenti operazioni in una cappa chimica.

  1. Aggiungere 700 ml di acqua a ciascuna provetta contenente il campione reazione enzimatica. Vortex energicamente per 30 sec. Centrifugare a 1500 xg per 5 minuti a RT per separare il organica dalla fase acquosa.
  2. Trasferire la fase organica inferiore in un nuovo tubo da 15 ml con una pipetta. Aggiungere 1 ml di acqua per ogni "fase inferiore" contenente provetta e agitare vigorosamente per 30 secondi. Centrifugare nuovamente a 1.500 xg per 5 min per separare il organica dalla fase acquosa.
  3. Trasferire la fase organica inferiore in un tubo scintillazione con una pipetta. Campioni secco sotto flusso di N 2. Smaltire le fasi d'acqua contenenti la SAM radioattivo non incorporato e tubi coniche radioattive come da linee guida di radiazione.
  4. Aggiungere 2 ml / tubo di scintillazione liquida. Misurare la radioattività incorporata con un paio di scintillazionenter secondo il protocollo dei costruttori e l'uso dello strumento.
  5. Calcolare l'attività enzimatica in nmol / mg proteina usando la seguente equazione generale:
    valore cpm x 10 x 3 [totale (radioattivi e freddo) concentrazione di SAM (mM)] x 5 attività specifica di SAM radioattivi (Ci / mmol) x [concentrazione di SAM radioattivi (mM)]
    NOTA: il protocollo di cui sopra può essere modificato per una concentrazione SAM dipendente o una proteina dipendente test PEMT. Per concentrazione SAM saggio enzimatico dipendente, il tempo viene mantenuta costante (15 min, che è nel range lineare) e varie quantità di freddo SAM vengono aggiunti al dosaggio mentre per proteina dipendente dosaggio PEMT, concentrazione SAM (abbiamo scelto 0,05 mM) e tempo sono mantenuto costante (15 min). Anche il pH del tampone può essere cambiata come necessario se alcuni enzimi PEMT hanno un diverso valore ottimale del pH.

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Risultati

La figura 1 mostra un tempo dipendente PEMT dosaggio, che è stata effettuata con Leishmania estratto cellula intera come fonte dell'enzima utilizzando PE endogena come substrato. La quantità di radioattività nella fase organica è stata quantificata mediante conteggio a scintillazione. I numeri ottenuti sono stati utilizzati per calcolare la quantità di gruppi metilici triziata trasferiti verso PE. L'attività PEMT era lineare per circa 20 min. È quindi ra...

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Discussione

Questa semplice, rapido test PEMT consente la quantificazione di forme metilate di PE che deriva dal trasferimento di gruppi metilici radioattive da SAM su PE utilizzando estratto cellulare tutto come fonte proteica. È veloce, sensibile, riproducibile e adatto anche per enzimi purificati 17. Monomethyl- o dimetil-PE possono essere aggiunti al test se il metiltransferasi di interesse specifico per questi substrati anziché PE 12,13,18,19. Se viene utilizzato purificato enzima PEMT, PE può essere aggi...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH ARRA RO3 AI078145 e 1SC3GM113743 a RZ.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
S-[Metil-3H]adenosil-L-metionina (attività specifica di 5-15 Ci/mMole)Perkin ElmerNET155050UCAliquotare il reagente e congelare a -20 ° C; seguire le linee guida sulla sicurezza delle radiazioni durante l'utilizzo di questo reagente
Cocktail di inibitori della proteasiRoche Life Sciences11836170001diluirlo fresco 
Perle di vetro, lavate con acido, 425-600 mmSigma AldrichG8772
Soluzione di acido bicinconnicoSigma AldrichB9643
Solfato di rame (II)Sigma AldrichC2284
Contatore a scintillazione MicroBeta2 con 1-rivelatorePerkin Elmer 2450-0010
Spettrofotometro Biomate 3Thermo Scientific840208300
soluzione madre BSA (10 mg/ml)New England BiolabsB9001S
Liquido a scintillazione Prodotto della ricerca International Corp111198
cloruro di S-(5'-adenosil)-L-metionina (cloridrato) Cayman Chemicals13956diluire il reagente in 20 mM di HCl e congelare le aliquote a -80 gradi; C 

Riferimenti

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