Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.
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Articolo metodologico
Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Risposta immunitaria efficace dipende da una rapida mobilitazione dei leucociti del sangue al sito di infezione o lesioni. Indagare la migrazione dei leucociti in vivo è di fondamentale importanza per la comprensione delle basi molecolari della migrazione dei leucociti transendoteliale e l'interazione con l'endotelio vascolare. Un approccio potente coinvolge microscopia intravitale su topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti in cellule di interesse.
Qui vi presentiamo un protocollo per i monociti imaging e neutrofili nel CX 3 CR1 GFP / peso del mouse iv iniettato con arancio neutrofili dye-etichettati con un microscopio confocale invertito. Film time-lapse raccolti da 30 minuti a diverse ore dell'imaging permettere l'analisi del comportamento dei leucociti nelle vene mesenteriche sia in condizioni di stato e infiammatorie costante. Abbiamo inoltre descritti i passi per indurre localmente infiammazione dei vasi sanguigni con TLR2 / TLR1 agonisti Pam3SK4 e monitorare la subsequent reclutamento dei neutrofili e monociti.
La tecnica presentata può anche essere utilizzato per monitorare altre popolazioni di leucociti e indagare le molecole implicate nel reclutamento dei leucociti o nel traffico con altri stimoli o topi transgenici.
Introduzione
Neutrofili e monociti sono cellule del sistema immune innato che circolano continuamente nel sangue. Su lesioni o infezioni, segnali infiammatori inducono leucociti diapedesi in tessuti danneggiati e infetti, qui l'avvio di una risposta immunitaria cellulare 1-3. La rapidità di leucociti mobilizzazione determina l'esito positivo delle risposte immunitarie. Questi processi intricati basano su molecole specifiche (ad esempio, selectine, chemochine endotelio-bound) presenti sull'endotelio infiammata che aiutano per la creazione di contatti tra adesivi leucociti circolanti e l'endotelio 1-3 .Per ottenere approfondiment....
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Protocollo
NOTA: le procedure di animali sono stati eseguiti in conformità con la Comitato Etico Istituzionale di Animal Care a Ginevra, in Svizzera e l'Ufficio cantonale di veterinaria. Numero di autorizzazione GE / 63/14.
1. Preparazione di una sospensione singola cella da midollo osseo
- Mouse Sacrificio (8-12 settimane di età) per dislocazione cervicale. Sterilizzare zampe posteriori con il 70% di etanolo. Togliere la pelle dalle gambe posteriori.
- Sezionare femori e tibie e il mouse rimuovere il tessuto da gambe con un bisturi. Sciacquare gambe con il 90% di etanolo e posto in un piatto cultura piena di PBS.
- Sott....
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Risultati
Il manoscritto descrive un protocollo ottimizzato in modo da controllarne il comportamento di monociti e neutrofili nelle vene mesenteriche di topi anestetizzati in tempo reale. L'uso di una camera 37 ° C-termostatato è obbligatoria per mantenere la temperatura del mouse e anche a causa della temperatura di circolazione dipendente leucociti. Preparazione del mouse viene visualizzato in Figura 1. La Figura 2 mostra tutta la zona visto al microscopio. Luce trasmessa permette l'ide.......
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Discussione
Le metodologie descritte in questo manoscritto forniscono un approccio coerente per studiare in modo efficiente monociti e il comportamento dei neutrofili nelle vene mesenteriche in condizioni di stato e infiammatorie costante.
La fase cruciale della preparazione è l'immobilizzazione dell'intestino con tessuti PBS-bagnate. Se eseguita correttamente, vasi mesenterici sono ben esposti sul vetrino per l'acquisizione delle immagini. Ciò consente la selezione di vari campi di interess.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da EMBO (a Y.E.), Foundation Machaon (a Y.E.) e SNSF (a B.A.I.). Ringraziamo la Bioimaging Core Facility per la disponibilità del microscopio Nikon A1r e l'assistenza tecnica. Ringraziamo la signora Clarissa Bartley per la correzione in inglese.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubi a fondo tondo in polistirene da 5 ml | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT: 4 mm | Nikon | ||
| 20x CFI Piano Apocromatico VC 0,75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Arancione CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Kit di arricchimento dei neutrofili | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Olio da immersione Tipo A | Nikon | qualsiasi olio viscoso | |
| Life Box Sistema di controllo della temperatura | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Microscopio confocale Nikon A1R | Microscopio | A1R | , tavolino x/y/z motorizzato, software elementi NIS |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| senza rosso fenolo DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | qualsiasi terreno privo di rosso fenolo è adatto |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | ricostituire in PBS |
| Siero di ratto | Tecnologie | incluse nel kit di arricchimento dei neutrofili del topo EasySep | |
| Piatto di coltura tissutale 100 | TPP | 93100 |
Riferimenti
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers....
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Ristampe e permessi
