Preparazione e fotoacustico Analisi dei veicoli cellulari contenenti oro Nanorods

Lucia Cavigli; Francesca Tatini; Claudia Borri; Fulvio Ratto; Sonia Centi; Alberto Cini; Beatrice Lelli; Paolo Matteini; Roberto Pini

doi:10.3791/53328

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Articolo metodologico

Preparazione e fotoacustico Analisi dei veicoli cellulari contenenti oro Nanorods

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DOI:

10.3791/53328

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2 maggio 2016

Lucia Cavigli¹ , Francesca Tatini¹ , Claudia Borri² , Fulvio Ratto¹ , Sonia Centi¹ , Alberto Cini³ , Beatrice Lelli⁴ , Paolo Matteini¹ , Roberto Pini¹

¹Institute of Applied Physics, Italian National Research Council, ²Department of Experimental and Clinical Biomedical Sciences, University of Florence, Firenze, ³Department of Physics and Astronomy, University of Florence, Sesto Fiorentino, ⁴Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna

In questo articolo

Sommario

Mostriamo la preparazione e affrontiamo la fattibilità di veicoli cellulari contenenti nanobarre d'oro per l'imaging fotoacustico del cancro.

Abstract

nanorods oro sono attraenti per una gamma di applicazioni biomediche, quali l'ablazione fototermica e di imaging fotoacustico di cancro, grazie alla loro assorbanza ottica intensa nella finestra vicino infrarosso, bassa citotossicità e potenziale per casa in tumori. Tuttavia, la loro consegna ai tumori rimane ancora un problema. Un approccio innovativo consiste dello sfruttamento del tropismo di macrofagi associati al tumore che può essere caricato con nanotubi oro in vitro. Qui, descriviamo la preparazione e l'ispezione dei veicoli fotoacustica cellulari contenenti nanotubi d'oro. nanorods oro PEG sono modificati con composti di ammonio quaternario, per ottenere un profilo cationico. A contatto con macrofagi murini in piatti ordinari Petri, queste particelle si trovano a subire massiccia diffusione in vescicole endocytic. Poi queste cellule sono incorporati in idrogel biopolimerico, che vengono utilizzati per verificare che la stabilità della conversione fotoacusticadelle particelle viene mantenuto il loro inserimento in veicoli cellulari. Siamo certi che questi risultati possono fornire nuovi spunti per lo sviluppo di nuove strategie per fornire particelle plasmoniche ai tumori.

Introduzione

Negli ultimi dieci anni, varie particelle plasmoniche, come nanotubi d'oro, nanoshells e nanocages, hanno ricevuto una notevole attenzione per le applicazioni in ottica biomedica ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^4. In contrasto con nanosfere oro standard, queste particelle filtrate risuonano nella finestra vicino infrarosso (NIR) che prevede più profonda penetrazione ottica attraverso il corpo e alto contrasto ottico sui componenti endogene ^1. Questa caratteristica ha destato l'interesse per applicazioni innovative, come il fotoacustico (PA) imaging e l'ablazione fototermica di cancro. Tuttavia, diversi problemi frenano la penetrazione clinica di queste particelle. Per esempio, la loro attivazione ottica tende ad indurre il loro surriscaldamento e modificare le loro forme funzionali verso profili più sferiche, che controlla una fotoinstabilità ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ⁸ sup>, ^9. Un altro problema che domina il dibattito scientifico è la loro consegna sistemica in tumori. In particolare, nanotubi d'oro si combinano dimensioni che sono l'ideale per pervadere tumori che mostrano una maggiore permeabilità e ritenzione e la facilità di coniugazione con sonde specifiche di marcatori maligni. Pertanto, la loro preparazione per iniezione diretta nel flusso sanguigno è percepito come un regime fattibile ^{^10,} ^{^11,} ^{^12,} ^13. Comunque, questa via rimane problematica, con la maggior parte delle particelle diventando catturati dai fagociti mononucleati ^{^10,} ^{^11,} ^12. Inoltre, un'altra preoccupazione è la stabilità ottica e biochimica delle particelle dopo la circolazione attraverso il corpo ^14. Quando le particelle perdono la loro stabilità colloidale e di aggregazione, le loro caratteristiche plasmoniche e dinamiche di trasferimento di calore possono soffrire di accoppiamento plasmoniche ^{^15,} ^{^16,} ¹⁷ e cross-surriscaldamento ^18.

Più recentemente, l'idea di sfruttare il tropismo di macrofagi associati al tumore è emerso come un'alternativa intelligente ^{^19,} ^{^20,} ^21. Queste celle contengono una innata capacità di rilevare e pervadere i tumori con elevata specificità. Pertanto, una prospettiva potrebbe essere quella di isolare queste cellule da un paziente, caricarli con nanotubi d'oro in vitro e poi iniettare di nuovo nel paziente, con l'intento di usarli come veicoli cellulari responsabili della consegna. Un altro vantaggio sarebbe quello di ottenere un maggiore controllo sulla stabilità ottica e biochimico delle particelle, in quanto la loro interfaccia biologica sarebbe costruita in vitro. Ancora, le prestazioni di questi veicoli cellulari come agenti di contrasto ottici hanno bisogno di una analisi critica.

In questo lavoro, si descrive la preparazione e criticità di Cellulveicoli ar contenenti nanotubi d'oro per la formazione immagine PA di cancro. Nanorods oro PEG sono modificati con composti di ammonio quaternario ^22, al fine di ottenere un profilo cationico che si prevede di promuovere le loro interazioni con membrane plasmatiche ^{^23,} ^24. Queste particelle subiscono l'assorbimento efficiente e aspecifica dalla maggior parte dei tipi cellulari, si spera senza interferire molto con le loro funzioni biologiche. macrofagi murini sono caricati con un massimo di ben 200, 000 nanotubi d'oro cationici per cella, che diventano trovino all'interno di vescicole endocytic stretti. Questa configurazione dovrebbe sorgere preoccupazione, a causa della minaccia di accoppiamento plasmoniche e cross-surriscaldamento all'interno di queste vescicole. Pertanto, i macrofagi sono incorporati in idrogel biopolimerico che imitano i tessuti biologici, per verificare che la maggior parte della stabilità della conversione PA delle particelle è trattenuto nel trasferimento dal mezzo di crescita per le vescicole endocitiche. effectivcriteri di valutazione e sono elaborati al fine di misurare la stabilità della conversione PA in condizioni di immediato interesse per l'imaging PA. Una soglia rimodellare è impostato per lo insorgenza di instabilità ottica dopo un treno di 50 impulsi laser con la frequenza di ripetizione tipica di 10 Hz.

Siamo certi che questi risultati possono fornire lo slancio per lo sviluppo di nuove strategie per fornire particelle plasmoniche ai tumori.

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Protocollo

Nota: Tutte le concentrazioni di nanotubi d'oro sono espressi in termini di molarità nominali Au. Per il confronto con altre opere, di notare che 1 M Au corrisponde approssimativamente a 20 micron nanotubi d'oro, nel nostro caso.

1. Preparazione di cationici oro Nanorods

Nota: Il metodo inizia con la sintesi di bromuro cetrimonio (CTAB) nanorods oro -capped dalla riduzione autocatalitica di _HAuCl4 con acido ascorbico, secondo il protocollo introdotto da Nikoobakht et al ²⁵ e adattato secondo Ratto et al ^26... Poi questi nanorods oro sono modificate in modo da ottenere più biocompatibilità e affinità per le membrane plasmatiche, dalla combinazione di polietilenglicole trefoli ^{^10,} ^{^11,} ^{^27,} ²⁸ e composti di ammonio quaternario ^22.

Purificare 24 ml nanotubi d'oro CTAB-capped a concentration di 450 pM Au da due cicli di centrifugazione (12.000 xg, 30 min) e decantazione. Assicurarsi che il rapporto tra volume morto al volume iniziale è di circa 1/200 o inferiore per tutte le fasi di centrifugazione di questo protocollo. Utilizzare 500 pM acquosa CTAB come soluzione di lavaggio e infine trasferire le particelle in 6 ml 100 mM tampone acetato a pH 5, contenente 500 mM CTAB e 0,005% (v / v) polisorbato 20.
Aggiungere 30 microlitri 10 mM acquosa alfa-metossi-omega-mercapto-poli (etilene glicole) (MW ~ 5000) e lasciare reagire per 30 min a 37 ° C.
Aggiungere 30 ml 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N bromuro -trimethylammonium in dimetilsolfossido e lasciare a riposo per 24 ore a 37 ° C.
Successivamente, aggiungere 18 ml 0,005% (v / v) polisorbato 20 in acqua e purificare queste particelle da quattro cicli di centrifugazione (12.000 xg, 30 min) e decantazione. Utilizzare 0,005% (v / v) polisorbato 20 in acqua come soluzione di lavaggio e infine trasferire le particelle in 2,4 ml di PBS sterile a pH7.4. La concentrazione nominale finale di oro è di 4,5 mm.

2. Caricamento di murini macrofagi con oro Nanorods

Utilizzare la / linea cellulare macrofagica monociti J774a.1 e DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino, 1 mM glutammina, 100 unità / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina come mezzo di coltura. Piastra 5 x 10 ⁵ cellule in quattro piastre di Petri di 60 mm di diametro e consentire loro di crescere per 24 ore, in modo da essere subconfluenti al momento del distacco (vedi punto 2.2).
1. In tutto il protocollo, di mantenere le cellule in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% di CO _2, aria 95% e il 100% di umidità relativa). Utilizzare una cappa a flusso laminare e dispositivi di protezione adeguati per manipolare le cellule.
Dopo 24 ore, caricare le cellule con nanotubi d'oro cationici e prepararli per essere incorporato in film chitosano:
1. Per consentire alle particelle di essere assunti dalle cellule, aggiungere una aliquota di 4,5mM Au nanotubi d'oro cationico in soluzione in ciascuno piastra di Petri, in modo da raggiungere una concentrazione finale di 100 micron Au. Lasciare le piastre di Petri in incubazione per 24 ore.
2. Successivamente, osservare le cellule al microscopio ottico per confermare le loro buone condizioni e il caricamento. Le cellule devono esibire loro normale morfologia e un certo numero di vescicole intracellulari scuri. Staccare le cellule con un raschietto, unire quelli da due piastre di Petri, al fine di ottenere una quantità adeguata di cellule per i seguenti passi (almeno 2 x 10 ⁶ cellule), e centrifugare loro (120 xg, 6 min) per eliminare qualsiasi eccesso di nanotubi d'oro cationici. Il pellet cellulare dovrebbe apparire quasi nero.
3. Sospendere il pellet in 2 ml di PBS e contare le cellule mediante l'uso di una camera di Bürker. Centrifugare una sospensione contenente 2 x 10 ⁶ cellule (120 xg, 6 min) e fissare il pellet in 2 ml di 3,6% (w / v) di formaldeide in PBS per dieci minuti a temperatura ambiente. Infine, lavare questo pellet tre volte da centrifugation (120 xg, 6 min) per rimuovere il fissativo. Usa PBS come soluzione di lavaggio.

3. Radicamento dei macrofagi in Chitosano Cinema

Nota: Le proprietà peculiari del chitosano ^{^26,} ^{^27,} ^{^28,} ²⁹ sono sfruttati per la produzione di fantasmi biomimetici contenenti macrofagi colorati con nanotubi d'oro cationici. Rispetto ad altri idrogel come agarosio, chitosano permette film che sono molto più forte e più sottile, che è fondamentale per la microscopia PA ^6. La fabbricazione di questi fantasmi viene effettuata secondo precedenti protocolli ^{^29,} ^{^30,} ³¹ con alcune modifiche come prescritto nelle seguenti ^30.

Preparare una acidificata (pH 4,5, ottenuto mediante aggiunta di acido acetico) e viscosa 3% (w / v) a basso peso molecolare chitosano (MW medio 120 kDa) soluzione, mescolare bene elasciate omogeneizzare per 24 ore a 40 ° C.
Avanti, mescolare macrofagi murini contenenti nanotubi d'oro cationico (2 x 10 ⁶ celle) con 500 ml di soluzione di chitosano.
Per ottenere ~ 50 micron di spessore fantasmi, versare 250 mg del composto in 1,91 cm ² stampi polistirolo e lasciarli sotto flusso di azoto per 24 ore. Successivamente, trattare questi campioni con 500 microlitri 1 M NaOH, per indurre reticolazione, e sciacquare con 10 ml di acqua ultrapura.

4. Prova di stabilità di conversione Fotoacustica

Nota: La stabilità della conversione PA è indagato per mezzo di esperimenti di PA con la configurazione fatta in casa, che è descritto in rif 6.

Sospendere un film chitosano contenente macrofagi in acqua deionizzata, per esempio mediante l'uso di un supporto di plastica immerso in una capsula di Petri, in modo da mantenere una distanza di ~ 5 mm dal fondo della piastra. Mettere questo piatto su un palco XY micrometricaal fine di controllare la posizione del campione.
Primo un fascio laser con ~ 5 durata nsec impulsi in risonanza con la banda plasmonica longitudinale dei nanotubi oro (ad esempio, da un oscillatore parametrico ottico pompato dalla terza armonica di un Nd Q-switched: YAG con lunghezza d'onda di 400 - 2,500 durata dell'impulso nm e 5 nsec) perpendicolare alla superficie del film con un diametro dello spot ~ 300 micron.
1. Inserire un attenuatore di fronte all'uscita del laser per sintonizzare la fluenza laser e utilizzare un divisore di fascio di concentrare parte del fascio laser per un contatore di energia (per esempio, un rilevatore piroelettrico) e monitorare fluttuazioni di fluenza. Mantenere la fluenza ottica sotto ~ 1 mJ / cm ² per impulso durante l'allineamento. Utilizzare appropriata occhiali di sicurezza laser ogni volta che il laser è acceso.
Dip un trasduttore ad ultrasuoni (gamma di frequenza di 1 - 20 MHz) nella piastra Petri ~ 2 millimetri fuori della superficie della pellicola e regolarne la posizione utilizzando definizioni micrometricie fasi di rotazione per massimizzare il segnale PA emesso dal film.
Determinare un influenza sonda F _LO che non danneggia il campione ^6:
1. Irradiare un punto a caso del campione ad una fluenza circa 1 mJ / cm ² per impulso per almeno 500 impulsi. Per ogni impulso, acquisire il segnale PA corrispondente dal trasduttore ultrasonico e fluenza laser dal contatore di energia con un oscilloscopio. Assegnare un nome alla fluenza media come ^prova F _LO.
2. Calcolare l'intensità del segnale PA come ampiezza picco-picco in funzione del numero di impulsi. Per controbilanciare le fluttuazioni di intensità laser, normalizzare l'ampiezza di ciascun segnale PA al rapporto tra la propria fluenza a ^processo F _LO. Analizzare l'andamento dell'intensità normalizzato PA in funzione del numero di impulsi e verificare la stabilità nel tempo.
3. Nel caso di instabilità, ripetere i punti 4.4.1 a 4.4.3 con un valore inferiore di F _LO ^{trial. Nel caso di stabilità, ripeterli con un valore di ^processo F _LO maggiore di circa 10%, fino manifestarsi di una perdita di stabilità. Impostare la sonda fluenza F _LO come il secondo valore più alto di ^tentativi F _LO che assicura stabilità.}
Misurare una soglia fluenza rimodellamento:
1. Scegliere un altro punto a caso del campione e la sonda un'intensità media PA (I _LO ^a) superiore a 500 impulsi a F _LO.
2. Impostare un fluenza nominale superiore a F _LO e fornire 50 impulsi. Nome loro influenza media come F _exc.
3. Sonda un'intensità media PA (I _LO ^b) più di 500 impulsi a F _LO ancora una volta. Calcolare il rapporto R = I _LO ^b / I _LO ^a. Un valore di R al di sotto dell'unità testimonia un cambiamento irreversibile delle proprietà ottiche del campione.
4. Utilizzare il palco micrometrica XY per spostare il film e cambiare il point del campione a caso. Ripetere i punti 4.5.1 a 4.5.4 con diversi valori di F _esc, in modo da prendere un paio di valori di R sotto, intorno e sopra l'unità. 15 punti sono ragionevoli.
5. Plot R in funzione di F _exc e identificare la soglia rimodellamento fluenza F _th come tale valore quando R inizia a differire da quello oltre incertezza statistica. ⁶

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Risultati

Qui, la fattibilità di veicoli cellulari contenenti nanotubi d'oro per la formazione immagine PA del cancro è mostrato insieme a risultati tipici di protocollo.

Le immagini TEM in figura 1 mostra il solito aspetto delle particelle dopo il punto 1 e dei loro veicoli cellulari dopo il punto 2. La preparazione delle particelle e delle cellule per l'imaging TEM è descritto altrove ^17. nanotubi d...

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Discussione

La nozione di indirizzare i macrofagi associati al tumore sta emergendo come un concetto potente per combattere il cancro ^{^34,} ^{^35,} ^36. Qui, invece della loro distruzione, queste cellule vengono reclutati come veicoli cellulari per portare nanotubi d'oro in un tumore, dallo sfruttamento del loro tropismo. Questa prospettiva richiede una progettazione attenta delle particelle, la loro integrazione nelle cellule e la loro caratterizzazione. Abbiamo trovato che la fo...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato parzialmente supportato dalla Regione Toscana e della Comunità Europea all'interno della cornice della bolla ERANET + Progetti LUS e BI-TRE.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Esadeciltrimetilammonio bromuro	Sigma-Aldrich	H6269	Per sintetizzare nanobarre d'oro Cloruro
d'oro (III) triidrato	Sigma-Aldrich	520918	Per sintetizzare nanobarre d'oro
Nitrato d'argento	Sigma-Aldrich	S6506	Per sintetizzare nanobarre d'oro
Acido L-ascorbico	Sigma-Aldrich	A5960	Per sintetizzare nanobarre d'oro
Boroidruro di sodio	Sigma-Aldrich		Per sintetizzare nanosemi d'oro
MeO-PEG-SH	Iris Biotech PEG1171		Per PEGylare nanorod d'oro. Peso molecolare circa 5.000 Da.
Acido acetico	Sigma-Aldrich	320099	Per PEGilare nanobarre d'oro e solubilizzare chitosano
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	S8750	Per PEGylate gold nanorods
(11-Mercaptoundecyl)-N,N-trimethylammonium bromide	Sigma-Aldrich	733305	Per modificare nanorod d'oro con composti di ammonio quaternario
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	276855	Per solubilizzare (11-mercaptoundecil)-N,N,N-trimetilammonio
bromuro Polisorbato 20	Sigma-Aldrich	P2287	Per centrifugare nanobarre d'oro PEGilate
PBS	Lonza	BE17-516F	Per sospendere nanobarre d'oro prima dell'incubazione con le cellule e per trattare i pellet delle cellule
J774a.1	ATCC	TIB-67	Linea cellulare murina monocita/macrofago
DMEM	Lonza	BE12-707F	Terreno di coltura cellulare
FBS	Lonza	DE14-801F	Da aggiungere al terreno di coltura cellulare
L-glutammina	Lonza	BE17-605E	Da aggiungere al terreno di coltura cellulare
Penicillina/streptomicina	Lonza	DE17-602E	Da aggiungere al terreno di coltura cellulare
Piastra di Petri	NEST	705001	Coltura cellulare piatto
Raschietto cellulare	EuroClone	ES7018	Per staccare le cellule
Formaldeide	Fluka	47630	Per fissare le cellule
Chitosano, a basso peso molecolare	Sigma-Aldrich	448869	deacetilato al 75-85%. Peso molecolare circa 120.000 Da.
Idrossiide di sodio	Sigma-Aldrich	306576	Per insolubilizzare il chitosano e generare l'idrogel
Piastre di coltura cellulare in polistirene	NEST	702011	Utilizzato come stampi per fabbricare idrogel di chitosano
Oscillatore parametrico ottico pompato dalla terza armonica di un laser Nd:YAG Q-switched	Continuum, Santa Clara, USA	OPO surelite plus	Fonte di eccitazione ottica per test fotoacustici
Rivelatore piroelettrico	Gentec, Quebec, Canada	QE8SP	Per monitorare la fluenza ottica per test fotoacustici
Idrofono ad ago preamplificato	Precision Acoustic, Dorset, Regno Unito	Modello con diametro del sensore di 1 mm e gamma di frequenza 1-20 MHz	Per misurare i segnali fotoacustici

Riferimenti

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