Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Sommario

Questo protocollo descrive come utilizzare quantitativa Real-time PCR (QRT-PCR) per rilevare l'mRNA specifici di cellule tumorali rappresentano metastasi all'interno del tessuto polmonare del mouse.

Abstract

La malattia metastatica è la diffusione delle cellule tumorali maligne dal sito cancro primario di un organo lontana ed è la causa primaria di cancro associato alla morte ^1. Comuni sedi di diffusione metastatica includono polmone, linfonodi, cervello, ossa e ^2. Meccanismi che guidano le metastasi sono zone intense di ricerca sul cancro. Di conseguenza, le analisi efficaci per misurare onere metastatico in siti distanti di metastasi sono strumentali per la ricerca sul cancro. Valutazione delle metastasi polmonari in modelli di tumore mammario viene generalmente effettuata attraverso l'osservazione qualitativa lordo del tessuto polmonare dopo dissezione. Metodi quantitativi per valutare le metastasi si limitano attualmente ex vivo e in tecniche di imaging basato vivo che richiedono parametri definiti dall'utente. Molte di queste tecniche sono al di organismo intero piuttosto che il livello cellulare ^3-6. Anche se i metodi di imaging più recenti che utilizzano la microscopia multi-fotone sono in grado di valutare metastasiTASIS a livello cellulare ^7, questi altamente eleganti procedure sono più adatti a valutare i meccanismi di diffusione piuttosto che la valutazione quantitativa degli oneri metastatico. Qui, un semplice metodo in vitro per valutare quantitativamente metastasi è presentato. Utilizzando quantitativa Real-time PCR (QRT-PCR), cellule tumorali mRNA specifico può essere rilevato all'interno del tessuto polmonare del mouse.

Introduzione

Analisi RT-PCR si propone come un metodo per valutare metastasi tumorali. Questo metodo si propone come alternativa per gli utenti che sono interessati a valutare le metastasi, ma non possono avere accesso alle attrezzature specifiche quali attrezzature imaging in vivo o una fluorescenza stereoscopio capace. Una discussione dei metodi comunemente usati è presentato seguita da una dimostrazione di come l'analisi RT-PCR può essere usato sia come separato o come un metodo per valutare guidata metastasi. Questa procedura ha il potenziale per fornire un'analisi quantitativa di carico metastatico.

Metodi standard di analisi lordo, tra cui la visualizzazione dei polmoni allo stereomicroscopio nonché sezionamento seriale seguita da ematossilina eosina (H & E) la colorazione del tessuto polmonare, sono quantificabili ma fanno molto affidamento su parametri definiti dall'utente per il conteggio ^2-5. Nel valutare i polmoni interi utilizzando uno stereomicroscopio, solo le grandi metastasi di superficie sono visibile e analisi richiede l'investigatore di avere ragionevole conoscenza della struttura anatomica del polmone a determinare ciò che costituisce una lesione metastatica. Marcatura fluorescente di cellule tumorali con un marcatore, come GFP e l'uso di uno stereomicroscopio che contiene un cubo di luce con i massimi appropriata di eccitazione / emissione (ad esempio vicino 470/510 nm per GFP) aiuta in questo processo, ma solo noduli tumorali superficie sono rilevabili . Inoltre, la fluorescenza dalla contaminazione del sangue, che è visibile sotto gli stessi parametri GFP, può portare a false identificazione di possibili lesioni metastatiche.

Sezionamento del polmone seguita da colorazione H & E di visualizzare metastasi polmonari è un metodo utile per valutare micrometastasi e altri processi microscopici, tra cui l'infiltrazione di cellule immunitarie, ma spesso richiede l'uso di tutto il tessuto polmonare per paraffina, sezionamento, e procedure di colorazione. Pertanto, le procedure a valle non sono ideali seguendo questo method. Sebbene quantificabile, questa procedura richiede al ricercatore di valutare un gran numero di sezioni polmonari colorate per animale per garantire che l'analisi dei bilanci dell'intera struttura 3D del polmone. Di conseguenza, questo tipo di esame è molto tempo, può portare ad errori di conteggio e analisi dipende fortemente investigatore discrezione.

Diversi in tecniche di imaging in vivo (ad esempio la risonanza magnetica, PET, SPECT) sono attualmente utilizzate per eseguire o testare i processi biologici in modelli di roditori sperimentali ^8. Imaging in vivo bioluminescente è un metodo comune utilizzato per acquisire una visione lordo di metastasi ^9. Questa tecnica è generalmente applicato per valutare la presenza di attività della luciferasi dovuto all'accumulo di cellule tumorali, che sono progettati per contenere un elemento di risposta luciferasi, che risiedono in organi specifici come la ghiandola mammaria dopo l'impianto delle cellule tumorali e il polmone su metastasi spontanea ¹0. La visualizzazione di attività della luciferasi è indotta dalla presenza del substrato luciferina (D-luciferina). Luciferasi catalizza la decarbossilazione ossidativa di D-luciferina per oxyluciferin generare bioluminescenza. Mentre informativo, questo metodo è limitata da diversi fattori tra cui la stabilità del substrato (es emivita breve), adeguata distribuzione di substrato, che dipende da come viene consegnato a animali da esperimento, e la bassa sensibilità di rilevazione ^9. Un merito principale di questa tecnica è che è non invasivo, può essere eseguita su animali vivi, e può portare alla rilevazione di metastasi delle cellule tumorali in diversi organi che non può essere normalmente raccolte a dissezione ^9,10.

Un aspetto positivo delle tecniche di imaging in vivo è che il tessuto polmonare è indisturbato permettendo per le procedure secondari come paraffina o come presentato qui, analisi QRT-PCR. Tuttavia, poiché QRT-PCR è Theoretically una misura più sensibile di rilevazione, la valutazione lordo non può rivelare un basso numero di cellule presenti nel polmone tumore. Mentre utile, le tecniche di imaging sopra descritti possono essere sostituiti o integrati con il metodo RT-PCR attualmente descritto. QRT-PCR ha il potenziale per fornire una misura sensibile di mRNA derivate da tumore all'interno di un polmone.

Protocollo

Il protocollo segue le linee guida e gli standard di cura degli animali della Medical University of South Carolina (MUSC) e la sua Animal Care istituzionali e del Comitato uso (IACUC).

1. Lung Dissection

1. Mammaria dissezione del tumore (opzionale a seconda degli obiettivi di studio e se analisi tumore primario o coda vena iniezione è stata eseguita).
   1. Euthanize mouse utilizzando una dose letale di anestesia isoflurano secondo IACUC e regolamentazione università. Confermare euthanization da lussazione chirurgica.
   2. A bordo della gomma piuma, poli con perni dissezione mettendo mouse sulla sua schiena con gli arti diffusione.
   3. Spray mouse con etanolo al 70%.
   4. Utilizzando pinze, afferrare la parte inferiore dell'animale al centro.
   5. Usando forbici, tagliare verso l'alto verso il collo attraverso la pelle, facendo attenzione a non forare la cavità peritoneale del mouse.
   6. Tagliare la pelle agli arti per rivelare tessuto tumorale.
   7. Sezionare tessuto tumorale e preserve dal metodo preferito, come il congelamento o fissazione, per ulteriore analisi (non discusso ulteriormente in questo protocollo).
2. Dissezione tessuto polmonare.
   1. Se il tessuto tumorale è stato raccolto come descritto sopra, definire con precisione qualsiasi eccesso di pelle.
   2. Utilizzando pinze, afferrare peritoneo alla estremità inferiore dell'animale e iniziare il taglio verso l'alto verso la base del collo.
   3. Tagliare con cautela lungo i lati sinistro e destro della gabbia toracica facendo attenzione ad evitare eventuali recidere vasi sanguigni che possono sanguinare nella cavità toracica. Rimuovere le costole tagliando a sinistra ea destra attraverso il diaframma e superiore porzioni della gabbia toracica.
   4. Utilizzando pinze afferrare la trachea del mouse e tirare avanti.
   5. Sever la trachea con le forbici dissezione e rimuovere polmoni di mouse.
      Nota: Il cuore può rimanere attaccato al polmone. In questo caso, sezionare accuratamente cuore lontano dai polmoni avendo cura di raccogliere tutti i cinque lobi (vedi Figura 1 ).
   6. Lavare delicatamente con PBS per rimuovere il sangue in eccesso.
3. La valutazione al lordo del tessuto polmonare.
   1. Opzione 1: imaging in vivo.
      1. Per l'imaging luciferasi, ~ 10 minuti prima di imaging, dare un 150 animali dose mg / kg di luciferina da intraperitoneale (ip) iniezione. Polmoni Immagine in vivo in animali anestetizzati o dopo la rimozione dopo la dissezione (Figura 2) ^5.
   2. Opzione 2: valutazione lorda.
      1. Esaminare polmoni sotto stereo microscopio per visualizzare noduli tumorali. Nota: Se le cellule sono GFP etichettati, uno stereomicroscopio capace fluorescenza contenente un cubo di luce con i massimi di eccitazione / emissione appropriata (ad esempio vicino 470/510 nm) per rilevare GFP può essere utilizzato per esaminare polmoni stereoscopicamente per fluorescenza prima della lavorazione.
   3. Se i polmoni devono essere analizzati immediatamente, passare alla sezione 'RNA Isolation'. In caso contrario, far scattare il tessuto freeze usando sapone liquidid azoto o ghiaccio secco. Conservare a -80 ° C.

2. RNA Isolation

Nota: Per l'analisi rappresentante, l'RNA è stato isolato utilizzando un kit di isolamento di RNA (vedi Lista dei materiali). Mentre l'analisi attuale utilizza prodotto uno specifico produttore, una varietà di kit di isolamento sono disponibili da diversi fornitori affidabili. Inoltre, i metodi di centrifugazione non a base di kit sono anche un'opzione. cDNA dovrebbe anche essere preparata da un campione di controllo di RNA positivo, come una linea cellulare o plasmide, per l'analisi della curva standard. In alternativa, un controllo positivo specifica per il set di sonde di primer può essere acquistato (vedi Materiali List).

1. Se si utilizza il tessuto precedentemente congelato, raccogliere tessuto congelato in ghiaccio secco.
2. Omogeneizzare tessuto utilizzando uno dei seguenti metodi come: mortaio e pestello macinazione eseguito a mano in ghiaccio secco dopo il congelamento del tessuto in azoto liquido; omogeneizzatore tessuto o un dispositivo meccanico di dissociazioneda suggerimento del produttore; sonicazione, o altro metodo preferito.
   Nota: Per l'analisi rappresentante, il metodo preferito di omogeneizzazione è sonicazione.
   1. Per l'analisi presentata nella figura 3, preparare tampone di lisi (fornito nel kit di isolamento di RNA) e 2-mercaptoetanolo ad un rapporto di 20 microlitri 2-mercaptoetanolo per ogni 1 ml di tampone di lisi. Tessuto risospendere in 300 microlitri tampone di lisi completato con 2-mercaptoetanolo per ogni 30 g di tessuto e ultrasuoni per 10 sec con sonicatore fissata al 30% di ampiezza.
   2. Se si usa mortaio e pestello, il tessuto terra risospendere in tampone di lisi 300 ml dopo la rettifica.
3. Aggiungere 10 ml proteinasi K a 590 microlitri tampone TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Aggiungere 600 microlitri soluzione proteinasi K per ogni 300 ml (ossia per ogni 30 mg) di tessuto. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   Nota: il tempo di digestione può variare.
4. Centrifugare i campioni a ≥13000 g per 10 minuti per rimuovere i detriti.
5. Trasferire il surnatante di nuovi tubi.
6. Aggiungere 450 microlitri di etanolo (96% -100%) per ogni 900 ml di surnatante di precipitare l'RNA.
7. Trasferire 700 microlitri della miscela lisato / etanolo alla colonna.
8. Centrifugare i campioni a ≥13,000 g per 1 minuto per legare l'RNA alla colonna.
9. Smaltire i rifiuti liquidi e aggiungere restante surnatante in colonna e far girare di nuovo.
10. Una volta che tutto il lisato viene centrifugato attraverso la colonna, aggiungere 350 ml di tampone di lavaggio 1 alla parte superiore dei campioni colonna e centrifugare a ≥13,000 g per 30 sec.
11. Eliminare il liquido dalla colonna e sostituire parte superiore.
12. Preparare DNase mescolando 5 unità di DNasi I dell'enzima con 5 ml di 10x DNasi e 40 ml di DNasi / RNasi acqua libera per campione (volume totale di 50 microlitri / campione).
13. Aggiungere 50 ml di DNasi mescolano a ogni colonna e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
14. Aggiungere 350 ml di tampone di lavaggio da 1 a colonna e centrifugare samples a ≥13,000 g per 30 sec.
15. Eliminare il liquido dalla colonna e sostituire parte superiore.
16. Aggiungere 600 ml di tampone di lavaggio 2 alla colonna e spin 30 sec a ≥13,000 g.
17. Eliminare il liquido dalla colonna e sostituire parte superiore.
18. Aggiungere 250 ml di tampone di lavaggio 2 e centrifugare per 2 min a ≥13,000 g.
19. Mettete parte di colonna in nuovo tubo di raccolta ed eliminare vecchio tubo di raccolta.
20. Aggiungere 50-100 ml di RNasi / DNasi acqua libera alla colonna e incubare per 1 min.
21. Spin per 1 min a ≥13,000 g.
22. Eseguire nuovamente eluato raccolte attraverso colonna per aumentare la resa di RNA.
23. Per l'uso immediato, mantenere i campioni sul ghiaccio e procedere alla quantificazione. Per un uso successivo, scatto congelamento ghiaccio secco o azoto liquido. Conservare a -80 ° C freezer fino al momento.

3. First Strand Synthesis

Nota: Per l'analisi rappresentante, la trascrittasi inversa (RT) è stata eseguita una reazione Fkit di sintesi irst Strand cDNA progettato per QRT-PCR (vedi Lista dei materiali).

1. Se i campioni sono stati raccolti in precedenza, scongelare i tubi su ghiaccio.
2. Misurare la quantità di RNA utilizzando uno spettrofotometro.
3. Utilizzando 0,5-2 mg di RNA totale, eseguire prima sintesi filone utilizzando trascrittasi inversa per generare cDNA magazzino.
   1. In sterili, tubi RNasi / PCR-free DNasi / piastre, preparare la miscela di reazione (Tabella 1). Mescolare delicatamente e centrifugare. Programmare una macchina di PCR standard (Tabella 2).
4. Diluire reazione finito al volume desiderato (generalmente 50-100 ml) con acqua priva di nucleasi sterile.

4. Real-time PCR

Nota: Per l'analisi rappresentante, è stato utilizzato SYBR green. Tuttavia, qualsiasi metodo preferito può essere sostituito a discrezione dell'utente.

1. Usando un cDNA controllo positivo, impostare una curva standard per ogni set di primer.
   1. Per l'analisi illustrato in Figura 3, preparare la curva standard per HER2 umano con il produttore raccomandato cDNA controllo positivo (vedi Lista dei materiali). Per il mouse GAPDH, utilizzare il negativo cDNA di controllo del polmone per generare una curva standard. Per ciascuna sonda, in serie diluire il cDNA 1: 4 per generare 5 standard.
2. Calcolare il numero di campioni totali, che dovrebbe includere la curva standard e campioni sperimentali.
   Nota: Per l'analisi qui descritta, 2-3 repliche sperimentali per campione sono stati analizzati. Analisi della curva standard è stata eseguita per generare un modello di regressione lineare semplice che può essere applicato per determinare la quantità relativa di HER2 e GAPDH per campione calcolare quantità normalizzata finale. Questa analisi inoltre garantire che l'efficienza primer è adeguata per l'analisi a mano.
3. In una, RNasi / tubo-free DNasi sterili, preparare master mix (Tabella 3).
   1. Calcola Master Mix Amount per campione. Scala per più di un campione. Utilizzare un master mix per ogni gene sperimentale di interesse, così come un controllo interno, come GAPDH. Utilizzare primers per GAPDH ad una concentrazione finale di 200 nM.
      Nota: Il controllo interno è particolarmente utile quando si cerca di distinguere tra l'origine delle cellule umane e mouse.
      Nota: concentrazione Primer per HER2 è stata ottimizzata e determinato dal produttore.
4. Preparare piastra di prova contenente 1 cDNAs microlitri corrispondenti a ciascun campione standard o sperimentale. Allocare almeno 1 cDNA campione / bene per ogni sonda primer. Aggiungere 19 ml di Master Mix per pozzetto per ogni sonda primer.
   Nota: Per i dati rappresentativi della figura 3, i campioni di cDNA sono stati analizzati in duplicato per ciascuna sonda primer e graficamente come media dei due campioni.
5. Reazione Esegui in macchina QRT-PCR utilizzando consigliato o precedentemente testato protocollo PCR. Vedere la Tabella 4 per il protocollo PCR utilizzato per i dati rappresentativi in Figura 3 e Figura 4.

Risultati

Al di là del tempo necessario per eseguire l'inoculazione iniziale di cellule tumorali in animali sperimentali e se si esegue, in analisi primaria del tumore in vivo, la raccolta dei tessuti, isolamento dell'RNA, e l'analisi RT-PCR è una procedura 1-2 giorni (figura 1) .

Un esempio di analisi lordo è l'imaging bioluminescente valutare cellule tumorali nel tessuto polmonare. Qui, un esperiment...

Discussione

Questo protocollo descrive l'uso di QRT-PCR per valutare mammaria le metastasi delle cellule tumorali al polmone utilizzando un modello murino di xenotrapianto. Si riconosce che altre tecniche, tra cui l'imaging bioluminescente, sono disponibili e sono anche efficaci per la rilevazione di metastasi pur avendo i propri valori e limiti. I dati presentati indicano che QRT-PCR fornisce una misura efficace di rilevamento dell'mRNA derivate da tumore all'interno di tessuto polmonare per la quantificazione dell...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-mercaptoetanolo	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
Kit di isolamento dell'RNA GeneJet	Thermo Scientific	K0732
iScript Supermix a trascrizione inversa per QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, umano	Bio-Rad	100-25636
Modello PrimePCR per il test verde SYBR: ERBB2, umano	Bio-Rad	100-25716
gapdh Sequenza			di primer per-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG